分析化学 课程教案
授课题目(教学章节或主题):
第七章 吸光光度法
授课类型
理论课
授课时间
6学时
教学目标或要求:
掌握朗伯比尔定律、显色反应条件的选择,理解吸收光谱的产生原理,了解吸光光度法与化学分析法比较的特点。
掌握干扰物质影响的消除和测量条件的选择,理解对朗伯-比尔定律的偏离、仪器测量误差,了解双波长吸光光度法。
掌握相关系数与
检验法、提高沉淀分离选择性的方法,
教学
内容
财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容
(包括基本内容、重点、难点):
第7章 吸光光度法
7.1 概述
一、与化学分析法比较的特点
1. 方法灵敏度高,测定下限可达10-4%-10-5%,可直接用于微量组分的测定。
2. 方法的准确度可满足微量组分测定的要求,测定的相对误差为2-5%,使用精密度高的仪器,误差可达1-2%。
3. 仪器相对简单,价格便宜。
4. 应用广泛 ,可用于无机物及有机物的定量与定性分析,可用于低含量组分及高含量组分的分析,还可用于络合物的组成,有机酸(碱)及络合物的平衡常数的测定等。
二、物质对光的吸收与受激发光
1. 光的基本性质,2. 吸收光谱的产生原理
三、溶液光吸收定律 — 朗伯比尔定律
1. 朗伯比尔定律及其物理意义,2. 吸光度的加和性及吸光度的测量,3. 朗伯比尔定律的理论推导,4. 灵敏度的
表
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示方法:摩尔吸光系数
,桑德尔灵敏度(S)
四、光度法及其仪器
1. 目视比色法,2. 吸光光度法,3. 分光光度计及其基本部件
7.2 显色反应与分析条件的选择
一、显色反应 :1. 显色剂,2. 多元络合物,3. 对显色反应的要求
二、显色反应条件的选择
1. 显色剂的用量,2. 溶液的酸度,3. 显色时间及颜色稳定时间,4. 显色温度
三、干扰物质影响的消除和测量条件的选择
1. 控制酸度, 2. 加入适当的掩蔽剂 , 3. 利用氧化还原反应改变干扰离子的价态
4. 选择适当的测量波长, 5. 选用适当的参比溶液, 6. 分离
7. 控制适当的吸光度范围, 8.
标准
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曲线的制作
7.3 吸光光度分析法的误差
一、对朗伯-比尔定律的偏离
1. 非常色光的影响
2. 介质不均匀的影响
3. 化学反应的影响
二、仪器测量误差
7.4吸光光度法的应用
一、多组分的测定
二、示差吸光光度法
三、双波长吸光光度法 1. 原理,2 应用
7.5分光光度法中的成性回归
一、一元线性回归分析与最小二乘法原理
二、相关系数与
检验法
第7章 吸光光度法
基于物质的光学性质建立的分析方法叫光学分析法。光学分析法又分光谱法和非光谱法。光谱法中有一种重要的分析方法称为吸光光度法,吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法,包括比色法、可见及紫外光法及红外光谱法等。本章重点讨论可见光区的吸光光度法。
§7.1 概述
一、与化学分析法比较的特点
1. 方法灵敏度高,测定下限可达10-4%-10-5%,可直接用于微量组分的测定。
2. 方法的准确度可满足微量组分测定的要求,测定的相对误差为2-5%,使用精密度高的仪器,误差可达1-2%。
3. 仪器相对简单,价格便宜。
4. 应用广泛 ,可用于无机物及有机物的定量与定性分析,可用于低含量组分及高含量组分的分析,还可用于络合物的组成,有机酸(碱)及络合物的平衡常数的测定等。
二、物质对光的吸收与受激发光
1. 光的基本性质
光是一种电磁波,不同波长的光具有不同的能量:
h为普朗克常数 ,
为光的频率 , C为真空中的光速,
为光的波长,n为折射率真空中n=1。
电磁波谱范围 , 如表7-1所示。
表7-1 电磁波谱范围表
2. 吸收光谱的产生原理
物质对光学光谱区的电磁波吸收与物质分子中电子能级和分子振动能级,转动能级的跃迁有关。由于这些能级是量子化的,所以分子在这些能级之间的跃迁只能吸收一定的能量。
图7—1双原子分子中电子振动和转动能级示意图。
A、B为电子能级 , A是最低电子能级 , B是第一激发态,每个电子能级中包含若干个振动能级,图中用
表示,每个振动能级中又包含若干个分子转动能级,图中用J表示。
当电子从基态向第一激发态跃迁时,要吸收相当于可见光能量的电磁波,物质表现出人眼能观察到的颜色。当电子从基态向第二激发态或更高的激发态跃迁时,吸收能量更高的电磁波,产生紫外光吸收。当电磁波的能量不足以引起电子能级的跃迁,但可以引起分子振动、转动能级跃迁时,产生红外光。
但当电子发生能级跃迁时,常伴随着振动能级和转动能级的跃迁,因此分子光谱是带状光谱,其中心的吸收强度最高,对应于电子能级。
理论上将具有同一波长的光称为单色光,由不同波长组成的光称为复合光,。白光是可见光,也是复合光,其波长范围为380—780nm,是不同颜色的可见光的混合光。它由红、橙、黄、绿、青、蓝紫等各色光按一定比例混合而成,但白光并不一定需要这么多颜色的光一起混合才能形成,若把两种适当颜色的光按一定强度比例混合,也能得到白光,这两种颜色的光称为互补色光。其实,日光、白炽灯光就是一对对互补色光按适当比例组合而成。表7-2给出了各颜色光的波长与其互补色的关系。
表7-2 物质颜色和吸收颜色的关系
当一束白炽灯光通过某溶液时,如果该溶液选择性地吸收可见区域中某波段的光,而让其余波段的光都透过,溶液呈现出该波段光的互补色光的颜色。例如
溶液吸收了白光中的黄色光而呈现蓝色,即黄色和蓝色是互补色;
溶液吸收白光中的黄绿色光而呈紫色,即黄绿色与紫色是互补色。
在比色法中,用玻璃滤光片滤去不被溶液吸收的光,只让能被溶液吸收的光通过被测溶液。故滤光片的颜色应与溶液的颜色互补,如测量
溶液应选黄色滤光片(滤去蓝光,使黄光通过)。
若测量某溶液对不同波长单色光的吸收程度,以波长为横坐标,吸光度为纵坐标作图,可得一条曲线,称为吸收曲线或吸收光谱。光谱峰值处称为最大吸收,它对应的波长称为最大吸收波长,常用
表示。
由于物质的分子结构不同,其分子能级各异,对不同波长的光产生选择性的吸收,从而具有各自的特征吸收光谱,借此可以鉴定各种物质。不同浓度的同一物质它的最大吸收波长是不变的,但吸光度随浓度增大而增大,显然在最大吸收波长处测量吸光度的灵敏度最高。KMnO4溶液对波长525nm附近的绿色光吸收最强,对紫色与红色光的吸收很弱。
同一种物质浓度不同时,光吸收曲线形状相同,最大吸收波长不变,只是相应的吸光度大小不同,此即定量分析的基础。
三、溶液光吸收定律 — 朗伯比尔定律
1. 朗伯比尔定律及其物理意义
当一束平行的单色光垂直照射到任何均匀,非散射的固体,液体或气体介质时,光的一部分被介质吸收,一部分透过介质,另一部分被器皿反射, 图7-2所示
图 7-2 光通过溶液的情况
设入射光强度为
。吸收光温度为
,透过光温度为
,反射光温度为
,则:
在光度分析中,通常将试液的和参比溶液分别置于同样质料和规格的两个吸收池中,使强度为I0的单色光分别通过这两个吸收池,并测量透过光的强度,此时两个吸收池的反射光强度基本上是相同的,其影响可互相抵消,故上式可简化
之比称为透射比或透光度,用T表示
上式表明T愈小,溶液对光的吸收愈大。
实验证明:溶液对光的吸收程度与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有关。若入射光的波长保持不变,则溶液对光的吸收程度只与溶液浓度和液层厚度有关,朗伯和比尔分别于1760年和1852年研究了光的吸收与液层厚度及有色溶液浓度之间的关系,得到如下方程:
式中A称为吸光度,b为液层厚度,c为吸光物质的浓度,K是与吸光物质的性质入射光波长及温度等因素有关的常数。该关系式表明,在当一束平行单色光垂直照射均匀、非散射的溶液的前提下,A与c、b成正比,此即朗伯-比尔定律。
该定律是光度法定量分析的理论基础,适合于可见光、紫外红和红外光。
A与T的关系为
2. 吸光度的加和性及吸光度的测量
在含有多组分体系的吸光分析中,往往各组分都会对同一波长的光有吸收作用,如各组分的吸光质点彼此不发生作用,当一束平行单色光通过此溶液时,无论从理论上和实验上都可证明
这一规律称吸光度的加和性,根据这一规律可进行多组分的测定。
在光度分析中,总是将待测溶液盛入可透光的吸收池中测量吸光度,为了抵消吸收池对入射光的吸收、反射以及溶剂试剂等对入射光的吸收和散射等因素,在实际测量有色溶液吸光度时,应选取光学性质相同,厚度相等的吸收池,分别盛待测溶液和参比溶液(一般为不含待测组分的试剂溶液),先调整仪器,使透过参比溶液吸收池的吸光度为零,从而消除吸收池和试剂对光吸收的影响。然后再测量试液的吸光度,实际上便是把通过参比溶液吸收池的光强作为入射光的强度。
根据加和性,可进行多组分同时测定及某些化学反应平衡常数的测定。
3. 朗伯比尔定律的理论推导
4. 灵敏度的表示方法
1 摩尔吸光系数
K随c,b所取单位的不同而异,若 c用g/L , b用cm为单位时
K = a , A = abc
a称为吸光系数,单位为
。它表示c = 1g/L, b = 1cm, 溶液在特定波长下的吸光度。
A=Kbc
当浓度c用mol/L, b用cm为单位时
,
称为摩尔吸收系数,其单位为
。它表示c = 1mol/L , b = 1cm, 溶液在特定波长下的吸光度。
反映了吸光物质对光的吸收能力,也反应了光度法测定该物质的灵敏度。一般认为,若
<104 ,则灵敏度低,
在104
5×104属中等灵敏度,
在6×10-4
105属高灵敏度。
在实际工作中,在适当浓度时测定A,再通过计算求得
,或通过工作曲线上求得
,因为A-C曲线的斜率即为
。(若吸光物质在溶液中结构发生变化如解离、聚合等,
怎样变化与处理?)
②桑德尔灵敏度(S)
Sandell把显色反应的灵敏度定义为:在一定波长或波段处,当仪器的检测极限为A=0.001时,单位截面积(1cm2)内所能检测出的吸光物质的最低含量,用符号S表示,其单位为
。
在微量分析中,若物质的质量用
而不用mol表示时,便用S更方便。比较灵敏的显色反应,S值大多数在0.01~0.001
范围,S越小,方法越灵敏。
S与
的关系可推导如下
c的单位改写为
,b的单位为cm, bc的单位为
,即
。如果bc乘以待测物质的摩尔质量M(g/mol), 就是单位截面积光程内待测物质的质量,则
将bc值代入上式得
四、光度法及其仪器
1. 目视比色法
目视比色法是一种用眼睛辨别溶液颜色深浅,以确定待测组分含量的方法。其中最常用的是标准系列法。该方法仪器简单,操作方便,灵敏度较高,显色反应如不遵从比尔定律,也能进行,但该方法准确度差。
2. 吸光光度法
吸光光度法是借助分光光度计测量一系列标准溶液吸光度,绘制标准曲线,然后根据被测试液的吸光度,从标准曲线上求得被测物质的浓度或含量。
由于吸光光度法是借助于仪器进行测量,可消除主观误差,测定的灵敏度和准确度比目视法有很大提高。
吸光光度法与目视比色法在原理上是有差别的,吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况,目视比色法则是比较透过光的强度。
3. 分光光度计及其基本部件
图7-3 722型分光光度计光学系统图
§7.2 显色反应与分析条件的选择
一、显色反应
应用吸光光度法时,如果待测物质本身有较深的颜色,可进行直接测定,但大多数待测物质无色或颜色很浅,需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物后再进行测定。
被测组分 显色剂 有色化合物
该反应称为显色反应,试剂R称为显色剂。
1. 显色剂
常用的显色剂是有机试剂,它们的分子中含有生色团和助色团。生色团是分子中能吸收紫外光和可见光的基团,常常是共轭双键体系,如:
等
助色团是指那些能使生色团的吸收波长变长(红移)的基团,一般是具有未成键的电子对的基团,如
2. 多元络合物
在光度分析中,当二元络合物的灵敏度与选择性不够高时,常应用多元络合物。多元络合物是由三种或三种以上的组分形成的络合物,目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。
多元络合物具有反应灵敏、选择性好、比较稳定,易被有机溶剂萃取等特性,近年来在分析化学,特别是在光度分析中的应用得到迅速发展。
3. 对显色反应的要求
在光度分析中,将试样中被测组分转变为“有色”化合物的化学反应叫“显色反应”。显色反应可分为两类,络合反应和氧化还原反应,主要是络合反应。对显色反应一般应满足下列要求:
① 选择性要好 一种显色剂最好只与被测组分发生显色反应或者干扰离子容易被消除。
② 灵敏度要高 灵敏度高的显色反应,有利于微量组分的测定,故一般选择有色化合物的摩尔吸光系数高的显色反应。但灵敏度高的显色反应并不一定选择性好,对于高含量组分的测定,不一定选用最灵敏的显色反应。
③ 有色化合物的组成要恒定 化学性质要稳定,生成的有色化合物应有固定的组成,这样被测物质与有色化合物之间才有定量关系。
④ 有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大 通常用“反衬度”表示它们之间的颜色差别,它是有色化合物MR和显色剂R的最大吸收波长之差的绝对值:
一般要求
在60nm以上,这样才能达到显色时颜色变化明显,试剂空白小的目的。
二、显色反应条件的选择
确定了显色反应之后,需要确定合适的反应条件,一般是通过实验研究确定。这些实验条件包括显色剂的用量、溶液的酸度、显色反应温度、显色反应时间及有色络合物的稳定性等。
1. 显色剂的用量
由上式可见,当固定[R]时,M转化为MRn的比率将不发生变化,一般地说为了使反应尽可能地进行完全,应加入过量的显色剂,对稳定性较高的络合物,只要加入稍过量的试剂,显色反应即能定量进行,但对某些不稳定或形成逐级络合物的反应,则必须严格控制试剂的用量。在实际工作,根据实验结果确定显色剂的用量。显色剂的用量对显色反应的影响一般有三种可能,如图7-4所示。
图 7-4 试液吸光度与显色剂浓度的关系
例如以SCN-作显色剂测定钼含量时,要求生成红色的Mo(SCN)5络合物,当SCN‑浓度过高时,因生成浅红色的
络合物,反而使其吸光度降低。而以SCN-作显色剂,测定Fe3+时,随SCN-浓度增大,逐步生成颜色更深的不同配位数的络合物。使对于图8-4后两种情况,必须严格控制显色剂的用量,才能得到准确的实验结果。
2. 溶液的酸度
由于大多数显色剂是有机弱酸或弱碱,介质的酸度变化,将直接影响显色剂的离解程度和显色反应是否能进行完全。多次金属离子也会因介质酸度降低而发生水解,形成各种型体的羟基络合物,甚至析出沉淀。某些能形成逐级络合物的显色反应,产物的组成也会随介质改变而改变。如磺基水杨酸与Fe3+的显色反应,在pH2~3时,生成红紫色1:1的络合物;在pH4~7时生成棕橙色1:2的络合物;在pH8~10时,生成黄色1:3的络合物,可见进行显色反应时,控制介质酸度是非常重要的。
实际工作中,显色反应的最宜酸度是由实验确定的。具体方法是固定溶液中待测组分与显色剂的浓度,改变溶液的酸度,测定溶液的吸光度,绘制A-pH曲线从中找出最适宜的pH范围。邻二氮菲和Fe2+在柠檬酸盐缓冲溶液中显色反应与酸度的关系见下图:
3. 显色时间及颜色稳定时间
由于显色完成的速度不同,溶液颜色达到稳定状态所需时间不同,有些有色络合物能瞬间形成,颜色很快达到稳定状态,并能保持较长时间;大多数显色反应速度较慢,需要一定时间,溶液颜色才能达到稳定;有些有色络合物虽能迅速形成,但颜色很快减退,使吸光度下降。
适宜的显色时间及颜色稳定时间也是通过实验确定。配制一份显色溶液,从加入显色剂开始计算时间,每隔一段时间测定一次吸光度,绘制A-t曲线,根据曲线来确定最适宜的显色时间和颜色稳定时间。
4. 显色温度
多数显色反应在室温下进行,有少数反应在室温下进行很慢,必须加热至一定温度才能迅速完成,但有些有色化合物在室温偏高时易分解,为此应根据不同情况选择适当的温度进行显色。
三、干扰物质影响的消除和测量条件的选择
样品中存在干扰物质会影响被测组分的测定。例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应生成有色化合物,在测量条件下也有吸收;干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应,使显色反应不完全;干扰物质在测量条件下从溶液中析出,使溶液变得混蚀,无法准确测定溶液的吸光度等。为了消除以上原因引起的干扰,可采用以下方法:
1. 控制酸度 其原理在络合滴定一章中讲过,主要是根据络合物的稳定性不同,可以利用控制酸度的方法提高反应的选择性。例如双硫腙能与
等十多种金属离子形成有色络合物,其中与
生成的络合物最稳定,在0.5mol/L
介质中仍能定量反应,而上述其他离子在此条件下不发生反应,因此可利用控制
,在上述离子共存下测定
。
2. 加入适当的掩蔽剂 使用掩蔽剂消除干扰是常用有效的方法,广泛用于吸光光度法。选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用,掩蔽剂以及与干扰物质形成的络合物的颜色应不干扰待测离子的测定。
3. 利用氧化还原反应改变干扰离子的价态
如用铬天青S比色法测定Al3+时,Fe3+有干扰,加入抗坏血酸将Fe3+还原为Fe2+后,干扰即可消除。
4. 选择适当的测量波长
在光度分析中一般应该选择最大吸收波长,因为在最大吸收波长下测定,不但灵敏度较高,而且能够减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。但是如果在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰,就应考虑选择其它能避免干扰的入射光波长。
如
的最大吸收波长为525nm,测定
时若有
存在,由于其在525nm处也有一定的吸收,影响
的测定。为此可用545nm的光进行测定,虽然测定的灵敏度降低,却消除了
的干扰。
5. 选用适当的参比溶液
在光度测量时,利用参比溶液调节仪器的零点,可以消除由于吸收池壁及溶剂对入射光反射和吸收带来的误差,并扣除干扰的影响,参比溶液可根据下列情况来确定:
① 当待测试液、显色剂及所有的其他试剂在测定波长处无吸收时,可用纯溶剂(如去离子水)作参比溶液,简称溶剂参比。
② 当显色剂或其他试剂在测定波长处有吸收,可按照与显色反应相同的条件(只是不加试液),同样加入显色剂和其他试剂作参比溶液。
③ 当显色剂和其他试剂无吸收,而待测试液中存在的干扰离子有吸收时,应采用不加显色剂的待测试液作参比。
④ 如果显色剂与待测试液中的其他组分也发生反应,且反应产物对所选用的入射波长也有吸收,可将一份试液加入适当的掩蔽剂,将待测组分掩蔽起来,使之不与显色剂反应,然后按操作步骤,加入显色剂及其它试剂,以此作为参比溶液。
例如,以铬天菁S为显色剂,测定Al3+时试液中的
等离子有干扰,可加适量
到待测试液中掩蔽Al3+,然后再加入显色剂和其它试剂,以此为参比便可消除
离子的干扰。
6. 分离
若上述方法不宜采用时,可利用萃取、沉淀 、离子交换等方法,采取预先分离的措施。(参见第8章)
7. 控制适当的吸光度范围
从仪器测量误差一节中可知,为了使测量结果得到较高的准确度,一般应控制待测溶液的吸光度在0.2-0.8范围内(后面讲到),可通过控制溶液的浓度或选择不同厚度的吸收池达到目的。
8. 标准曲线的制作
根据朗伯-比尔定律 ,
。通常在光度分析中需要绘制标准曲线,即固定液层厚度及入射光波长和强度,测定一系列不同浓度标准溶液的吸光度,以吸光度为纵坐标,标准溶液的浓度为横坐标作图,得到一条通过原点的直线,该直线称为标准曲线或工作曲线。在相同条件下测定试液的吸光度,从工作曲线上查出试液的浓度,这种方法称为工作曲线法。
在实际工作中,有时标准曲线不通过原点,其原因比较复杂,可能是由于参比溶液选择不当、吸收池厚度不等、吸收池位置不妥、吸收池透光面不清洁等原因所引起的。应根据具体情况进行分析,找出原因加以克服。
§7.3 吸光光度分析法的误差
在吸光光度分析中影响准确度的主要因素有以下方面。
一、对朗伯-比尔定律的偏离
若溶液服从比尔定律,则溶液的A与C应成线性关系,绘制的工作曲线应该是条直线。但在实际工作中,尤其当浓度较高时,直线常发生弯曲,这种现象称为对朗伯-比尔定律的偏离。如果在弯曲部分进行测量,将会引起较大的误差,发生偏离的主要原因有两方面:
2. 非常色光的影响
严格的说朗伯-比尔定律只适用于单色光,但实际上用各种分光方法得到的入射光,都不同程度地含有非单色光,这些非单色光会引起对比尔定律的偏离。当单色光不纯时,随着浓度增加,工作曲线向下弯曲。
现假定入射光由
两种波长光组成,溶液吸光质点对
光的吸收都遵从比尔定律。
对
对
总的入射光强度为
,透射光强度为
,该光通过溶液后的吸光度为
当
时,即入射光为单色光,则上式
,A与c成线性关系。若
,则
,A与c不成线性关系。
相差愈大,对比尔定律偏离愈严重,因此希望光度计的单色器质量尽量好。
入射光波长的选择对比尔定律偏离也有影响,在工作中总是选择吸光物质的最大吸收波长的光为入射光(
),这不仅可取得最大的灵敏度,而且吸光物质的吸收光谱在此处有一较小的平坦区,
值变动很小,因此能够得到较好的线性关系。
2. 介质不均匀的影响
比尔定律要求介质是均匀的,如果被测溶液不均匀,是胶体溶液、乳浊液或悬浊液,入射光有一部分因散射现象而失损,使透射比减少,因而实测吸光度增加。且随着浓度增加,这种影响增大,使标准曲线向吸光度轴弯曲。
4. 化学反应的影响
溶液对光的吸收程度决定于吸光质点性质和数目,若由于溶液中的化学反应使吸光质点发生了变化,必然会引起吸光度的改变,从而偏离比尔定律,这些化学反应主要有:
离解:大部分有机酸碱的酸形、碱形对光有不同的吸收性质,溶液的pH不同,酸碱离解程度不同,导致酸形与碱形的比例改变,使溶液的吸光度发生改变。
络合:某些络合物是逐级形成的,络合比不同络合物形式对光的吸收性质不同。例如, 在Fe(III)与
的络合物中,
色最浅,
色最深,所以
浓度越大溶液颜色越深,即A越大。
缔合:例如在不同酸性条件下,
会发生转换。
橙 黄
可见两种不同形式对光的吸收有很大的不同。在分析测定中,控制溶液条件使被测组分以一种形式存在,就可以克服化学因素所引起的对比尔定律的偏离。
二、仪器测量误差
在光度法中除了各种化学因素所引入的误差外,仪器测量不准确也将引入误差。任何光度计都有一定的测量误差,这些误差可能来源于光的不稳定,实验条件的偶然变动,测量时透光率与吸光率的读数误差等,下面着重讨论读数误差。
在光度计中,透射比的标尺刻度是均匀的,吸光度与透射比为负对数关系,A = -lgT。
故A的标尺刻度是不均匀的,对于同一台仪器,读数的波动对T来说应基本不变;但对吸光度来说,它的读数波动则不再为定值。
图 7-5检流计标尺上吸光度与透射比的关系
由光度计读数标尺上吸光度与透射比的关系可以看出,A越大,读数的不准确度应该越大。实际工作中通常使用A,下面要讨论的问题是:A在什么范围内读数误差最小?首先考虑吸光度的测量误差与浓度c测量误差之间的关系。设吸光度的读数误差为dA,则相对误差
由
两式相除
由于
微分
即
由于A与T是负对数关系,所以其测量相对误差并不相等。故由读数误差引起的c的测量相对误差
对于给定的光度计,前面讲过T的读数绝对误差是基本固定的, 不随T的变化而改变,可把dT写成△T,
则
△T一般有±0.01的误差
所以
由上式可见
值的大小与T的大小关系较复杂,代入不同的T值,从得到的
值。可得到
曲线。如图8-6。
图7-6
关系图
由图可见当T太大或太小时,
都较大。在实际工作中,控制待测溶液的T在15%-65%之间,即A在0.2-0.8之间可保证测量的相对误差较小。
T为多少时,
=
最小?要使
最小,或
中TlnT应为最大,将TlnT对T求导,其值应为零。
-lnT = 1 ,
-lgT = 0.434 = A
也就是T = 0.368,即A = 0.434 或 T = 36.8% 时,浓度测量相对误差最小。 如果△T = 0.01,
则
=2.7%
可以看出,即使浓度测量的相对误差最小时,它的值也接近3%,这就是光度分析法的测定误差一般在2-5%左右的原因。
§7.4吸光光度法的应用
吸光光度法目前已为工农业、环境、材料,医药各部门和科学研究的各个领域广泛采用,成为各应用部门和科研的有力测试手段,因此详尽介绍它在各方面的应用是不可能的,这里仅就分析化学方面的某些应用作些简要介绍。
一、多组分的测定
根据吸光度具有加和性的特点,在同一试样中可以测定两个以上的组分。如试样中含有x、y两种组分,在一定条件下将其转化为有色化合物,分别绘制吸收光谱,会出现三种情况,
图a表明两组分互不干扰,可分别在λ1与λ2处测量溶液的吸光度。
图b 表明x与y有干扰,y对x无干扰。
图c表明两组分彼此都有干扰,这时应在λ1处测定混合物
和纯组分x及y的
及
值,然后在λ2处测定混合物吸光度
和纯组分的
及
值,根据吸光度的加和性原则,可列出方程。
]
式中
、
、
、
均由已知浓度x及y的纯溶液测得,试液的
与
由实验测得,于是
值便可通过解联立方程求得。
对于更复杂体系(多组分)可用计算机处理测定的结果,由微机控制的分光光度计附有测量和数据处理软件,可由仪器直接给出测定结果。由于化学计量学在仪器技术中得到应用,可对仪器测得的吸光光谱用各种化学计量学方法处理,以选择最好的处理方法及获得最好的分析结果。
二、示差吸光光度法
吸光光度法一般只适于测定微量组分,当待测组分含量高时,吸光度超出准确测量的读数范围,准确度就会降低,若采用示差光度法可弥补这一缺陷。示差法不是以空白溶液作为参比溶液,而是采用比待测溶液浓度稍低的标准溶液作参比溶液,测出待测试液的吸光度,从测得的吸光度求出它的浓度。
设标准溶液浓度为
,待测试样浓度为
根据比尔定律有
具体做法是:先用已知浓度的标准溶液,加入各种试剂后作为参比,调节其吸光度值为零,那么测得的试液吸光度A值,实际上是两者之差△A,它与两者浓度差
成正比。这时可以把以该已知浓度的标准溶液为参比的校准曲线作为△A对
的工作曲线,于是根据测得的△A查得相应的
值,即
由于用已知浓度的标准溶液作参比,如果此参比溶液透射比为10%(以空白试液作参比),现调至100%(A=0),即意味着将仪器透射比标尺扩展了10倍,如图8-7所示
,
图 7-7示差光度法标尺扩展原理
如待测试液的T原为7%,测量误差较大,用示差法测量时T为70%,读数误差落到较小的区域,从而提高了
的测量准确度,也就是提高了
值的准确度。
设测量误差为x%,普通光度法中测量结果为:
;示差法中测量结果为:
;由于
只是稍大于
,
总是远大于
,即示差法的测量准确度大大提高。选择合适的参比溶液,示差法的最小误差可达0.3%左右。
示差光度法要求仪器的光源强度足够大,否则难以调节参比溶液的吸光度为零。
三、双波长吸光光度法
1. 原理
????
借助切光器,使两道光束以一定的频率交替照到装有试液的吸收池,最后由检测器显示出试液对
的吸光度差值为△A。
设
两单色光的强度相等,则有
△A与c成正比,这是双波长法定量分析的理论基础。
由于双波长法,只用一个吸收池,而且是以试液本身对某一波长光的吸收度为参比。因此消除了因试液与参比液及两个吸收池之间的差异所引起的测量误差,从而提高了测量的准确度。
2. 应用
对于吸收光谱有重叠的单组分(显色剂与有色络合物的吸收光谱重叠)或多组分(两种性质相近的组分所形成的有色络合物吸收光谱重叠)试样,混浊试样以及背景吸收较大的试样,由于存在很强的散射和特征吸收,难以找到一个合适的参比溶液来抵消这些影响,利用双波长可解决这一问题。
双波长法使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池,测量并记录两者吸光度的差值,可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号,从而消除上述各样干扰,求出待测组分的含量。
如混浊试液中组分的测定,普通光度法的测定必须使用相同浊度的参比溶液,实际工作中很难找到。双波长法中以试液本身作参比,用波长相差不大
的作入射光,其中一束单色光作参比。由于同一试液在波长接近的两束光的散射作用大致相同,不会影响△A值,从而可消除混浊试液对光散射的影响。一般选择
相差40-60nm左右,且△A较大的波长的光作为入射光。
§7.5分光光度法中的成性回归
光度分析中需要作A和c的工作曲线。在一定范围内,c与A成正比,划出的图象是一条直线。由于实验中会有误差存在,实验点全部在同一条直线上的情况是少见的。尤其是当误差较大时,实验点比较分散,在标准曲线中凭眼睛估计,很难画出一条与各实验点最接近的直线,利用一元线性回归法可较好的解决这一问题,而且能够判断分析操作的正确与否,判断标准曲线的稳定性,估算出测定方法的灵敏度。
回归分析在生产与科研工作中有很广泛的应用,本节用实例说明线性回归在光度法数据处理中的应用。
一、一元线性回归分析与最小二乘法原理
一元线性回归法是研究只含一个自变量的两个变量之间的关系,如A-c关系。设自变量为x,因变量为y,当x与y存在线性关系时,在直角坐标图上可得到一直线,该直线可表示为
y = bx +
回归分析所得到的y值是若干实测值的回归结果,常以符号
表示,因此一元回归方程常写为:
=
+ bx
称为回归值,
、b称为回归系数。
对于每一个变量
(i=1、2、3、……),由回归方程可以确定一回归值
,设回归值
与实际测定值
之差
,表示了
与回归直线
=
+bx的偏离程度,因而对于所有的自变量
来说,如果
的偏离愈小,便可认为回归直线与所有实验点拟合得愈好。为了更准确地表示全部实测值
与回归直线的偏离程度,常用实测值与回归值的偏差平方和表示,并记为E(
,b),于是得到
要使E最小,根据微积分学的极值原理,只要将上式分别对a、b求偏微分,并令其等于零即可。由于平方运算又称二乘运算,因此,求回归直线的方法又称为最小二乘法。
要使E(
,b)为最小值,
、b可由下式求出。
从
得
同样由
得到
式中
,
分别为x和y的平均值,
为直线截距,b为直线斜率,
、b确定,一元线性回归方程及回归直线就可确定。
例1 用吸光光度法测定合金中Mn的含量,吸光度与Mn的含量间有下列关系:
Mn的质量
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 未知样
吸光度 0.032 0.135 0.187 0.268 0.359 0.435 0.511 0.242
试列出标准曲线的回归方程并计算未知试样中Mn的含量。
解 此组数据中,组分浓度为零时,吸光度不为零,这可能是在试剂中含有少量Mn,或者含有其它在该测量波长下有吸光的物质。
设Mn含量值为x,吸光度值为y,先计算回归系数,
,b 值。n=7。
故
该标准曲线的回归方程为
y=0.038+3.95x
未知试样的吸光度为y=0.242
故求出试样中Mn 0.052
。
二、相关系数与
检验法
当两个变量之间直线关系不够严格,数据的偏离较严重时,虽然也可以求得一条回归线,但实际工作中,只有当两变量之间存在某种线性关系时,该回归曲线才有意义。回归曲线是否有意义,可用相关系数
来检验。
定义如下:
越接近1,表示x、y的线性关系愈好。线性关性好与不好是相对的,应根据测量的次数及置信水平用统计的方法来检验。
表7-3给出了不同置信水平及自由度时的相关系数,若
大于表值,才可认为该线性关系有意义。
表7-3 检验相关的临界值表
例2 求例1中标准曲线回归方程的相关系数,并判断该曲线线性关系如何(置信度99%)?
解
查表8-3,
,因此,该标准曲线具有很好的线性关系。
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