制备型高效液相色谱法及其在中药研究中的应用

中医药通报 　2006年 6月 　第 5卷 　第 3期 60　　　 Traditional Chinese Medicine Journal 制备型高效液相色谱法及其在 中药研究中的应用 □王永禄 1 　王丽瑶 2 (1. 南京工业大学 　江苏 　南京 　210009　2. 中国药科大学 　江苏 　南京 　210009) 　　摘 　要 　本文介绍了制备型高效液相色谱法的研究概况 , 制备型高效液相色谱的特点 , 影响制备 型高效液相色谱分离纯化的因素 , 及其在中药研究中的实际应用 , 并对制备型高效液相色谱的研究现 状与发展方向做了 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 。 　　关键词 　制备型高效液相色谱法 　制备型 HPLC　中药 　　高效液相色谱法 ( high performance liquid chroma2 tography, HPLC) 是上世纪 60年代诞生的一种高效 分离纯化技术。至今 , HPLC已成为中药研究领域最 重要和最有效的分离 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 方法之一。HPLC按操作方 式和目的可分为分析型和制备型两类。分析型高效液 相色谱的目的是为了获得反映样品组成的信息 , 制备 型高效液相色谱 ( p reparative high performance liquid chromatography, PHPLC) 目的是为了按一定的纯度要 求 , 获得所需产品。近十几年来 , 随着人们对分离与 纯化技术的不断探索 , 色谱分离技术得到了迅速发 展 , 制备高效液相色谱法已成为当代高效分离与纯化 技术的研究前沿 , 用于制备高纯度生物活性物质 [ 1 ]。 本文将就高效制备型液相色谱的原理及其在中药中的 应用作一综述。 1　制备型高效液相色谱概述 111　制备型 HPLC与分析型 HPLC 区别 　制备型 HPLC是在传统的分析型 HPLC的基础上发展起来的一种高效分离纯化技术 , 但制备色谱不是分析色谱的简单放大 , 它与分析色谱有许多不同之处。分析色谱需要全面反映样品组成的信息 , 不需要收集特定的馏分 , 洗脱液通常废弃 ; 而制备色谱中 , 目标产物的纯度、产量、生产周期、运行成本等成为主要的考虑因素 , 因此制备色谱与分析色谱在操作参数的优化上有很大不同。两者的比较可详见表 1所示。112　制备型 HPLC分类 　制备高效液相色谱根据待分离样品的负载量可分为两类 , 一类为研究开发型 ,另一类为工业生产型。研究开发型高效液相制备色谱属于实验室规模的制备分离 , 样品量为微克级至克级 , 分离的样品一般供生物活性测试、结构鉴定以及作为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品等。这类色谱中经济效益并不是首要考虑的因素 , 对仪器装置要求不高 , 任何达到预期分离目标的仪器均可使用。对于工业生产型制备高效液相色谱 , 经济效益是其整个纯化过程考虑的核心因素 , 纯 中医药通报 ·中药化学 　 Traditional Chinese Medicine Journal 61　　　 化样品量为千克至吨级。这两类制备色谱的在其柱设 计上也有很大不同 , 实验规模制备分离所用色谱柱的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 、填充及操作与常用分析柱基本相同 , 其内径一 般为 10～50mm , 但大规模生产所用制备柱的内径通 常大于 50mm, 为了得到高效柱 , 其柱型及结构与前 者不同 , 对填料及其填充技术要求也更高 [ 2 ]。 表 1　制备型 HPLC与分析型 HPLC区别 分析型 HPLC 制备型 HPLC　　　　　　 目的 　　　获得样品的定量定性信息 分离、富集或纯化样品成分 样品量 　　 < 015mg 半制备型 HPLC: ≤100mg; 制备型 HPLC: 011 - 100g; 工业生产型 HPLC≥011kg 进样模式 　批操作 批操作连续操作 上样量 　　尽可能小 , 基本范围 : 10 - 10 - 10 - 3 尽可能大 , 基本范围 : 01001 - 011样品 /柱填料 ( g/g) 　　　　　样品 /柱填料 ( g/g) 流速 　　　110m l/m in > 10m l/m in 理论基础 　线性色谱 非线性色谱 113　影响制备型 HPLC分离纯化的因素 　在对制备 型 HPLC分离纯化过程进行优化时 , 影响因素有很 多 , 包括色谱柱的柱径、柱长、填料尺寸、上样量以 及流动相的组成、流速等各种因素。 11311　柱尺寸 　现代高效制备液相色谱柱具有柱短、 内径大、呈圆饼状 (pancake) 的特征。目前高效制 备柱的柱长与常规分析柱相仿 , 一般为 20～50cm, 远短于传统柱长 lm甚至 lm以上的制备柱 , 而内径为 10～1000mm, 因此可以在较大的流速下不致产生很 高的柱压降 , 从而获得较高的产率 [ 2 ]。王志祥等 [ 3 ]考 察了柱尺寸对柱效和分离度的影响 , 认为增加柱长虽 然可以提高制备分离效果 , 但柱长的增加将显著提高 柱前压。因此 , 在制备型 HPLC分离过程中 , 为了提 高分离效率 , 可以采用增加柱长的办法。但在满足分 离度的前提下 , 应尽量使用较短的制备柱。为了提高 制备量 , 可以使用内径较大的制备柱 , 但随着色谱柱 内径的增加 , 会产生柱放大效应 , 使得柱效降低 , 导 致总分离效果下降。因此 , 在制备型 HPLC分离过程 中 , 在满足分离度要求的前提下 , 可以采用增加制备 柱内径的方法提高制备量。 11312　高效制备填料 　一般来说 , 分析 HPLC中的 填料可考虑用于制备 HPLC中 , 但制备色谱由于填料 使用量大 , 故对填料尤其是用于大规模工业化色谱中 的填料有其特殊的要求。高效制备填料一般具有机械 强度高 , 负载量高 , 粒度分布范围窄 , 填料各批量之 间重现性好等特点。通常制备型 HPLC每米的塔板数 在 20000以上 , 有的甚至可达到与分析柱相仿的柱 效 [ 2, 4 ]。王志祥等 [ 5 ]考察了填料尺寸对柱效和分离度 的影响 , 认为采用小粒径的色谱填料可以明显提高柱 效和分离度 , 但填料粒径越小 , 柱压降越大 , 受到泵 能力的制约。因此 , 在制备分离过程中 , 对于难分离 物系 , 可以采用较小粒径的色谱填料 , 以提高分离效 率。但在满足分离要求的前提下 , 使用较大粒径的色 谱填料 , 可以获得较大的生产能力 , 而且填料价格相 对便宜 , 因而更为有利。 11313　装柱技术 　传统的装柱法有干法和匀浆法。 上世纪 70年代 , 人们开始尝试动态压缩装柱法 , 主 要有轴向压缩法、径向压缩法和环向压缩法。其中动 态轴向压缩法 ( dynam ic axial comp ression, DAC) 填 装的色谱柱柱床均匀、性能稳定、柱效高。目前 , DAC柱己基本上主宰了整个制备型色谱柱市场 , 柱径 己从 25mm发展到 116m [ 6, 7 ]。 11314　柱型 　制备高效色谱柱按柱型可分为锥型柱 与圆柱型柱两大类。马继平等 [ 8 ]研究了不同色谱柱柱 型对柱效的影响。将锥型柱同有相同长度、相同容积 的圆柱型柱的柱效、样品容量及峰高进行比较 , 结果 表明 : 锥型柱优于圆柱型柱 , 锥型柱的样品容量约为 圆柱型柱的 2倍 , 柱效比圆柱型柱高 36% , 色谱流出 曲线峰值高于圆柱型柱 12%。 11315　上样量 　制备型 HPLC为了提高柱产量 , 一 中医药通报 　2006年 6月 　第 5卷 　第 3期 62　　　 Traditional Chinese Medicine Journal 般需采用柱超载方式进行操作。提高处理量可以采用 两种操作方式 : 一种是使用小的注入体积 , 但增加样 品浓度 , 即所谓的 “质量超载 ”。另一种是保持较小 的样品浓度 , 但增加样品体积 , 即所谓的 “体积超 载 ”。王志祥等 [ 9 ]认为在满足分离要求的前提下 , 可 以采用柱超载方式操作 , 以提高制备量。当一次操作 所要处理的样品量较小时 , 采用质量超载方式更为有 利。当一次操作所要处理的样品量较大时 , 采用体积 超载方式更为有利。 11316　流动相的流速 　现代高效制备液相色谱法具 有流动相流速高的特点。流动相的线速一般在 5～ l0cm /m in, 以便提高产率 , 降低生产成本 [ 2 ]。 除上述因素外 , 柱头设计、样品粘度、流体摩擦 热等因素都会对柱效有所影响 [ 10 ]。 2　制备高效液相色谱在中药研究中的 应用 目前 , 制备型 HPLC在中药研究中的应用主要体 现在标准品的制备与样品的分离纯化方面。 211　用于标准品的制备 　茶氨酸是影响茶叶品质的 重要组成部分 , 约占茶叶中游离氨基酸的 40%以上 , 占茶叶干重的 1～2%。药理学研究表明茶氨酸能拮抗 咖啡碱引起的神经系统兴奋 , 同时具有降压作用。随 着茶氨酸的保健功效逐渐为人们所认识 , 对茶氨酸的 需求量不断上升。目前 , 仅日本有少量的茶氨酸对照 品 , 且价格较贵 , 限制了对其进一步的研究与应用。 肖伟涛等 [ 11 ]采用制备高效液相色谱技术分离纯化茶 氨酸对照品 , 纯度达到 98%以上 , 制备收率大于 60%。方法简便 , 生产周期短、费用低 , 茶氨酸产品 可用作分析方法的对照品。 苯乙醇苷类化合物为传统补益中药肉从蓉的有效 成分 , 该类化合物有明显提高记忆功能、抗衰老、助 阳等作用。松果菊苷是肉从蓉中含量较高的一种苯乙 醇苷类化合物 , 在以管花肉从蓉 [ Cistanche tubulosa ( Schenk) R. W ight ] 为原料制成的国家级二类新药 ———苯乙醇总苷中其质量分数高达 48%。但目前国内 外还未见有松果菊苷标准品出售。雷厉等 [ 12 ]利用反 相制备高效液相色谱法从管花肉从蓉的乙醇提取物中 纯化制备了松果菊苷的标准品 , 纯度达到 98%以上。 该方法操作简便 , 重现性好 , 可用于松果菊苷及其它 苯乙醇苷类化合物的大量制备。 罗汉果甜苷 Ⅴ (mogroside V) 我国传统出口商品 罗汉果中的主要甜味成分 , 具有甜度高、热量低、水 溶性好等优点。药理研究表明 , 罗汉果甜苷 Ⅴ具有镇 咳、祛痰以及增强免疫等功效 [ 13 ]。但目前市场上还 没有罗汉果甜苷 V的标准品出售。余丽娟等 [ 14 ]利用 半制备高效液相色谱法得到罗汉果甜苷 V标准品 , 纯 度达 9815%。方法具有操作简便、重现性好、产品纯 度高等优点。为研究 mogroside V单体的活性及体内 药物学过程提供了方便 , 也为制备其他罗汉果三萜苷 类标准品提供了有益的参考。以甜苷 V作为罗汉果中 的含量测定的指标 , 对于确定罗汉果品质的好坏、指 导罗汉果的收购和罗汉果甜苷产品的生产具有重要意 义。 212　用于样品的分离纯化 　石衫碱甲 (Huperzine A ) 是一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂 , 对重症肌无力、 记忆力减退以及老年痴呆等症状有较好的疗效。石杉 碱甲已有的生产 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 是生药用溶剂提取、柱层析分 离、反复重结晶等工序 , 周期长 , 费用大。为此 , 杨 明等 [ 15 ]建立了用制备型 HPLC制备石衫碱甲的方法。 每次进样 3g石杉总生物碱 , 可以得到将近 180mg Hu2 perzine A , 纯度达到 > 90%的工艺要求 , 重复性良 好。与常规的分离方法比较 , HPLC法制备石杉碱甲 具有操作简单 , 重复性好 , 周期短 , 成本低廉等特 点。 绿原酸具有抗菌、抗病毒、利胆、增高白血球 及兴奋中枢神经系统等功效。国外多以咖啡豆和金 银花为原料提取绿原酸。有实验结果表明 , 杜仲叶 片中绿原酸的含量与金银花的相当 , 而且资源丰富 , 价格低廉。目前 , 国内外对杜仲中绿原酸高纯单体 的分离多采用硅胶或大孔吸附树脂反复柱层析或多 级萃取 , 再采用重结晶法得到少量纯品。彭密军 等 [ 16 ]采用制备高效液相色谱技术 , 从杜仲叶提取物 中分离纯化得到高纯活性成分绿原酸 , 绿原酸的纯 度达 98161%。同时 , 彭密军等人认为流速及洗脱 方式对绿原酸的分离情况有较大影响 , 提出并应用 了流动相速度梯度洗脱方法 , 该方法可以缩短分离 时间 , 保持较高的分辨率 , 同时还能降低试剂的用 中医药通报 ·中药化学 　 Traditional Chinese Medicine Journal 63　　　 量。此外 , 彭密军等 [ 17 ]还利用制备高效液相 - 台阶 梯度法分离纯化了杜仲中三种环烯醚萜化合物。结 果表明 , 产品纯度均可达到 95%以上 , 其中京尼平 苷酸的产率可高达 100189mg/h。 表没食子儿茶素没食子酸酯 ( EGCG) 是绿茶中 主要活性成分之一 , 具有抗血栓、抗衰老、抗癌等药 理功能 , 现已成为医药、食品领域研究的热点。目 前 , EGCG的提取技术目前主要还沿袭传统的有机溶 剂提取法 , 其工艺繁琐、周期长且提取效率低。Jung Il Kim等 [ 18 ]采用反相高效液相制备色谱法 , 从绿茶中 分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯 ( ep igallocate2 chin gallate, EGCG) , 并讨论了固定相颗粒度及流动 相流量对 EGCG分离纯化工作的影响。实验结果表 明 , 在粒径为 15μm 和 40 - 63μm时 EGCG可以得到 相对良好的分离 ; 但当粒径为 150μm时 , EGCG的纯 度由于受表儿茶素 ( ep icatechin, EC) 的影响而有所 下降。此外 , 随固定相粒径的增加 , 流动相流量也应 相应加大。如果制备具有抗氧化和抗癌活性的 EGCG 与 EC的混合物 , 可以采用 150μm粒径的填料。 3　结　语 制备型 HPLC是制备纯化天然产物的一种很有 效的手段 , 具有产品纯度高、产率高、分离速度快 等优点。然而 , 现有的理论结构还不够完善 , 应加 大其理论研究 , 尤其是对优化操作条件的系统研究 , 以进一步完善这项技术。制备型 HPLC未来的发展 趋势是开发大规模工业化过程 , 但由于对其升级放 大方面的研究还不成熟 , 限制了制备型 HPLC的工 业化发展。 相信随着制备型 HPLC理论的不断完善 , 中药现 代化的迅速发展 , 制备高效液相色谱法会在中药研究 中显示出广阔的应用前景。 参考文献 [ 1 ] Hostettmann K, Marston A, Hostettmann M. 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