购买

¥8.0

加入VIP
  • 专属下载券
  • 上传内容扩展
  • 资料优先审核
  • 免费资料无限下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 抗体的制备

抗体的制备.ppt

抗体的制备

is_294897
2019-04-14 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《抗体的制备ppt》,可适用于医药卫生领域

抗体的制备李成仁组织学与胚胎学教研室一、一些基本概念克隆(clone)是指无性繁殖细胞系是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中如无突变发生其基因是完全相同的。细胞克隆:由一个细胞增殖而成的细胞集团抗原(antigenAg)抗原决定簇是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团又称表位(epitope)抗原结合位点Ag单克隆抗体(MonoclonalAntibody,McAb)由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。多克隆抗体(PolyclonalAntibodypAb)用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。Ag单克隆抗体BBBBBBBB多克隆抗体单克隆抗体的特点抗体的性质相同容易纯化、标记。特异性强具有抗原结合位点的专一性。(不是抗原的专一性!)因结合位点的单一性有时不易捕捉抗原一株单克隆抗体与抗原不易产生凝集反应或沉淀反应。但单克隆抗体有交叉反应是由于不同的抗原上有完全相同的表位(的交叉反应)或有相似的表位(不同程度的交叉反应)。多克隆抗体的特点多抗是单抗的混合物因此多抗的性质是一个群体综合的性质。特异性一般比单抗差因为由不同性质的抗体组成只要其中含交叉反应的抗体多抗就有交叉反应所以多抗更容易有交叉反应。比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体多种抗体都可与抗原结合。抗体的纯化、标记比单抗难因为含有各种不同类型、亚类的抗体提纯、标记的方法有所差别。同时血清中含有的杂蛋白比较多。购买抗体时要注意厂商的标注适合于做什么实验使用浓度多少WB(Westernblotting免疫印迹)IHC(Immunohistochemistry,免疫组织化学)ICC(Immunocytochemistry,免疫细胞化学)IEM(Immunelectronmicroscopy,免疫电镜)FCM(FlowCytometry,流式细胞仪)ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassey,酶联免疫吸附实验酶联免疫分析)抗体的制备技术经历了三代:第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体称为多克隆抗体(polyclonalantibody)第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)第三代抗体是利用基因工程技术制备而来称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody)。抗体制备技术一、多克隆抗体制备(一)免疫原的制备(二)免疫动物(三)免疫血清的纯化(四)免疫血清的鉴定(五)免疫血清的保存二、单克隆抗体制备(一)单克隆抗体制备原理(二)单克隆抗体制备的技术要点(三)影响杂交瘤技术的因素(四)单克隆抗体的应用三、基因工程抗体技术(一)人源化抗体(二)小分子抗体(三)双特异性抗体(四)抗体库技术抗体制备技术二、多克隆抗体制备(一)免疫原的制备免疫原(immunogen)指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性(immunogenicity)免疫原mdash天然抗原、人工合成抗原蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原颗粒性抗原的制备()红细胞抗原的制备:A、新鲜血经无菌NS洗涤次取压积红细胞并配制成~直接进行注射免疫。B、新鲜血抗凝剂mdash℃保存W免疫前取适量抗凝绵羊血按A处理。C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。()细菌抗原的制备:取标准菌株接种。H抗原:取有动力的菌株液用~甲醛处理。O抗原:菌液于℃h。Vi抗原:杀菌后加入的氯化钙溶液。()虫卵也可作为抗原例如日本血吸虫卵悬液。()组织细胞粗抗原:所用的组织必须是新鲜或处理后低温(℃)保存的。器官或组织材料得到后立即去除表面的包膜或结缔组织及大血管用无菌NS进行灌注、洗涤至没有残血、污物在冷浴中将组织剪成小块后粉碎(匀浆)消化。粉碎方法有两种一是高速组织捣碎机法:注意要高速(万rmp)间断(每次秒~min)进行时间过长会导致产热破坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过的海沙使研磨更有效)。匀浆液经离心沉淀中含大量的组织细胞和碎片上清液可提取可溶性抗原。消化是用胃蛋白酶或胰酶通过酶解将细胞间质消化获得游离单个细胞。可溶性抗原的制备可溶性抗原可分为:细胞膜蛋白抗原、细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。()细胞破碎:有如下方法:A、反复冻融法:置~℃冻结然后缓慢融化反复次大部分细胞因胞内冰晶的形成和溶剂浓度的突然改变而被融破。此法适用于组织细胞对微生物的细胞作用较差。B、冷热交替法:将材料投入沸水中℃左右维持数分钟立即置于冰浴中。在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用此法。C、超声波破碎法:是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的方法。微生物和组织细胞破碎多用此法但真菌厚膜孢子则较难打破。D、酶处理法:酶在一定的条件下能消化细菌和细胞。例如在碱性(pH)下溶菌酶可专一破坏G菌细胞壁。此法适用于多种微生物。E、表面活性剂处理:在一定的条件下表面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。提取核酸时常用此法。F、自溶法:利用组织和微生物的自身酶系在一定条件下使细胞溶解。()蛋白质抗原的制备:破碎的细胞按一定要求纯化可获得不同成分的抗原。A、超速离心法:利用各抗原在梯度液中沉降速度不同达到区带分离的目的。这是分离亚细胞部分和蛋白质大分子的有效手段。B、选择性沉淀:是采用各种沉淀剂或改变条件使抗原成分沉淀而达到分离的目的。a、核酸除去法:用DNARNA酶降解或用氯化锰硫酸鱼精蛋白链霉素作沉淀剂去除核酸。b、盐析沉淀法:用不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠。例如:用、、的硫酸铵分次提取或用硫酸钠提取即可获得丙种球蛋白(含IgG以上)。c、有机溶剂沉淀法:有机溶剂能降低溶液的介电常数从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力导致溶解度降低而沉淀有些有机溶剂能破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀例Cohn地温酒精可将血浆蛋白分为五组。IgG属CohnⅢ。d、其它沉淀剂:常用聚乙二醇(PEG)和硫酸葡聚糖。PEG浓度~可沉淀IC~沉淀IgM~沉淀IgG~沉淀其它球蛋白则沉淀白蛋白。C、凝胶层析法:利用凝胶的多孔网状结构大分子在凝胶颗粒间很快通过小分子进入网孔难于洗脱将抗原分为大、中、小三种。属区带分离法。D、离子交换层析:利用带离子基团的纤维或凝胶吸附带相反电荷的抗原。凝胶过滤层析(分子筛)的作用机理E、亲和层析:利用生物学分子间所具有的专一亲和性而设计的层析方法。AgAb,激素受体酶酶配体酶蛋白辅酶。亲和层析的作用机理()核酸抗原的制备:细胞破碎液去除蛋白质(常用酚和氯仿抽提)后用沉淀剂(常用乙醇)沉淀核酸。()脂多糖抗原的制备:苯酚提取法。()Ig片段的制备:酶裂解法mdashFc、Fab氧化还原法:轻、重链。()纯化抗原的鉴定:鉴定蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。蛋白的含量mdash定氮(紫外光nm等)分子的质量mdash电泳、质谱蛋白的纯度mdash电泳等免疫学活性mdash免疫双扩散、免疫印迹(二)半抗原免疫原的制备:利用某些功能团将半抗原连接到载体上。、载体的选择:A、蛋白质:人牛兔白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白等。最常用牛白蛋白。B、多肽聚合物:多为人工合成(多聚赖氨酸)。C、大分子聚合物和某些颗粒:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)羧甲基纤维素活性碳乳酸等连接方法:半抗原与载体的连接有物理法和化学法。物理法:用吸附法将载体与半抗原连接其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原吸附载体主要有PVP和CMC等化学法:利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。A、碳化二亚胺法B、戊二醛法C、氯甲酸异丁酯法D、琥珀酸酐法E、羧甲基羟胺法F、一氯醋酸钠法G、重氮化的对氨基苯甲酸法(三)佐剂:与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质称为佐剂。、佐剂的条件:A、增加抗原的表面积并改变抗原的活性基团构型从而增加抗原的免疫原性。B、与抗原结合能延长抗原在局部组织中的存留时间达到持续刺激基团产生高效价的抗体。C、可以激活免疫活性细胞增强体液免疫、细胞免疫和非特异免疫功能。D、无毒、无副作用。、常用佐剂的种类和制备:A、铝乳:硫酸铝NaOH反应后NS洗涤沉淀次以上。:与抗原混合。B、明矾:硫酸钾铝在一定pH下产生氢氧化铝胶体。制备方法是:AgNS搅拌下缓慢滴入的硫酸铝钾溶液以NaOH校正pH至离心、NS洗涤。C、福氏佐剂:分为不完全佐剂(石蜡油羊毛脂)和完全佐剂(石蜡油羊毛脂卡介苗)。:与抗原混合研磨均匀即可。但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉芽肿和持久溃疡而不用于人体免疫。(四)免疫动物为获取高质量(特异性强和效价高)的抗体除了需制备质量好纯度高的抗原外还需选择适宜的动物和设计有效可行的免疫方案如抗原的剂量、剂型、注射途径、注射次数、注射间隔和接种动物的年龄均与免疫效果密切的关系。用于免疫的动物:主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体数量来选择。①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远其免疫源性越强免疫效果越好而同种系或亲缘关系越近免疫效果越差。②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物(以雄性为佳)抗体需要量少时选用家兔、豚鼠和鸡等小动物抗体需要量大时可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。③抗原性质与动物种类。兔子(rabbit):最常用于自制抗体抗体量较多。最好用纯种新西兰兔大耳白体重以~kg为宜。小鼠(mouse):可用于自制抗体但抗体量很少。一般用BALBC和昆明鼠大鼠(rat):可用于自制抗体免疫过程要麻醉动物。常用Wistar大鼠羊(sheep、goat):常用于较大批量地生产抗体(商品)。马(horse):常用于大批量生产治疗用抗体(商品)。豚鼠(guineapig):国外实验室常用。免疫途径免疫途径有多种多样如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等一般常用皮下或背部多点皮内注射每点注射ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性如激素、酶、毒素等生物学活性抗原一般不宜采用静脉注射。、基础免疫:首次抗原剂量大~mug用福氏完全佐剂。、加强免疫:第次以后抗原量为首次剂量的~用福氏不完全佐剂每~周加强免疫一次多次。(三)免疫的基本步骤、取血测效价:加强免疫两次或三次以后的第天取血。制备血清检测抗体效价。如未达到预期效价需再进行加强免疫直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时即可放血制备抗血清。免疫~次以后从耳静脉取血检测效价酶联法::以上能达到:。免疫双扩散::以上能达到:效价达到要求的可放血制备血清可一次放血(颈动脉或心脏)也可多次取血(耳静脉)放血过程中要严格按无菌要求进行。图颈动脉分离图抗体反应、放血制备血清:最后一次免疫后天放血。在三角瓶中加一些生理盐水放血后室温下放置h左右让血液凝固置℃下过夜(切勿冰冻)析出血清吸取血清离心rpmmin。在无菌条件吸出血清分装(~ml)贮于℃以下冰箱或冻干后贮存于℃冰箱保存。(四)抗体质量的评价、效价:就是指血清中所含抗体的浓度或含量。常用放射免疫法对所有的抗体均适用。某些由大分子抗原所产生的抗体也可用双扩散法测定。前者极为精确而后者粗糙。()放射免疫法:以不同稀释度的抗体与优质标记抗原混合孵育h后测定其结合率。通常以结合率为的血清稀度为效价。()双向扩散法:利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散两者在相交处产生沉淀线以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。中央孔内加适量抗原(容量为mul)周围各孔内分别加入mul:、:、:、:、:及不稀释的抗血清℃下孵育h观察有无沉淀线产生以判断血清的稀释度、特异性或专一性:是指抗体对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。通常以交叉反应率来表示的。、亲合力:是指抗体与抗原结合的活度或牢固度。亲合力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。(五)免疫失败的可能原因及措施()免疫动物的种属及品系是否合适可考虑改变动物的种属或品系或扩大免疫动物的数量。()抗原质量是否良好可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号也可考虑改变抗原分子的部分结构或改进提取方法。()制备的免疫原是否符合要求可从偶联剂、载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑并加以改进。()所用的佐剂是否合适乳化是否完全可改用其它佐剂或加强乳化。()免疫的方法、剂量加强免疫的间隔时间和次数免疫的途径是否合适。()动物的饲养是否得当如营养(饲料、饮水)、环境卫生(通风、采光、温度)是否符合要求动物的健康情况是否良好等。五、免疫血清的保存、℃保存(个月)、低温保存(℃~℃年)、真空干燥保存(~年)注意点:保存前需经除菌保存液含防腐剂避免反复冻融(分装)四、单克隆抗体的制备单抗多抗抗体组成单一复杂抗体性质个体的属性群体综合的性质纯化标记容易效果好难度高一些种属来源绝大多数是小鼠兔子、羊、豚鼠等制备周期长(最短个月)短(个月)制备技术复杂简单经费多少一、杂交瘤技术的原理及流程(一)动物的选择多选用纯种balac小鼠。~周龄g~g体重(二)免疫动物应根据抗原的特性不同而定一般在融合前两个月左右开始免疫。初次免疫:皮下多点注射或脾内注射加福氏完全佐剂W第二次免疫:皮下或腹腔内注射加福氏不完全佐剂W第三次免疫:腹腔内注射不加佐剂。采血测其效价~D加强免疫:腹腔内注射或静脉内注射~WD取脾融合()可溶性抗原免疫原性较弱一般要加佐剂半抗原应先制备免疫原再加佐剂。目前用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化一方面增强了抗原的免疫原性另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂提高机体的免疫应答水平增强免疫细胞对抗原的反应性。()颗粒抗原免疫性强不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例免疫时要求抗原量为~times个细胞。初次免疫timesml腹腔内注射darr~周后第二次免疫timesml腹腔内注射darr周后加强免疫(融合前三天)timesml腹腔内注射或静脉内注射darr取脾融合(二)细胞融合、细胞融合前准备()骨髓瘤细胞系的选择:骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系这样杂交融合率高也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量单抗。最常用骨髓瘤细胞系有:NS、SP/、XAg小牛血清的浓度一般在~细胞浓度以~timesml为宜最大浓度不得超过ml。当细胞处于对数生长的中期时可按:~:的比例传代。每~天传代一次。细胞在传代过程中部分细胞可能有返祖现象应定期用氮鸟嘌呤进行处理。()饲养细胞:在组织培养中单个或少数分散的细胞不易生长繁殖若加入其它活细胞则可促进这些细胞生长繁殖所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系t经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为times或细胞孔。巨噬细胞.细胞融合的步骤()制备饲养细胞层:一般选用小鼠腹腔巨噬细胞与免疫小鼠相同品系的小鼠。()制备免疫脾细胞最后一次加强免疫天后小鼠拉颈处死无菌取脾脏培养液洗一次脾脏研碎过不锈钢筛网离心细胞用培养液洗次计数取脾淋巴细胞悬液备用()制备骨髓瘤细胞取对数生长骨髓瘤细胞离心用无血清培养液洗次计数取得times细胞备用()融合①将骨髓瘤细胞与脾细胞按:或:的比例混合在一起在ml离心管中用无血清不完全培养液洗次离心rpmmin弃上清。轻轻弹击离心管底使细胞沉淀略松动。②s内加入℃预温的ml聚乙二醇溶液边加边轻微摇动。℃水浴作用s。③加℃预温的不完全培养液以终止聚乙二醇作用每隔min分别加入ml、ml、ml、ml、ml和ml。④离心rpm,min。⑤充上清用含小牛血清hat选择培养液重悬。⑥将上述细胞加到已有饲养细胞层的孔板内每孔加mul。⑦将培养板置℃、CO培养箱中培养。聚乙二醇PEG是最常用的细胞融合剂。PEG可能的作用机理:PEG导致细胞膜上脂类物质结构重排使细胞膜易打开而有助于细胞融合。PEG的细胞融合作用完全是随机发生的。一般选用分子量的PEG作为细胞融合剂。不同厂商、批号、分子量的PEG其纯度与毒性有所不同。(三)选择杂交瘤细胞及抗体检测、HAT培养基选择杂交瘤细胞:H(Hypoxanthine,H)次黄嘌呤A(Aminopterin)氨基喋呤叶酸拮抗物阻断DNA合成主要途径T(Thymidine,T)胸腺嘧啶核苷供细胞通过替代途径合成DNA。骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶故不能在hat选择培养液中生长繁殖而杂交瘤细胞具有上述两种酶可以生长繁殖。在用hat选择培养~天内将有大量瘤细胞死亡~天后瘤细胞消失杂交细胞形成小集落hat选择培养液维持~天后应换用ht培养液再维持周改用一般培养液。在上述选择培养期间杂交瘤细胞布满孔底面积时即可开始检测特异性抗体筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间一般每~天换一半培养液。、抗体的检测:检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同选择不同的筛选方法一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。常用的方法有:()放射免疫测定:可用于可溶性抗原、细胞单抗的检测。()酶联免疫吸附试验可用于可溶性抗原、细胞和病毒等单抗的检测。()免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的单抗的检测。()其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。(四)杂交瘤的克隆化是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过hat筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆可能会有数个克隆。原则是对于检测阳性的杂交克隆尽早进行克隆化否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失从而丧失产生抗体的能力。、有限稀释法克隆()克隆前天制备饲养细胞层。()将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干计数。()调整细胞为~个细胞ml。()取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板每孔加入稀释细胞mul。孵育于℃、CO孵箱中。()在第天换液以后每~天换液次。()~天可见细胞克隆形成及时检测抗体活性。()将阳性孔的细胞移至孔板中扩大培养。()每个克隆应尽快冻存。(五)杂交瘤细胞的冻存与复苏及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存则可因上述意外而前功尽弃。(六)单克隆抗体的大量生产大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:()体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞从上清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低一般培养液内抗体含量为~mugml,如果大量生产费用较高。()体内接种杂交瘤细胞制备腹水或血清。①实体瘤法:对数生长期的杂交瘤细胞按~timesml接种于小鼠背部皮下每处注射ml,共~点。待肿瘤达到一定大小后(一般~天)则可采血从血清中获得单克隆抗体的含量可达到~mgml。但采血量有限。②腹水的制备:常规是先腹腔注射mlpristane(降植烷)或液体石蜡于balbc鼠~周后腹腔注射times个杂交瘤细胞接种细胞~天后可产生腹水密切观察动物的健康状况与腹水征象待腹水尽可能多而小鼠频于死亡之前处死小鼠用滴管将腹水吸入试管中一般一只小鼠可获~ml腹水。也可用注射器抽提腹水可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到~mgml这是目前最常用的方法还可将腹水中细胞冻存起来复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。思考题什么是多克隆抗体和单克隆抗体?佐剂具有什么样的性质?如何制备多克隆抗体和单克隆抗体?谢谢!

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

评分:

/82

VIP

意见
反馈

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利