动物源食品中苯二氮卓类残留分析方法研究进展

521※专题论述 食品科学 2007, Vol. 28, No. 08 收稿日期：2006-11-20 *通讯作者 作者简介：李秋生(1982-)，男，硕士研究生，研究方向为食品安全与质量控制。 动物源食品中苯二氮卓类残留分析方法 研究进展 李秋生，胥传来 * ，彭池方，金征宇 (江南大学食品学院，江苏 无锡 214036) 摘 要：目前，动物源食品中残留的药物对环境和公众的健康构成的潜在危害越来越受到重视。苯二氮卓类为国 家明令禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物之一。但为了追求经济效益，其非法使用相当的广泛。本文介绍了 动物源产品中苯二氮卓类残留的检测方法，包括色谱分析法和免疫分析法。 关键词：苯二氮卓类；色谱分析；免疫分析 Progress on Determination of Benzodiazepines in Animal Product Foods LI Qiu-sheng，XU Chuan-lai*，PENG Chi-fang，JIN Zheng-yu (School of Food Science and Technology, Southern Yangtze University, Wuxi 214036, China) Abstract ：Recently the occurrence of residues of veterinary medicines and other unauthorized drugs in foods of animal origin is an issue of popular concern around the world. The residues of pharmacological treatments on food-producing animals, exctreted in the manure dispersed on agricultural land, can have environmental impact and human health issues through toxic, genotoxic, and drug-resistance development implications. Benzodiazepines were prohibited in the process of breeding animals by explicit order, but it was used unscrupulously for the economic benefit. This paper introduced the determination techniques of benzo- diazepines residues in animal products including chromatographic analysis and immunologic analysis. Key words：benzodiazepines；chromatographic analysis；immunologic analysis 中图分类号：TS207.53 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)08-0521-04 苯二氮卓类(benzodiazepines)多为1,4-苯并二氮卓的 衍生物。临床常用的有 2 0 余种。虽然它们结构相似， 但不同衍生物之间，抗焦虑、镇静催眠、抗惊厥、肌 肉松弛和安定作用则各有侧重。本文主要讨论用于镇静 催眠的衍生物，包括地西泮(diazepam，安定)、氟西 泮(flurazepam, 氟安定)、氯氮卓(chlordiazepoxide)、奥 沙西泮(oxazepam)和三唑仑(triazolam)。 近几年来，有些饲料企业为了追求饲料的转化率和 高额利润，在饲料中随意添加镇静、催眠类违禁药物。 如在上海饲料办的专项检查中，经抽样检测，“睡大 壮”饲料产品中含有大量的安定。安定经肝脏代谢为 奥沙西泮，仍有生物活性，故连续应用可蓄积。虽未 见有食入含安定饲料饲养的动物食品中毒报道，但医学 界已证实畜禽产品中的激素及其它合成药物的滥用与及 残留往往与人类常见的疾病问题和某些食物中毒有关。 为此国家有关部门也下文将苯二氮卓类镇静催眠药明确 定为禁用药物之一。本文就苯二氮卓类的色谱和免疫分 析方法进行简要介绍。 目前对苯二氮卓类的检测主要使用薄层色谱扫描、 气相和液相色谱分析，这些方法不仅需要昂贵的仪器设 备，对检材的要求也比较高，需要进一步的提纯处理 才能进行。对于苯二氮卓类抗体的研究国外在二十世纪 八、九十年代有少数的报道，但国内外目前鲜有报道。 由于苯二氮卓类药物属于小分子物质，要想得到相应的 抗体，首先需将其与载体物质相连接，具有免疫原性， 才能够利用免疫学技术得到相应的抗体。 1 色谱分析方法 1.1 样本 保单样本pdf木马病毒样本下载上虞风机样本下载直线导轨样本下载电脑病毒样本下载 前处理 1.1.1 提取 目的是将样品中的痕量兽药从杂质(干扰物)中分离出 来。不同分析对象，有不尽相同的提取过程，如漂洗 法、振荡法、组织捣碎法、冷浸法、索氏提取法、 2007, Vol. 28, No. 08 食品科学 ※专题论述522 超声法、固相萃取法(SPE)和超临界萃取法(SFE)等。目 前应用较多的有振荡法、组织捣碎法和超声法，而固 相萃取法和超临界萃取法应用日趋广泛，它们具有快 速、简便、所需样品量少等特点。 1.1.2 净化 目的是样品提取富集后除去干扰物质。净化方法通 常有：液- 液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)、固相微 萃取法(SPME)、液相微萃取法(LPME)、薄层层析法、 化学方法(如磺化法)、冷冻法等。 目前，在生物样品的前处理过程中传统的LLE 仍普 遍采用。LLE 方法需根据药物的性质，在酸或碱性条件 下分别提取净化。萃取溶剂有氯仿、乙醚、乙酸丁酯 等或者不同溶剂的混合物。Carlsen S和 Hayes M等[1]用 含有1% 3-甲基-1-丁醇的正庚烷从人体血浆中提取一种 新的安定药，最后用乙醇溶解定容，进行 GC-MS 分析。 此方法的回收率在100% 左右，LOD 达到 0.1ng/ml。而 且样品基体不同，如其中的脂肪、蛋白质、糖份和水 分的含量不同，对药物的结合程度以及存在的干扰物质 也有所不同。 S P E 操作简便，可以净化很小体积的样品，溶剂 用量少，选择性高，速度快，可实现自动化，不会 发生乳化，净化中引入的杂质少。Borrey D 等[2]采用 Bond Elute Phenyl柱提取尿中的15种苯二氮卓类药物， 最后用甲醇洗脱并衍生化进行 G C - M S 测定，其中各类 药物提取率达 8 0 % 以上。 Hege Grefslie Ugland等[3]采用自制的LPME装置进 行人体血液和尿样中安定及其主要代谢产物N- 去甲基安 定的处理。为了减少蛋白质对药物束缚可加入甲醇；可 加入氯化钠和正己烷脱脂；如尿样中的安定较少，而代 谢物多以其结合物——葡萄糖醛酸酐的形式存在，可通 过使用葡萄糖醛酸酐酶使结合物水解，提高地西泮代谢 物的检出率。 1.1.3 衍生化 衍生化的最主要目的是为了提高兽药残留检测的灵 敏度和选择性。常用的衍生化方法有硅烷基化、甲基 化和乙酰化法[4]。对于苯二氮卓类镇静剂来说硅烷基化 衍生物不稳定，极易水解，不适用于常规分析。另外 当这些衍生物进 G C 柱时，过量的硅烷基化试剂会污染 柱子。烷基化有甲基化和丙基化，这些衍生物在几天 之内都很稳定，检测峰形也很好，但是衍生物需另加 一个额外的萃取步骤来降低 LOD。乙酰化方法通常在吡 啶中用乙酸酐作为衍生化试剂，在室温条件下进行。乙 酰化方法解决了硅烷化和烷基化方法所遇到的问题。而 且反应试剂易于氮吹干，减少了额外的萃取步骤，也 改善了峰形[2]。 1.2 气相色谱法(GC) 气相色谱法有许多高灵敏、通用性或专一性强的检 测器供选用，如氢焰离子化检测器(FID)、氮磷检测器 (NPD)等，检测限一般为μg/kg 级。该方法可应用于部 分苯二氮卓类药物的检测[5]，但是大多数兽药极性或沸 点偏高，需繁琐的衍生化步骤，限制了 G C 的应用。所 以，二十世纪八十年代后 HPLC 的发展速度超过 GC，相 当数量的兽药采用或改用 H P L C 进行分析，如氯霉素、 磺胺类药物等。 1.3 高效液相色谱法(HPLC) 几乎所有的化合物包括高极性 / 离子型待测物和大 分子物质均可用 HP L C 进行测定。HP L C 的分离机制与 常规柱色谱相同，但填料更加精细(Φ 5～10μm)，需高 压泵推动，柱效高(105 塔板 /m)，速度快，灵敏度与GC 相近。与 G C 相比，H P L C 流动相参与分离机制，其组 成、比例和 p H 值等灵活调节，如离子对色谱、胶束 色谱、手性分离色谱等，使许多极难分离的待测物得 以分析。目前大多数兽药残留分析都采用反相 H P L C 法。该法常用于苯二氮卓类物质的检测[6 ]。 1.4 高效薄层色谱(HPTLC) H P T L C 的出现使 TL C 进入了复兴时期，现已成为 仅次于 HPLC 和 GC 的残留分析方法。HPTL C 的斑点原 位扫描定量、定性和高效分离材料(Φ 3～10μm) 。改 变了常规 TLC 在灵敏度和重现性方面的不足，但保持了 T L C 的简便、快速和样品容量大的优点，可使用正相 或反相板，分辨率几乎与 H P L C 相当。H P T L C 在安定 残留的快速筛选性检测方面应用广泛[7]。 2 免疫分析方法 免疫分析技术(IAS)是以抗原与抗体的特异性、可 逆性结合反应为基础的分析技术，小分子量的兽药(M W 小于 2500)一般不具备免疫原性，不能刺激动物产生免 疫反应。将兽药小分子以半抗原的形式通过一定碳链长 度的连接分子与分子量大的载体(一般为蛋白质)以共价键 偶联制备人工抗原，以人工抗原免疫动物，使动物的 免疫系统发生应答反应，产生对该兽药具有特异性的活 性物质(免疫球蛋白或称抗体)来识别该兽药分子并与之 结合。这种结合反应不仅可在体内进行，也能在体外 进行，符合质量作用定律，这就是免疫分析的基础。 2.1 载体的选择 半抗原必须与载体相连，才具有免疫原性，通常 采用的载体有物理吸附剂和生物大分子。物理吸附剂有 聚乙烯砒咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素、葡聚糖硫酸钠 等，是通过电荷和微孔来吸附半抗原，但采用这种方 法容易受物理吸附剂颗粒大小和溶剂 p H 值的影响，半 抗原容易脱失。生物大分子则是通过不同功能基团间的 化学键将半抗原分子连接在载体上，一般使用比较容易 523※专题论述 食品科学 2007, Vol. 28, No. 08 得到的血清蛋白(如 BSA)和卵清蛋白(如 OVA)，也有人 采用人工合成的多聚赖氨酸和琥珀酸多聚赖氨酸[8]。 低分子的半抗原有糖类、多肽、类固醇等，根据所 带功能基团的不同，免疫原性的制备大致分为以下几类： (1)带有游离氨基或(和)羧基的半抗原。以多肽、激 素为代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ，它们的羧基可用混合酸酐法或碳二亚胺法， 使之与载体中的氨基形成稳定的肽键，也有的采用双功 能试剂如：戊二醛、甲苯、2 、4 - 二异氰酸盐等与载 体的氨基相连接，形成具有免疫原性的完全抗原。 ( 2 ) 带羟基、酮基、醛基的半抗原。以多糖、核 苷和类固醇激素为代表，它们均不能直接与载体蛋白相 结合，需要用化学方法在半抗原上引入羧基后才能与载 体结合。 (3)芳香族半抗原。这类抗原的芳香环上带有羟基 时，其临位上的氢很活泼，容易被取代，在偏碱性的 条件下，当有甲醛存在时，半抗原与载体可通过甲醛 撑桥连接；带有羧基的芳香族半抗原可与氨基苯丙酸、 对氨基马尿酸或对氨基丙酸进行重氮化反应，继而用碳 二亚胺法使半抗原上的羧基与载体上的氨基缩合而形成 完全抗原[8-9]。 苯二氮卓类是一类带有两个芳香环和一个七元杂环 的化合物，两个芳香环上均无羧基和羟基，所以不能 采用上述方法与载体相结合，但其母体中含有1,4- 二氮 七元杂环，其 2 位上有一个羧基，这使得位于第 3 位上 的两个氢原子变得活跃而易于被取代，所以国外的研究 中把3 位上的两个氢原子作为研究的突破口[10-13]。在此 之前也有学者用5-氯-3-(4-羟苯基)-2,1-苯并异恶唑为原 料，采用合成安定的工艺途径合成了5-[3-(4-对偶氮基)- 4-羟苯基]-7-氯-1,3-二氢-1-甲基-2-氢-1,4-苯并二氮卓- 2- 羰基，但这一过程相当繁琐。在此之后Ross Dixon 将安定溶于四氢呋喃(tetrahydrofuran，THF)中与1N的 NaOH反应后也得到了5-氯-[3-(4-对偶氮基)-4-羟苯基]- 7-氯-1,3-二氢-1-甲基-2-氢-1,4-苯并二氮卓-2-羰基， 再采用重氮化反应使之与蛋白载体相连[12]。 1985年美国的Angel L和助手们利用前人的 经验 班主任工作经验交流宣传工作经验交流材料优秀班主任经验交流小学课改经验典型材料房地产总经理管理经验 [13]合 成了3-半琥珀酰酐-苯二氮卓，将其交联于蛋白载体上， 免疫 BALB/C 小鼠，通过杂交瘤技术得到了四株单克隆 抗体，但文章中没有提及怎样合成3- 半琥珀酰酐- 苯二 氮卓[10]。1991年Virginia的Barbara E Reitler和Yesh P Sachdeva 等采用无水 THF 作为溶剂，在－ 60℃时，使 二异丙基胺(diisopropylamine)和丁基锂(n-buryllithum)充 分混合后，逐渐升温反应生成二异丙基胺基锂(lithium diisopropylamine，LDA)，再次使温度降至－ 60℃时加 入THF 溶解的氟硝安定(flunitraepam)，升高温度，当 锂盐完全形成后，重新冷却加入戊二酐，生成氟硝安 定－戊二酸的衍生物。1995 年德国的 West A [11]应用 Barbara E等研究的方法合成了氟硝安定-戊二酸衍生物， 进而采用碳二亚胺法将其交联于牛血清蛋白(BSA)，形 成了具有免疫原性的氟硝安定。 2.2 半抗原与载体连接的数目及鉴定 一般而言，机体的体液免疫中，抗原分子比抗体 的抗原结合区域大得多，因此，抗体仅能结合大分子的 某一特定部位，该部位称为抗原决定簇。要得到针对半 抗原的抗体，就必须使半抗原与载体分子连接时形成一 个外源性抗原决定簇，而不改变半抗原的结构和空间构 型，并且载体与半抗原的结合要有一定的距离，一般要 有3～5 个碳原子的空间才能产生好的免疫效果[8,14-15]。 半抗原结合到载体上的数目也直接影响着抗体的生 成。一般认为至少连接15～20 个以上的半抗原才能有效 诱导机体产生抗体，因此制备出半抗原的免疫原性后， 要用吸收光谱分析法测定结合物中半抗原的量，也可以 采用放射核素标记半抗原掺入法，即预先将标有放射性 核素的半抗原和未标记放射性核素的半抗原与载体结 合，除去未结合的标记半抗原，测定结合物中的放射 量，可以计算出结合的半抗原量[12,16]。因为 SDS- 聚丙 烯酰胺电泳，蛋白质的迁移速度主要决定于蛋白质分子 量的大小[17]，故也可以采用电泳的方法进行抗原量的测 定[18]。 2.3 免疫快速分析 目前，苯二氮卓类抗体在免疫学方面的应用主要通 过酶放大酶免疫实验(EMIT-tox)、荧光偏振免疫测定 (FPIA)、放射免疫法(RIA)等方法。这些方法中大多通 过测定安定的代谢产物奥沙西泮(oxazepam)来进行[19-23]。 虽然这些检测方法灵敏，但所使用的仪器和设备非常昂 贵，不易于基层工作的展开。19 7 1 年胶体金被引入免 疫化学，开始作为一种免疫标记技术使用，在临床检 验工作中发挥了很大的作用。由于胶体金能稳定又迅速 地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变，被 作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、 抗原、激素、核酸等生物分子的精确定位。在免疫化 学中得到广泛应用。胶体金具有肉眼可观察的红色，使 不需要任何仪器的试纸膜或试剂合法的免疫检测成为可 能。这种检测方法，可直接对血液、尿液、体腔液 中的苯二氮卓类药物进行检测，不需要对样品进行处 理，且具有快速、易于使用、便于指导临床和侦察的 特 点 。 3 展 望 各种分析技术联用是现代分析化学的发展特点，联 用技术可以取长补短，获得单一分析技术难以达到的效 果。将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，可避 免单独 IAs 信息量太少等缺欠，并且弥补了理化分析方 2007, Vol. 28, No. 08 食品科学 ※专题论述524 法选择性差等不足，使整个分析方法简化或进一步提高 检测效率，显示了免疫分析与理化分析在分析机制方面 的互补性，其中最引人注目的是免疫分析技术与 H P L C 的联用。 IAC-HPLC 或 IAC-GC 联用技术中，免疫亲合色谱 ( I A C ) 是利用连接有特异性抗体的基质做填料的一种 SPE，作为理化测定技术的样本净化手段，避免了 IAs 直接测定样本的诸多不足，IAC 的高选择性和高效性无 疑使样本前处理大大简化。HPLC-IAs 是一种将HPLC 的 强大分离效能与 IAs 的高选择性、灵敏性相结合的联用 技术，适用于常规检测器无响应或极难分离的残留组分 的测定。高效免疫亲合色谱(HPIAC)使用耐压的免疫吸 附剂做填料，可看作IAC 的高选择性与HPLC 高效分离 的合壁，具有对极少量样本或提取液直接测定的能力。 兽药多残留的IAC 分离纯化技术是LC-MS-MS 和 GC- M S 检测兽药残留时最有效的分离纯化手段。建立动物 性食品中药物多残留的定量确证检测技术(IAC-GC-MS、 IAC-LC-MS-MS)，是残留分析研究领域的一个重要发展 方 向 。 参考文献： [1] CARLSEN S, HAYES M, POWELL M L. 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