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核酸分子杂交技术.ppt

核酸分子杂交技术

Sigma
2010-04-18 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《核酸分子杂交技术ppt》,可适用于人文社科领域

核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子杂交分子。第一节核酸杂交的基本理论一、变性与复性第一节核酸杂交的基本理论一、变性与复性DNA的变性(denaturation):DNA的变性(denaturation):在某些理化因素作用下DNA分子内碱基对之间的氢键断裂使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。解链温度(融解温度Tm)(meltingtemperature):解链温度(融解温度Tm)(meltingtemperature):使的DNA发生变性时的环境温度。DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。增色效应:DNA变性后对nm紫外光收增加的现象。DNA的复性(renaturation):DNA的复性(renaturation):在适当条件下变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性此过程称为退火(annealing)。减色效应:变性DNA复性后对nm紫外光吸收减少的现象。常用的变性方法:①热变性②酸碱变性③化学试剂变性影响复性的因素影响复性的因素①序列简单的分子复性快如poly(dT)和poly(dA)识别快②DNA片段愈大扩散速度愈低复性慢③离子强度↑→有利于复性④DNA浓度↑→复性↑Tm值的估算①<bpTm=(GC)(AT)②>bpTm=(GC)③Tm=℃lgM(GC)n×(甲酰胺)核酸杂交:不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列在一起复性时互补序列配对形成杂化分子。二、影响杂交的因素二、影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度温度:比Tm低℃~℃较适宜离子强度:离子强度↑→杂交反应率↑杂交液中的甲酰胺甲酰胺能降低核酸杂交的Tm含甲酰胺的杂交溶液温度能降低到℃。使用甲酰胺的优点:①低温下探针更稳定②能更好地保留非共价结合的核酸。注意:注意:①待测核酸顺序与探针顺序同源性高的杂交用水溶液时取℃用甲酰胺溶液时取℃。②待测核酸顺序与探针同源性不高时以甲酰胺溶液在℃杂交。核酸分子的复杂性直接影响复性几率。非特异性杂交反应:在杂交前将非特异性位点进行封闭以减少对探针的非特异性吸附作用。常用封闭物:①变性非特异DNA:鲑鱼精子DNA小牛胸腺DNA②高分子化合物:Denhardt溶液脱脂奶粉第二节核酸探针第二节核酸探针一、探针的选择原则高度的特异性制备探针的难易性和检测手段的灵敏法二、探针的种类基因组DNA探针基因组DNA探针从基因组DNA文库中选取某一基因片段↓与载体连接(质粒、噬菌体)↓克隆(PCR扩增)↓酶切优点:①无性繁殖、制备方法简单②不易降解(与RNA比较)③标记方法成熟。cDNA探针(complementaryDNA)cDNA探针(complementaryDNA)↓S核酸酶切平两端优点:不含内含子及高度重复序列但不易获得↓载体连接↓克隆通过逆转录↓双链cDNA加接头↓限制酶粘性末端RNA探针:检测DNA和mRNARNA探针:检测DNA和mRNA优点:杂交效率高稳定性高非特异性杂交较少,未杂交探针可用RNase降解减少本底的干扰。缺点:易降解标记方法复杂寡核苷酸探针优点:①可根据需要合成相应序列②探针短,序列复杂性低,分子量小因此杂交时间短③长度只有bp该识别序列内个碱基的变化可明显降低杂交Tm值。④可大量合成价格低能够用酶学或化学方法进行非放射性标记。三、探针设计原则:三、探针设计原则:①长度:~bp②碱基成分:GC含量为~③探针分子内无互补序列。④避免同一碱基重复出现。⑤一旦选定某一序列后尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较与非靶区域的同源性不应超过或有连续个或更多的碱基同源。四、探针标记物的选择四、探针标记物的选择理想的标记物:①具有高度的灵敏性②与探针结合后不影响杂交及探针的主要理化特性③检测方法高灵敏性、高特异性假阳性率低环境污染少价格低廉④若用酶促方法标记应对Km影响不大(一)常用的放射性标记物(一)常用的放射性标记物常用探记探针的同位素:P、H、S、C、I、I特性:①检测特异性强②灵敏度高③对酶促反应无任何影响也不影响碱基配对的特异性和稳定性④易造成放射性污染⑤半衰期短的同位素应用受到限制随用随标记立即使用不能长时间存放。探针标记的方法探针标记的方法①缺口平移法(nicktranslation)实质:用αPdNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸生成的两条链均被同位素标记。②随机引物法(randompriming)人工合成的~个核苷酸长的各种不同排列顺序的混合物它们可以随机地互补到DNA探针的某一处作为引物在Klenow片段作用下合成与探针DNA互补的DNA链当在反应液中加入αPdATP时即可形成放射性同位素标记的DNA探针但探针DNA序列是长短不等的。优点:比活度高结果稳定③用T多核苷酸激酶标记DNAˊ末端③用T多核苷酸激酶标记DNAˊ末端ˊpCpGpApCpGˊ碱性磷酸酶(AKP)ˊHOCpGpApCpGˊγPATPT噬菌体多核苷酸激酶(PNK)ˊPCpGpApCpGˊ④Klenow片段快速标记DNA探针末端④Klenow片段快速标记DNA探针末端用枯草杆菌蛋白酶切割可得两条多肽链NCˊ→ˊ外切酶ˊ→ˊ外切酶ˊ→ˊ聚合酶小片段()Klenow片段()′CTTAAG′′GAATTC′EcoRⅠ′GAATTC′′CTTAAG′Klenow,dNTP,αPdATPˊGAATTAATTCˊˊCTTAATTAAG(二)常用的非放射性标记(二)常用的非放射性标记优点:无环境污染可较长时间贮存方法:酶标记法化学标记法要求:标记物应具有耐热、对组织细胞无特异亲和性、分子量小对探针杂交无影响或影响甚小不影响DNA三维空间构象的形成。常用的标记物:生物素(biotin)、地高辛(digoxigenin)、光生物素(photobiotin)、补骨脂素、乙酰氨基芴(acetylominofluorene)生物素标记核酸探针BiolldUTP、BiodATP、BiodCTP、BiodUTP等。地高辛(Dig)标记核酸探针第三节核酸分子杂交技术第三节核酸分子杂交技术一、类型:根据反应环境分为固相杂交:将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上另一条核酸链游离在液体中。液相杂交:参与反应的两条核酸链都游离在液体中。二、固体支持物种类硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板等。选择原则:①具有较强的结合核酸的能力②与核酸的结合比较稳定③尽量少的非特异性吸附三、常用固相杂交类型Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。Southern印迹杂交主要步骤:纯化的待测DNA样品琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段凝胶上DNA变性中和DNA转印至NC膜预杂交限制性内切酶酶切后(EDTA℃灭活限制酶)变性液(碱变性)Tris缓冲液高盐下烘干、固定杂交放射自显影结果分析southern印迹载体凝胶吸水纸缓冲液滤纸固定到载体Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到NC膜上的方法。与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblotting。斑点杂交(dotblot)(线状圆形)原位杂交(insituhybridization)直接用探针与细胞或组织切片中的核酸杂交。应用:)观察基因在组织中的表达)确定基因在染色体中的定位菌落原位杂交(colonysituhybridization)将细菌从平板转移到NC膜上裂解细菌释出DNA烘干杂交四、核酸杂交的应用在医学研究与实践中核酸杂交主要用于基因诊断。、遗传病的诊断:例:β地中海性贫血的检验、病原体的鉴定:例:结合杆菌的快速鉴定、癌基因点突变分析、用于骨髓移植与器官移植时的组织配型及亲子鉴定蛋白杂交蛋白杂交一、蛋白质的免疫印迹(western)场所:硝酸纤维素膜待检分子:蛋白探针:抗体杂交的方式:经电泳分离不同的蛋白转印到硝酸纤维素膜上用特定的抗体与蛋白杂交检测特定的蛋白。二、所用抗体、一抗:针对待测分子的抗体、二抗:针对一抗的抗体标记有放射性同位素或生物素三、操作过程蛋白的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同的蛋白质蛋白印迹封闭阳极阴极多孔垫片滤纸凝胶载体杂交(一抗与特定蛋白结合)漂洗去除多余的一抗二抗与一抗结合漂洗去多余的二抗结果检测

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