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RHL 基因对粳稻的转化及转基因植株的耐盐性.pdf

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上传者: 柴家巷 2010-05-14 评分 3 0 20 3 90 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《RHL 基因对粳稻的转化及转基因植株的耐盐性pdf》,可适用于人文社科领域,主题内容包含简报第卷第期年月wwwscichinacomRHL基因对粳稻的转化及转基因植株的耐盐性李荣田张忠明张启发(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武符等。

简报第卷第期年月wwwscichinacomRHL基因对粳稻的转化及转基因植株的耐盐性李荣田张忠明张启发(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉Email:rongtianlinet)摘要通过农杆菌介导法把水稻类HAL基因(RHL)导入粳稻品种合江根据GUS检测RHL基因PCR检测和生长正常原则选择R代单株R代株系中经抗潮霉素筛选后的阳性植株在苗期耐盐性有所改善,在孕穗期盐胁迫时细胞膜损伤小叶组织活力强耐盐性增强对R代株系进行Southern杂交分析的结果证明,RHL基因表达框架已完整地整合进了水稻基因组中此外,对转基因育种方法和真正耐盐转基因水稻品种的培育等问题进行了探讨关键词粳稻RHL基因转化耐盐性培育耐盐品种是当前作物育种研究的热点,然而传统育种方法很难选育出真正的耐盐品种近年来,PCSFA,HVA,AKT,HAL及HAL等多个与耐盐相关的基因的成功克隆和植物基因转化技术的日臻完善,为培育高效耐盐植物带来一丝曙光Gläser等人从酵母基因组文库中分离的HAL基因编码一个阳离子敏感型的核苷酸酶,该酶在硫同化,和RNA加工中能发挥其功能HAL基因高表达酵母的耐Li和Na胁迫能力增强转HAL基因番茄的耐盐性也有所改善Peng等人利用同源序列法从水稻cDNA文库中分离了类HAL基因(RHL),RHL蛋白和HAL蛋白具有相似的结构功能和特性,而且转RHL基因酵母的耐盐性较强这表明,RHL基因似乎可以被用于改良植物的耐盐性水稻(OryzasativaL)是世界上最重要的粮食作物之一,在盐碱地区的资源利用上具有特殊意义本工作成功地将RHL基因表达框架导入粳稻,并对转基因植株的耐盐性进行了研究材料与方法()材料粳稻(OryzasativaLsspjaponica)品种合江由东北农业大学农学院提供根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA和双元表达质粒pCAMBIA为本实验室保存RHL基因及质粒pBGH由美国俄亥俄州立大学分子遗传学及生物技术中心Verma教授惠赠RHL基因大小为bp,与S启动子胭脂碱合成酶终止子构成表达框架()植物表达载体的构建和农杆菌的转化用EcoR将RHL基因表达框架从质粒pBGH中切出后,插到pCAMBIA多克隆位点中,得到RHL基因的植物表达载体pRHL(图)利用电转化法图pCAMBIA(a)和pRHL(b)的TDNA区MCS示多克隆位点,BR示TDNA区的右边界,BL示TDNA区的左边界,gusA示b葡糖醛酸糖苷酶基因,HPT示潮霉素磷酸转移酶基因,S示S启动子,Tnos示胭脂碱合成酶终止子,TS示S终止子万方数据第卷第期年月简报wwwscichinacom把双元表达质粒分别导入农杆菌EHA()水稻转化对照(CK)为水稻成熟种子胚盾片的愈伤组织直接再生成的植株对照(CK)为用农杆菌EHA(pCAMBIA)转化成熟种子胚盾片的愈伤组织获得的转化株转基因水稻为用EHA(pRHL)转化水稻得到的转化株转化程序按Hiei等人和刘巧泉等人的水稻转化方法略加修改进行()R代植株的GUS分析和PCR检测GUS检测按文献进行用以CTAB法提取的对照和转基因水稻植株总DNA作为模板根据RHLcDNA序列,设计合成个PCR扩增引物(GGCAACACTGGGTGCTAGAT和CAGACCTCCAGCTTCTGTCAC),从RHL基因第到位间扩增出bp片段PCR反应体系为:ng模板DNA,mLPCR缓冲液(),mLMgCl(mmolL),mL端引物(mmolL),mL端引物(mmolL),mLdNTP(mmolL),mLTaq酶(UmL),加ddHO至mLPCR扩增条件为,min,,min,,min,共个循环对R代的选择,CK为正常单株,CK为生长正常和GUS阳性单株,转基因水稻为生长正常GUS阳性和PCR阳性单株()R代株系抗潮霉素筛选和耐盐性鉴定对照和转基因水稻R代种子以株系为单位去壳表面消毒CK接种到MS培养基上,CK和转基因水稻接种到含mgL潮霉素的MS培养基上,持续光照,筛选抗潮霉素植株幼苗高~cm时剪去CK,CK和转基因水稻抗潮霉素幼苗的根系,在含NaCl(mmolL)MS培养基上生根生长,鉴定苗期耐盐性选对照和苗期耐盐的转基因水稻株系幼苗进行孕穗期耐盐性鉴定在装有定量中性黏土的每个盒子(长cm宽cm深cm)中移植株水稻幼苗,每个株系设个盐胁迫处理,每个处理株:)无胁迫,持续灌水)中度盐胁迫,孕穗期灌NaCl溶液,保持盒内cm水层溶液电导率dSm)重度盐胁迫,孕穗期NaCl溶液灌溉,维持盒内cm水层溶液电导率dSm()R代株系叶片相对电导率和叶组织活力测定孕穗期盐胁迫d,测定对照和较耐盐的转基因水稻株系的叶片相对电导率和叶组织活力叶片相对电导率测定根据文献稍加修改进行,叶组织活力测定按Lutts等人的方法进行()R代株系Southern杂交取mg水稻总DNA用EcoR酶解,琼脂糖凝胶电泳分离后转移到HybondN尼龙膜上,以PdCTP标记的RHLcDNA为探针杂交结果水稻的转化和R代单株选择CK,再生株幼苗,均生长正常并收获到种子CK,获得个独立抗性愈伤克隆的株生长正常的幼苗,其中株为GUS阳性植株,株收获到种子转基因水稻,再生成活了个独立抗性愈伤克隆的株生长正常的幼苗,其中GUS阳性株株PCR检测结果显示,对照均未出现bp的特异扩增带,而有的转化植株有特异带出现(图),表明所用引物反应体系和扩增条件的PCR检测是能够将转RHL基因阳性植株和阴性植株区分开的在株转化再生植株中有株PCR阳性植株,GUS阳性和PCR阳性的双阳性植株有株选择双阳性植株,从大部分入选单株上收获到种子图转基因水稻再生植株PCR检测示kbLadderMarker,~示转化株,示CK,示CKR代株系抗潮霉素筛选和耐盐性鉴定对个转基因独立株系和个CK株系进行抗潮霉素筛选,部分结果列于表由表可见,大多数株系HPT基因是以个位点形式表达的,少部分是以个位点形式表达的,还有部分株系不符合孟德尔分离比率在含NaCl的MS培养基上,大部分转基因株系幼苗的根比对照多白长,并且苗也高(图)万方数据简报第卷第期年月wwwscichinacom表R代株系的抗感潮霉素反应潮霉素反应潮霉素反应植株数植株数R株系抗性感性估测位点数c检验R株系抗性感性估测位点数c检验RRRRRRRRRRRRR~RRRRRRRRRR~RRRRCK图苗期盐胁迫d后的转基因水稻左为转基因植株(R),右为CK这说明RHL基因具有增强水稻苗期耐盐性的功能选择个苗期较耐盐的转基因株系进行孕穗期耐盐性鉴定孕穗期无盐胁迫时,转基因水稻和对照相比较,生长发育情况未见明显差异孕穗期开始进行盐胁迫处理,各株系均出现盐害症状,但转基因株系和对照相比较,盐害症状出现迟程度轻重度盐胁迫d后,对照已枯萎死亡,转基因株系尚存少量绿叶,并有稻穗抽出(图(a))中度盐胁迫d,对照的绿叶数量要少于转基因株系,株高也低(图(b))这表明RHL基因可提高水稻孕穗开花期的耐盐性选择个较耐盐的转基因株系,进行进一步分析这个株系分别为R(重新命名为,余同),R(),图孕穗期重度盐胁迫(a)和中度盐胁迫(b)d后转基因水稻为CK,为转基因植株(R),为CK万方数据第卷第期年月简报wwwscichinacomR(),R(),R(),R(),R(),R()和R()R代株系叶片相对电导率和叶组织活力由叶片相对电导率结果可知,无盐胁迫时,转基因株系平均叶片相对电导率是对照的,转基因株系和对照无明显差异,而中度和重度盐胁迫时,转基因株系平均叶片相对电导率分别比对照低和(图)这说明盐胁迫时转基因水稻细胞膜损伤较小图转基因株系叶片相对电导率在无盐胁迫时,转基因株系平均叶组织活力是对照的,两者差异不大中度和重度盐胁迫时,转基因株系平均叶组织活力分别是对照的和,转基因株系较高,对照较低(图)这表明,RHL基因具有增强叶组织耐盐能力的功能图转基因株系叶组织活力分析R代株系Southern分析Southern杂交结果显示,对照和转基因株系在分子量比RHL基因表达框架较大的位置均出现了一个杂交信号,说明水稻合江品种中存在RHL基因的同源序列个转基因株系DNA经EcoR酶切后,均在RHL基因表达框架位置出现杂交带(图),说明RHL基因表达框架已完整地整合进了植物基因组中图转基因株系的Southern杂交分析示pRHLEcoR(RHL基因表达框架),~示转基因株系~,示CK,示CK讨论细胞吸收SO以后,经过活化还原后合成半胱氨酸和甲硫氨酸在SO同化过程中产生的某些中间产物,如SO,磷酸腺苷磷酰硫酸(PAPS),磷酸腺苷磷酸(PAP)和硫醚等,在细胞中积累超过一定水平会对细胞产生毒害作用细胞膜上NaSO协同运输系统的存在使盐胁迫时细胞吸收SO数量增加再加上盐胁迫时细胞膜损伤生长缓慢代谢缓慢,硫同化过程中的中间产物可能积累到对细胞有害的水平RHLcDNA表达一个ku蛋白,可能是(),二磷酸核苷()磷酸脱氢酶,该酶反应底物为PAPS和APS在盐胁迫时,RHLcDNA编码蛋白的超量生产有效地控制了SO激活和还原过程中产生的中间产物浓度,使其不至于产生毒害本研究中转RHL基因水稻在盐胁迫时叶组织活力比对照强,细胞膜损伤小,说明RHL基因在植物中具有耐盐效果水稻的苗期和抽穗开花期是两个对盐较敏感的时期本文转RHL基因水稻在苗期和孕穗期的耐盐性均有所增强,但在含盐mmolL培养基上其幼苗生长仍受到严重抑制,孕穗期NaCl溶液灌溉时不能结实,离真正耐盐品种尚有相当距离水稻固有RHL基因的表达不受盐胁迫诱导水稻中RHL蛋白数量增加有赖于外源基因导入RHL蛋白万方数据简报第卷第期年月wwwscichinacom活性受Na抑制,可被K激活盐胁迫时细胞内的Na增加是不可避免的,转RHL基因水稻RHL蛋白数量增多的同时其活性也会降低从拟南芥中克隆的AKT基因和从酵母中克隆的HAL基因均可增加盐胁迫时细胞吸收K的能力如果将RHL基因和AKT基因或HAL基因聚合,并在水稻中表达,则RHL蛋白数量大活性强,可有效清除某些有毒硫化物,再加上较低的NaK比率,这样的转基因水稻似有可能具有明显的耐盐性传统育种是通过对表现型选择而选择基因型的,而关于直接基因证据和从基因到表型性状的过程却知之甚少,选择准确性受环境影响较大现代育种要求转基因植物应包括物理证据(Southern杂交Northern杂交Western杂交和酶活分析等)表型证据和遗传证据本研究首先选择耐盐表现型,然后利用现代生物技术验证其基因的存在,结合了传统育种和现代转基因育种的优点,可在较大群体中准确选择需要的基因型这种方法似乎可以在育种实践中加以推广应用致谢本工作为中国博士后科学基金资助项目参考文献AshrafMBreedingforsalinitytoleranceinplantsCriRevPlantSci,,:~ZhangCS,LuQ,VermaDPSRemovaloffeedbackinhibitionofDpyrrolinecarboxylatesynthetase,abifunctionalenzymecatalyzingthefirsttwostepsofprolinebiosynthesisinplantsJBiolChem,,:~HongB,UknessSJ,HoTHDCloningandcharacterizationofacDNAencodingamRNArapidlyinducedbyABAinbarleyaleuronelayersPlantMolBiol,,:~SentenaeH,BonneaudN,MinetM,etalCloningandexpressioninyeastofaplantpotassiumiontransportsystemScience,,:~GaxiolaR,deLarrinoaIF,VillalbaJM,etalAnovelandconservedsaltinducedproteinisanimportantdeterminantofsalttoleranceinyeastEMBOJ,,():~GläserHU,ThomasD,GaxialaR,etalSalttoleranceandmethioninebiosynthesisinSaccharomycescerevisideinvolveaputativephosphatasegeneEMBOJ,():~MurguíaJR,BellésJM,SerranoRAsaltsensitive(),bisophosphatenucleotidaseinvolvedinsulfateactivationScience,,:~MurguíaJR,BellésJM,SerranoRTheyeastHALnucleotidaseisaninvivotargetofsalttoxityJBiolChem,,:~DichttB,StevensA,TollerveyDLithiumtoxicityinyeastisduetotheinhibitionofRNAprocessingenzymeEMBOJ,,:~ArrillagaI,GilMascarellR,GisbertC,etalExpressionoftheyeastHALgeneintomatoincreasestheinvitrosalttoleranceoftransgenicprogeniesPlantSci,,:~PengZL,VermasDPSAriceHALlikegeneencodesaCasensitive(),diphosphonucleoside()phosphohydrolaseandcomplementsyeastmetandEscherichiacolicysQmutationsJBiolChem,,():~HieiY,OhtaS,KomariT,etalEfficienttransformationofrice(OryzasativaL)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheTDNAPlantJ,,():~刘巧泉,张景六,王宗阳,等根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立植物生理学报,,():~MurrayMG,ThompsonWFRapidisolationofhighmolecularweightplantDNANuclAcidsRes,,:~MurashigeT,SkoogFArevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissueculturePhysiolPlant,,:~谭常,杨惠东,余叔文植物生理学实验手册上海:上海科学技术出版社,~LuttsS,BouharmontJ,KinetJMPhysiologicalcharacterizationofsaltresistantrice(Oryzasativa)somaclonesAustJBot,,:~PearsonGA,AyersADRiceasacropforsaltaffectedsoilsinprocessofreclamationUSDAProdResRep,,:PotrykusIGenetransfertoplants:assessmentofpublishedapproachesandresultsAnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol,,:~(收稿,收修改稿)万方数据

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