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蛋白质分子基础复习整理笔记.doc

蛋白质分子基础复习整理笔记

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2018-05-30 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《蛋白质分子基础复习整理笔记doc》,可适用于市场营销领域

蛋白质分子基础题型:名词解释个简答题个问答和计算个问答肯定有一题是实验设计有一题是蛋白质一级结构的测定附加题目录第一章绪论氨基酸第二章蛋白质制备第三章蛋白质一级结构测定第四章蛋白质的化学修第五章肽的人工合成第六章蛋白质的分子构象第七章蛋白质的结构与功能关系每章需掌握的知识(PS结合了老师最后一节课的内容但最好不要只按照这个来复习有空一定要看PPT看书否则挂了可不要怪我哦!)第一章绪论氨基酸常见种氨基酸及其疏水性、亲水性、带电性、代号、旋光性、等电点疏水性、亲水性:亲水性(极性R基)不带电荷丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺带电荷(强亲水性)(碱性)带正电赖氨酸、精氨酸、组氨酸(酸性)带负电天冬氨酸、谷氨酸(怀疑PPT的天冬酰胺、谷氨酰胺上打错)疏水性(非极性R基)丙氨酸(R基的疏水性最小)、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸甘氨酸:R基为H可算作疏水性氨基酸又可以划到亲水性氨基酸。甘氨酸的a碳不是手性碳故没有旋光性。不带电荷的极性R基氨基酸:带有OH(Ser、Thr、Tyr)、SH(Cys)、酰胺基(Asn、Gln)代号:甘氨酸  Gly脯氨酸  Pro苏氨酸  Thr天冬氨酸 Asp丙氨酸  Ala苯丙氨酸 Phe半胱氨酸 Cys谷氨酸  Glu缬氨酸  Val酪氨酸  Tyr甲硫氨酸 Met赖氨酸  Lys亮氨酸  Leu色氨酸  Trp天冬酰胺 Asn精氨酸  Arg异亮氨酸 Ile丝氨酸  Ser谷氨酰胺 Gln组氨酸  His名词解释:必需氨基酸:种体内不能合成必须由食物中的蛋白质供给。非必需氨基酸:种只要有氮元素存在人体就能自己制造组成人体蛋白质的重要成份而且保持一定比例。半必需氨基酸:人体合成速度慢,不能满足人体需求。氨基酸的等电点:氨基酸分子中所含的mdashNH和mdashCOOmdash数目正好相等净电荷为时的环境pH值即为氨基酸的等电点简称pI。氨基酸等电点的计算:侧链不带电荷中性氨基酸其等电点是它的pK#和pK#的算术平均值:pI=(pK#pK#)酸性氨基酸:(这个是对于含有个可解离基团的氨基酸来说的可以看下面的方法)pI=(pK#pK#RmdashCOO)碱性氨基酸:(这个是对于含有个可解离基团的氨基酸来说的可以看下面的方法)pI=(pK#pK#RmdashNH)对于含有个可解离基团的氨基酸来说只要依次写出它从酸性经过中性至碱性溶溶解高过程中的各种离子形式然后取两性离子两侧的pK值的算术平均值即可得其pI值。步骤:由PKrsquo值判断解离顺序总是PKrsquoPKrsquoPKrsquohellip即谁的PKrsquo值小谁就先解离。按照解离顺序正确写出解离方程式:简式注意解离基团的正确写法。找出呈电中性的物质其左右PKrsquo值的平均值就是氨基酸的等电点:PI=(PK左rsquoPK右rsquo)举例:半胱氨酸pK(alphaCOO)=pK(RSH)=pK(alphaNH)=该氨基酸pI值为:A  B  C  D  E赖氨酸pK(alphaCOO)=pK(alphaNH)=pK(RNH)=该氨基酸pI值为:  A(pKpK)   B(pKpK)  C(pKpK)  D(pKpKpK)  E(pKpKpK)天冬氨酸pK(alphaCOO)=pK(alphaCOO)=pK(alphaNH)=该氨基酸pI值为:  A   B   C   D   E旋光性:从蛋白质温和水解得到的a氨基酸都是L型的。D丙氨酸存在于昆虫的幼虫和蛹中。D亮氨酸存在于短杆菌肽中。在细菌中发现了许多D型的非蛋白质氨基酸D谷氨酸和D丙氨酸存在与细菌细胞壁的肽聚糖中。甘氨酸的a碳不是手性碳故没有旋光性。光吸收:nm:Tyr、Phe、Trp苯丙Phe的max=nm酪Tyr的max=nm色Trp的max=nm蛋白质的生物学行使的功能:新陈代谢的催化剂酶。有机体的结构成分。储藏氨基酸的功能。运输功能。激素的功能。免疫的功能。接受和传递信息作用功能。调节或者控制功能。第二章蛋白质制备蛋白质分离纯化的一般程序及其注意事项生物组织的机械破碎:研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等(细胞外分泌物无需破碎)。根据蛋白质的特性选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提酸性蛋白用稀碱性溶液抽提脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。离心:去亚细胞颗粒、细胞碎片等粗提:离心除去固体杂质后可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理得到蛋白质粗制品。精制:可用层析法、电泳法等进行精制。结晶:取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。注意事项:动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。制备植物细胞时在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变,它可以吸附多酚化合物。革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化oC处理分钟即可溶解细胞壁。革兰氏阴性菌较难消化。可先用非离子去污剂(如TritonX)、巯基乙醇或甘油处理细胞。在溶液中还可加入脱氧核糖核酸酶I(ugmL)可以使溶液的黏度降低可以提高抽提液的质量。膜蛋白的释放:外周蛋白通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。占膜蛋白的~内在蛋白(固有蛋白)嵌合在膜脂双层结构中。大部分膜蛋白是固有蛋白外周蛋白的分离:改变离子强度金属螯合剂(EDTA)可将其抽提出来内在蛋白的提取:提取的原则抽提膜蛋白时首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合同时保持疏水基暴露在外的天然状态。此过程叫做增溶作用。常用的增溶剂是去污剂它可以使膜蛋白疏水部分与膜分离同时保留住膜蛋白表面的疏水结构。用去污剂增溶之后膜蛋白要用透析的方法除掉去污剂再进行其他方法的分离纯化。盐析的概念是一种向蛋白质溶液中加入浓的盐溶液使蛋白质变性的方法。盐溶:一般在低盐浓度下随着盐浓度升高蛋白质的溶解度增加。盐析:当盐浓度继续升高时蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出。原因:将大量盐加到蛋白质溶液中高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO和NH)有很强的水化力可夺取蛋白质分子的水化层使之ldquo失水rdquo于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出,导致蛋白质分子的沉淀。课件重点补充:膜蛋白破碎的主要方法:膜蛋白的释放上面有。蛋白质脱盐:透析法(注:用前在含EDTA的溶液中煮除去核酸酶和蛋白酶)纤维过滤透析法中空纤维超滤膜分子筛层析法SephadexG蛋白质浓缩:沉淀法:用盐析法或者有机溶剂法将蛋白质沉淀再将沉淀溶于少量溶液中吸附到离子交换柱上然后用少量盐洗脱干燥吸附法:用固体吸附剂如SephadexG等冻干法真空干燥法渗透浓缩法:将干粉PEG涂在装有蛋白质溶液的透析袋上可吸干水分超滤浓缩法:用超滤膜滤去小分子和水达到超滤的目的。使蛋白质沉淀的主要方法及其原理(重点:盐析方法)盐析法(上面有)有机溶剂法:原理:增大带电质点之间的静电力。破坏蛋白质表面的水合层使蛋白质分子脱水而沉淀。有机聚合物沉淀法(作用原理与有机溶剂类似)选择性变性沉淀法:适用于提取一些耐极端环境的蛋白质。用一些极端条件使非目标蛋白质变性析出从而将目的蛋白质纯化。主要方法有:热变性pH变性(包括等电电变性)有机溶剂变性。非特异性层析的原理、方法(如何平衡、如何吸附、如何洗脱hellip)吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析离子交换层析原理:根据蛋白质分子所带电荷的不同来达到分离的目的解离离子带负电结合阳离子(蛋白质分子)称为阳离子交换柱。解离离子带正电结合阴离子(蛋白质分子)称为阴离子交换柱。步骤:(处理介质装柱上样洗涤洗脱介质再生)方法:平衡:电荷量越大,结合越牢,在柱中移动速度越慢电荷不同,亲和力不同洗脱:带电蛋白质分子与交换剂的结合可逆。通常,用盐梯度和pH梯度可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来其他:离子交换的支持物纤维素:具有松散的亲水性网络,较大的的表面积、吸附容量大通透性好。葡聚糖凝胶:既有离子交换剂的性质又有分子筛效应。琼脂糖凝胶:吸附容量大能维持较好的流速和分辨率。习题:三个氨基酸(Leu,Asp,Lys)的混合物经过一个阳离子交换树脂粒用pH的缓冲液洗脱洗脱液中氨基酸出现的顺序是A.Asp,Leu,LysB.Leu,Asp,LysC.Lys,Leu,AspD.Leu,Lys,Asp解:Leu,Asp,Lys》》》AspLeuLys自己做的不知道对不对习题:有以下种蛋白质的混合物:()pI=()pI=()pI=()pI=若不考虑其它因素当它们流过DEAE纤维素阴离子交换柱用线性盐梯度洗脱时,这些蛋白质的洗脱顺序如何并具体说明其原因。答案:在离子交换柱上带更多负电的吸附能力更强。四种蛋白质PI值的顺序为。因此在某种pH值下所带电荷由正到负的顺序为。因此洗脱出现的先后顺序就是。凝胶过滤层析原理:根据分子量的大小不同而达到分离的目的。载体是一种多孔的凝胶。分子直径比凝胶孔径大的分子,不能进入凝胶颗粒的微孔中,其他分子由大到小先后从凝胶中流出。疏水层析(吸附层析)原理:根据蛋白质分子疏水性的不同而达到蛋白质分离的目的。在不带电的载体上偶联上疏水基团形成疏水吸附剂将带有非极性的生物活性物质吸附在一起然后改变层析条件减弱疏水作用将吸附物质解离下来。洗脱:改用低浓度的盐降低离子强度加乙二醇。在洗脱也中加去污剂增加洗脱pH。从高到低的NaCl浓度梯度洗脱或由高到低的盐浓度加由低到高的乙二醇浓度梯度洗脱。注意:离子交换:低盐吸附高盐洗脱疏水层析:高盐吸附低盐洗脱亲和层析的原理、步骤、作用力、专一性洗脱、非专一性洗脱原理:根据特定蛋白质对某种的生物专一性来进行分离。作用力:专一性亲和力在一定条件下紧密地形成复合物。步骤:?洗脱:非专一性洗脱改变缓冲液的离子强度或者pH或者介电系数。使吸附的大分子的构象发生改变以降低其与配体之间的亲和力将吸附的大分子从层析柱上洗脱下来。专一性洗脱选用与配体结合能力更大物质的洗脱液。eg底物配体:底物类似物、酶抑制剂等几种特殊的亲和层析:免疫亲和层析:根据生物大分子的抗原决定部位与其抗体的结合部位之间专一性相互作用进行层析的技术。共价亲和层析:层析材料进与样品中的一个成分发生专一性共价反应使其保留在层析材料上。分离过程是依靠共价键的形成和断裂来实现的。固定化金属离子亲和层析:利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用结合在固定相上二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法称之为金属螯合层析。实验设计(如何用亲和层析分离纯化蛋白酶)、前处理:①去脂肪、结缔②加酸化水捣碎③匀浆提取④过滤滤液调pH⑤过滤滤液调pH激活⑥调至pH过滤保存、配体:①粗提鸡卵类粘蛋白②离子交换层析精分离③透析除盐④析出干燥、亲和层析:①抑制剂(鸡卵类粘蛋白)偶联至载体(凝胶)②装柱③上样④洗脱附参考资料:亲和层析法纯化胰蛋白酶操作步骤(一)载体mdashSePharoseB的活化.环氧氯丙烷活化法:取适量的sepharoseB于Gmdash玻璃烧结漏斗(简称Gmdash漏斗)上抽去保护液。称g(湿重)SepharoseB用mLmolL氯化钠溶液淋洗除去PharoseS凝胶内的保护剂用蒸馏水洗净转移到mL的锥形瓶内。然后加入mLmoL/L氢氧比钠溶液、mL环氧氯丙烷、mL%二氧六环于℃的恒温水浴摇床内振荡活化小时。然后将活化的凝胶转移到G漏斗内抽干用蒸馏水洗至pH左右再用mLmolLpH碳酸钠缓冲液淋洗。处理完毕后立即偶联。.溴化氰活化法:称取gSepharoseB(湿重)凝胶处理方法与相同把SePharoseB凝胶转移到一个mL的烧杯中(以下操作步骤必须在通风橱内进行)。加入mLmolLpH的碳酸钠缓冲液然后将烧杯放置冰浴中用电磁搅拌器慢慢搅拌。戴上胶皮手套小心称取g溴化氰加入mL乙腈将溴化氰溶解。取一支滴管向烧杯内滴加溴化氰使它与SepharoseB反应同时取另一支滴管向烧杯内滴加molL的氢氧化钠.使反应体系的pH值保持在pH左右(在酸度计上校正)待溴化氰加完以后继续搅拌反应分钟。此时反应体系的pH值不再下降仍维持在pH左右停止反应。迅速转移到G漏斗内抽滤抽滤瓶内应预先加入一定量的固体硫酸亚铁以破坏滤液中未反应的溴化氰。用mL预冷的蒸馏水淋洗最后浸泡在mLmolLpH碳酸钠缓冲液中处理完成后立即偶联。.配基mdash鸡卵类粘蛋白的偶联:将已经活化处理好的SepharoseB转移到一个mL的锥形瓶内。然后取ImLmolLpH的碳酸钠缓冲液将约mg的鸡卵类粘蛋白溶解取出mL蛋白溶液稀释倍在紫外分光光度仪上测定A。根据消光系数A=计算出偶联前的蛋白含量。再将mL蛋白溶液加入到盛有活化SepharoseB的三角瓶内混匀在-℃的恒温水浴摇床内振荡偶联-小时左右终止偶联。将凝胶转移到G漏斗内用mLmolL的氯化钠溶液抽浊、淋洗以除去未被偶联的鸡卵类粘蛋白。取一个干净的抽滤瓶收集滤波测定滤液A计算出末被偶联蛋白的量然后用mL的蒸馏水洗用mLmolL甲酸-molL氯化钾pH甲酸混合液洗最后用蒸馏水洗至约pH即可。将凝胶转移至mL小烧杯内用mLmolL氯化钾mdashmolL氯化钙molL、pHTrismdashHCL缓冲液浸泡分钟。脱气后装柱或置℃冰箱保存。(二)胰蛋白酶粗操液的制备取g猪新鲜胰脏(除去脂肪和结缔组织)剪碎置于高速组织捣碎机内加入mL预冷的pH~的乙酸酸化水匀浆。于℃提取小时以上层纱布过滤收集滤液并用molL的氢氧化钠调至PH加入终浓度为molL氯化钙及~mg胰蛋白酶晶种置℃激活~小时或在室温(℃左右)激活~小时。待胰蛋白酪比活达到~BAEE单位/mg以后用molL硫酸调至pH停止激活。放置℃冰箱内备用。测定胰蛋白酶活性。(三)亲和层析纯化胰蛋白酶取一支层析柱(mmtimesmm)装入少量亲和柱平衡液(molL氯化钾mdashmolL氯化钙molLpHTrismdashHCl缓冲液)将亲和吸附剂一次装入柱内待亲和吸附剂自然沉降至约总体积后调节合适的流速。用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液.待基线达到稳定后即可。取一定体积的蛋白酶粗提液(-mL视酶液的蛋白浓度及比活而定)调至pH.用滤纸过滤取滤液上柱吸附然后用亲和柱平衡液平衡。用核酸蛋白质检测仪检测流出液待基线达到稳定后改用亲和柱洗脱液(molL甲酸mdashmolL氯化钾pH混合液)洗脱。收集洗脱峰测定酶蛋白含量及活性层析图谱如图mdash。图mdash亲和层析纯化胰蛋白酶洗脱曲线平衡液:molL氯化钾molL氯化钙molLpHTrisHCl缓冲液。洗脱液:molL甲酸molL氯化钾pH混合液。(四)胰蛋白酶的保存经亲和层析分离得到的胰蛋白酶一般是比较纯的酶但是酶蛋白的浓度往往很低。通常可用pH的乙酸透析除去溶液中的无机盐然后冰冻干燥成粉末长期保存。也可将酶溶液放在-℃的冰箱冰冻保存或者在℃pH的酸性溶液中保存可保存两年左右。蛋白质电泳的牵引力(迁移率)与什么有关系蛋白质分子的性质:分子的电荷、大小和形状。电场:与电流和电压成正比。缓冲液和离子强度:缓冲液离子强度增大样品所带电荷降低样品的泳动速度会减缓。支持介质:纸的吸附作用最大醋酸纤维素吸附作用较小。为什么SDSPAGE电泳只与蛋白质的分子量有关系在蛋白质中加入摩尔比为:(SDS:蛋白质)的SDS(十二烷基硫酸钠)。使所有蛋白质都带上负电。SDS是阴离子去污剂能与蛋白质的疏水部分结合并且把大部分蛋白质拆成组成他的亚基形式。在上样缓冲液中加入巯基乙醇可以使二硫键还原为巯基。使不同的蛋白质分子的短轴一致长轴与蛋白质的分子量成正比。SDSPAG中蛋白质电泳的速度不再取决于蛋白质的电荷与形状只与蛋白质的分子量有关。自己补充:PAGE根据其有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同带电颗粒在电场作用下主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分pH凝胶浓度及电位梯度的不连续性带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应分子筛效应还具有浓缩效应因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。注意:电泳结果显示的只是亚单位的大小同时蛋白质也会失去原来的活性。有些蛋白质不能用SDSPAGE测定分子量(某些糖蛋白以及一些结构蛋白如胶原蛋白)种电泳(等电聚集电泳、双向电泳、免疫印迹法)的概念等电聚集电泳(精细适用分析鉴定抵消扩散使富集不适用于等电点处沉淀变性蛋白)书上:利用某些两性电解质支持物在电场中形成pH梯度使蛋白质样品在与它们等电点相应的pH区域集中等电点不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDSPAGE组成第一向使等电点不同的蛋白得到分离第二向使分子量不同的蛋白得到分离两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。免疫印迹法蛋白质转移到膜上然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白可用相应抗体作为一抗进行检测对新基因的表达产物可通过融合部分的抗体检测。蛋白质结晶的原理以及其与盐析有何区别原理:蛋白质溶液在合适的过饱和状态溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形式可以形成晶核。溶质分子以相互碰撞的作用方式有序而反复地堆砌在晶核上直到晶核成长到晶体最后从溶液中析出。与盐析有何区别:蛋白质的结晶无选择性要求纯度高对其他条件相对要求多反复结晶目的是纯化盐析也是利用蛋白质结晶的原理但是其目的主要是用于分离蛋白质且要求蛋白质浓度不能过高否则容易出现多种蛋白质共沉淀。个人补充:蛋白质的定量定氮法测量蛋白质含量:蛋白质含量(每克)=每克生物样品中含氮的克数X双缩脲法:双缩脲反应形成紫色或紫红色的络合物nm处进行比色测定。(此反应为肽及蛋白质特有的而为氨基酸所没有的一个颜色反应)紫外吸收法(略)蛋白质的纯度标准的检测电泳、层析、蛋白质化学结构分析等第三章蛋白质一级结构测定蛋白质一级结构测定的基本方法和基本策略一级结构(序列)测定的基本方法:将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。再将不同方法得到的序列进行比对就可以得到肽链的一级结构。序列测定一般步骤:纯度要求:纯度在以上。双向电泳凝胶电泳N末端测定纯化至恒定酶活肽谱分析。分子量测定多肽链的组成二硫键的断裂。蛋白质的氨基酸的组成。蛋白质的配基蛋白质的端基分析进行正常的序列测定蛋白质的水解:酸水解:Trp被沸酸完全破坏有OH的Ser或Thr小部分被分解Asn和Gln侧链的酰胺基rarrCOOH不容易引起水解产物的消旋化。碱水解:水解产物发生消旋化许多氨基酸都受到不同程度的破坏Trp在水解中不受破坏。磺酸水解:环境需中性条件苛刻水解液碳水化合物较多时色氨酸易被破坏中性水解液可以直接上机色氨酸稳定。酶水解:水解不稳定的氨基酸不容易彻底水解酶自溶污染产物。序列检测:生化上的浓缩笔记hellip有的浓缩得我自己也看不懂了hellip除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水中。脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。除甘氨酸外alpha氨基酸都有旋光性alpha碳原子具有手性。苏氨酸和异亮氨酸有两个手性碳原子DNFB反应N末端产物黄色紫外吸收:F:nm,epsilon=(丙)Y:nm,epsilon=(酪)W:nm,epsilon=(色)氨基酸与茚三酮在微酸溶液加热,生成蓝色物质,而脯氨酸生成黄色化合物DNSCl反应生成DNS氨基酸有强荧光激发波长在nm异硫氰酸苯酯PITC法剩下的肽链完整可重复测定新生的N末端氨基酸肼解法:无水加热,断所有肽键,除C端氨酸外,精变鸟半胱天冬谷氨破坏羧肽酶法:羧肽酶A水解除精赖脯外所有肽键,羧肽酶B水解精赖拆二硫键:过量巯基乙醇再碘乙酸保护生成的半胱氨酸的巯基防再氧化胰蛋白酶:赖精氨酸的羧基肽键生成肽段C末端是赖或精氨酸。丫丙啶可增加酶切位点(半胱氨酸)用马来酸酐(顺丁烯二酸酐)保护赖氨酸的侧链氨基或用,环己二酮修饰精氨酸的胍基可减少酶切位点。糜蛋白酶:苯丙酪色氨酸等疏水残基的羧基形成的肽键溴化氰:断裂甲硫氨酸的羧基肽键甲硫氨酸残基变为C末端高丝氨酸残基胃蛋白酶:疏水残基之间的肽键嗜热菌蛋白酶:疏水残基的氨基形成的肽键金葡菌蛋白酶谷氨酸蛋白酶V蛋白酶:谷氨酸天冬氨酸的羧基形成的肽键受缓冲液影响:醋酸缓冲液中只水解谷氨酸,磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸梭状芽孢杆菌蛋白酶:精氨酸羧基形成的肽键又称精氨酸蛋白酶。凝血酶:ArgGly肽键羟胺:AsnGly,但AsnLeu和AsnAla也能部分裂解以上方法中酶不能水解脯氨酸参与形成的肽键。引文:以下供额外阅读理解三、一级结构的测定(一)一级结构蛋白质的一级结构是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序。氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础它决定蛋白质的高级结构。一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示从N末端向C末端书写。采用三字母符号时氨基酸之间用连字符(-)隔开。(二)测定步骤测定蛋白质的一级结构要求样品必须是均一的(纯度大于%)而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是:通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。将每条肽链分开并分离提纯。肽链的一部分样品进行完全水解测定其氨基酸组成和比例。肽链的另一部分样品进行N末端和C末端的鉴定。拆开肽链内部的二硫键。肽链用酶促或化学的部分水解方法降解成一套大小不等的肽段并将各个肽段分离出来。测定每个肽段的氨基酸顺序。从第二步得到的肽链样品再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段其断裂点与第五步不同。分离肽段并测序。比较两套肽段的氨基酸顺序根据其重叠部分拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。(三)常用方法末端分析()N末端蛋白质的末端氨基与,二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质(DNP蛋白质)。产物黄色可经受酸性℃高温。水解时肽链断开但DNP基并不脱落。DNP氨基酸能溶于有机溶剂(如乙醚)中这样可与其他氨基酸和epsilonDNP赖氨酸分开。再经双向滤纸层析或柱层析可以鉴定黄色的DNP氨基酸。丹磺酰氯法是更灵敏的方法。蛋白质的末端氨基与(二甲胺基)萘磺酰氯(DNSCl)反应生成DNS蛋白质。DNS氨基酸有强荧光激发波长在nm左右比DNFB法灵敏倍。目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯(PITC)法。末端氨基与PITC在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气液色谱法进行鉴定。这个方法最大的优点是剩下的肽链仍是完整的可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸。现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪可测定含个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。缺点是不如丹磺酰氯灵敏可与之结合使用。N末端氨基酸也可用酶学方法即氨肽酶法测定。()C末端a)C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的alpha氨基醇。肽链水解后再用层析法鉴定。有断裂干扰。b)另一个方法是肼解法。多肽与肼在无水条件下加热可以断裂所有的肽键除C末端氨基酸外其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。c)也可用羧肽酶法鉴定。将蛋白质在pH,℃与羧肽酶一起保温按一定时间间隔取样用纸层析测定释放出来的氨基酸根据氨基酸的量与时间的关系就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。二硫键的拆开和肽链的分离一般情况下蛋白质分子中肽链的数目应等于N末端氨基酸残基的数目可根据末端分析来确定一种蛋白质由几条肽链构成。必须设法把这些肽链分离开来然后测定每条肽链的氨基酸顺序。如果这些肽链之间不是共价交联的可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质把肽链分开。如果肽链之间以二硫键交联或肽链中含有链内二硫键则必须用氧化或还原的方法将二硫键拆开。最普遍的方法是用过量的巯基乙醇处理然后用碘乙酸保护生成的半胱氨酸的巯基防止重新氧化。二硫键拆开后形成的个别肽链可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行分离。肽链的完全水解和氨基酸组成的测定。在测定氨基酸顺序之前需要知道多肽链的氨基酸组成和比例。一般用酸水解得到氨基酸混合物再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪-小时即可完成。蛋白质的氨基酸组成一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质其氨基酸组成相差很大。肽链的部分水解和肽段的分离当肽链的氨基酸组成及N末端和C末端已知后随后的步骤是肽链的部分水解。这是测序工作的关键步骤。这一步通常用专一性很强的蛋白酶来完成。最常用的是胰蛋白酶(trypsin)它专门水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键所以生成的肽段之一的C末端是赖氨酸或精氨酸。用丫丙啶处理可增加酶切位点(半胱氨酸)用马来酸酐(顺丁烯二酸酐)保护赖氨酸的侧链氨基或用,环己二酮修饰精氨酸的胍基可减少酶切位点。经常使用的还有糜蛋白酶水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的羧基形成的肽键。其他疏水残基反应较慢。用溴化氰处理可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。以上三种方法经常使用。胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。前者水解疏水残基之间的肽键后者水解疏水残基的氨基形成的肽键。金葡菌蛋白酶又称谷氨酸蛋白酶或V蛋白酶水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键但受缓冲液影响。在醋酸缓冲液中只水解谷氨酸在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。梭状芽孢杆菌蛋白酶水解精氨酸羧基形成的肽键又称精氨酸蛋白酶。耐变性剂可经受M尿素小时。可用于水解不易溶解的蛋白。凝血酶水解ArgGly肽键。羟胺可水解AsnGly但AsnLeu和AsnAla也能部分裂解。以上方法中酶不能水解脯氨酸参与形成的肽键。多肽部分水解后降解成长短不一的小肽段可用层析或电泳加以分离提纯。经常用双向层析或电泳分离再用茚三酮显色所得的图谱称为肽指纹谱。多肽链中氨基酸顺序的测定从多肽链中部分水解得到的肽段可用化学法或酶法测序然后比较用不同方法获得的两套肽段的氨基酸顺序根据它们彼此重叠的部分确定每个肽段的适当位置拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。二硫键位置的确定一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段再拆开二硫键将两个肽段分别测序再与整个多肽链比较即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶因其专一性低生成的肽段小容易分离和鉴定而且可在酸性条件下作用(pH)此时二硫键稳定。肽段的分离可用对角线电泳将混合物点到滤纸的中央在pH进行第一次电泳然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转度后在相同条件下进行第二次电泳多数肽段迁移率不变处于对角线上而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色分离测序与多肽链比较即可确定二硫键位置。以上供额外阅读理解几种酶切分别从哪切排序N末端的测定:★sanger反应(DNFB法)★Edman反应(PITC法)丹磺酰氯(DNS)法氨肽酶法(略)封闭的N端测序:末端为Gln的蛋白质发生环化反应生成焦谷氨酸酰基衍生物此衍生物可用焦谷氨酸特异性地裂解焦谷氨酰N末端释放出少一个Gln的肽。释放的肽可用Edman等方法等正常方法测定。C末端分析:a)肼解法:精氨酸会变成鸟氨酸半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。b)还原法:硼氢化锂还原剂c)★羧肽酶法(最有效、常用):羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有C末端肽键羧肽酶B水解碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸为C末端的肽键。(最有效最常用的测C端殘基方法性质:肽链外切酶专一地从肽链的C端逐个降解释放出游离氨基酸)肽链的专一性水解及肽片段的分离纯化化学裂解法溴化氰断裂:可断裂甲硫氨酸的羧基(CH)形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。羟胺断裂:专一性断裂mdashAsn-Glymdash之间的肽键★酶解法胰蛋白酶酶切法:专门水解赖氨酸和精氨酸的羧基COOH形成的肽键(用丫丙啶处理可增加酶切位点(半胱氨酸)用马来酸酐(顺丁烯二酸酐)保护赖氨酸的侧链氨基)糜蛋白酶:水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的羧基COOH形成的肽键。胃蛋白酶:水解疏水残基之间的肽键(Phe、Leu、Trp、Tyrhellip)嗜热菌蛋白酶:水解疏水残基的氨基形成的肽键(Leu、Ile、Phe、Val、Trp、Tyr、Met)肽段的氨基酸顺序测定之Edman化学降解法(PITC法)步骤:第一步:偶联反应第二步:环化断裂反应第三步:转化反应肽段在多肽链中次序的决定:肽谱重迭法:从不同方法断裂所得到的肽段中重叠的部分着手得到肽的氨基酸序列。二硫键的确定(暂未整理)(还是觉得老师讲起来有点简单最重要的还是是如何根据题意得出蛋白质序列。相关的知识内容应该在书的PN末端的测定、PC末端的测定、P溴化氢裂解、P表一定要多做几道例题)PPT例题:有一个十肽N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val。糜蛋白酶水解AlaPheGlyLysAsnTyrArgTrpHisVal胰蛋白酶水解AlaPheGlyLysAsaTyrArgTrpHisVal答案:得到蛋白质的序列为:AlaPheGlyLysAsnTyrArgTrpHisValPS:书上P第题也是同类型的题其答案为AlaLysArgValTyrGluGly由下列信息求八肽的序列。(a)酸水解得AlaArgLeuMetPheThrVal(b)Sanger试剂处理得DNPAla。(c)胰蛋白酶处理得AlaArgThr和LeuMetPheVal。当以Sanger试剂处理时分别得到DNPAla和DNPVal。(d)溴化氰处理得AlaArg高丝氨酸内酯ThrVal和LeuPhe当用Sanger试剂处理时分别得DNPAla和DNPLeu。答:AlaThrArgValValMetLeuPhe一个含有个氨基酸残基的十三肽的氨基酸组成为:Ala,Arg,Asp,Glu,Gly,Leu,Val。部分酸水解后得到以下肽段其序列由Edman降解确定试推断原始寡肽的序列。(a)AspGluValGlyGlyGluAla(b)ValAspValAspGlu(c)ValAspVal(d)GluAlaLeuGlyArg(e)ValGlyGlyGluAlaLeu(f)LeuGlyArg答:该肽链的序列可以通过将肽片段的相同序列重叠排列起来获得整个序列ValAspValAspGluValGlyGlyGluAlaLeuGlyndashArg第四章蛋白质的化学修蛋白质化学修饰的原理化学修饰:凡通过化学基团的引入或除去而使蛋白质共价结构发生改变的现象。选择性化学修饰:肽链侧链基团被化学试剂专一性修饰蛋白质侧链上可被修饰的功能基团有:()氨基、羧基()羟基、巯基()精氨酸胍基、组氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、甲硫氨酸甲硫基、(酪氨酸酚基)。注:()碱性氨基酸(种)和酸性氨基酸(种)都是强极性,可被化学修饰()含羟基(Ser,Thr,Tyr)和巯基的氨基酸(Cys)可被化学修饰()色氨酸和甲硫氨酸可被化学修饰影响蛋白质化学反应进程的因素:  .蛋白质功能基的反应性微区的极性:微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。局部的极性改变对色氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸影响较小对氨基和组氨酸反应性影响较大对含羟基和巯基的氨基酸反应性影响最大。氢键效应:天然蛋白质通过氢键维持其稳定性。静电效应位阻效应  .修饰剂的反应性选择吸附:化学修饰前修饰剂根据各自的特点选择性吸附在低或高极性区域形成蛋白质修饰剂复合物。静电相互作用位阻因素催化因素:酸碱催化作用局部环境的极性修饰反应的专一性控制修饰试剂的选择根据:()修饰的目的:Eg改变蛋白质的带电状态或溶解性引入大电荷量的试剂()便于定量()试剂的体积要小反应条件的选择:温度、pH要求:()不造成蛋白质的可逆变性()便于专一性修饰蛋白质蛋白质化学修饰的作用(化学修饰的应用)用来测定蛋白质分子中某一种氨基酸的数量在蛋白质序列分析中的应用:用于测定蛋白质及多肽化学结构的许多方法都是以蛋白质化学修饰为基础的。()控制酶解程度()化学裂解:溴化氰专一性裂解Met羧基所形成的肽键蛋白质中二硫键的裂解。在杂交实验中的应用在研究蛋白质高级结构中的应用()能与试剂作用的都处于蛋白质表面不能与试剂作用的基团则处于埋藏状态或参与次级键的形成()研究蛋白质在溶液中的构象。侧链基团与修饰剂的反应性可反映基团所处的环境引入萤光基团可以了解这些基团的环境指示构象的变化。()制备重原子的蛋白质衍生物。对蛋白质晶体分析非常有用。()测定蛋白质分子特定基团之间的距离。通过双功能试剂对多肽链交联来实现。确定氨基酸残基的功能化学修饰结合保护实验可研究底物或其它配位体对修饰速度和程度的影响。eg磷酸吡哆醛修饰果糖磷酸激酶发现两个Lys被修饰酶活力失去果糖二磷酸存在时可急剧减弱修饰作用保护激酶活力说明Lys对酶活力有重要影响。在蛋白质免疫化学研究中的应用放射免疫技术广泛应用于蛋白质、多肽的检测和定量。优点:灵敏度非常高名词解释亲和标记:利用酶和底物的亲和性用与酶底物类似的修饰剂对酶活性部位上的AA残基进行共价标记。亲和标记:对酶的活性部位、受体的结合位点进行特异标记的方法。试剂AX的A基团和X基团可分别与不同的位点进行结合,从而将两种物质交联在一起。如用亲和标记法分离细胞表面受体时,先将细胞与超量标记的激素(配体)混合,以饱和所有特异受体的激素结合位点洗去多余的激素,然后加入能够与受体和配体结合的共价交联剂将激素与受体进行共价交联达到分离的目的。(网上的考研笔记)亲和标记:借助亲和作用对目的分子进行标记的方法。多用于对蛋白质(如酶、抗体等)的标记。先将能与蛋白质亲和的分子(如底物、抗原等)与目的蛋白活性部位特异性、非共价键、可逆性结合再通过具体的化学反应使亲和分子上的活性基团共价结合到活性部位附近的氨基酸残基上。(百度百科定义)第五章肽的人工合成液相合成多肽的原理、方法(个步骤)及其优缺点多肽合成仪是以固相合成技术发展来的固相合成多肽的步骤、原理及其优缺点注:详见第六章末。第六章蛋白质的分子构象名词解释二级结构:是指由多肽链组成的主链骨架形成的构象。它是由氢键维持的局部的有规则的构象。主要组成形式有:alpha螺旋(右手螺旋)、beta折叠、beta-转角等。反平行式比平行的折叠更稳定。三级结构:是由多肽链通过盘旋、折叠而形成的紧密的、借助各种次级键而维持的球状构象。四级结构:多亚基蛋白质的三维结构。实际上是具有三级结构多肽(亚基)以适当方式聚合所呈现的三维结构。(考研笔记如是说)有的蛋白质由多条肽链组成每条肽链称为亚基亚基之间又有特定的空间关系称为蛋白质的四级结构。(PPT如是说)多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。四级结构具有的优越性(略:蛋白质化学蛋白质的分子构象P)个人补充:一级结构的立体结构原理蛋白质分子中各多肽链的氨基酸残基序的排列顺序共价键:二硫键、肽键什么叫肽平面(肽单位平面结构)在蛋白质或者多肽当中连接两个氨基酸的肽键是一个部分双键不能自由旋转因此肽单位上的六个原子:前后两个alpha碳原子、NH和C=O在CN位于一个刚性平面上形成稳定的反式构性它造成多肽链折叠的空间限制的因素之一。什么叫结构域在一个蛋白质分子或亚基中多肽链常折迭成二个或几个紧实的局部单位这些彼此分隔的单位多为紧密的球状构象、彼此分开并由松散的肽链相连这些结构称为结构域。什么叫球蛋白一类不溶或微溶于水可溶于稀盐溶液的单纯蛋白质维持二级结构、三级结构、四级结构的主要作用力及其它作用力是什么二级结构:氢键稳定三级结构的作用力:疏水侧链聚集在一起的疏水作用带正电和带负电的侧链会发生静电吸引产生离子键羰基氧和亚氨基氢原子等相互作用产生的氢键两个半胱氨酸的侧链SH生成的二硫键。四级结构:次级键(疏水作用、氢键、范德华引力)蛋白质构象研究的方法(主要为固相和液相)简答题固相合成技术原理:  把要合成的肽链的末端氨基酸的羧基以共价键的形式与不溶性(固相)高分子树脂(如氯甲基化的聚苯乙烯小球)相连形成高分子树脂为酯基的氨基酸酯另一氨基保护的氨基酸与之反应形成肽键脱去氨基保护再与另一个氨基保护的氨基酸反应形成第二个肽键重复上述操作形成第三个第四个helliphellip肽键最后从固相上断裂下来合成的多肽链得到纯净的多肽。步骤:)是把第一个氨基酸接到树脂上)是脱去NH保护基)是形成第一个肽键即接上第二个氨基酸)脱去连在树脂上的二肽的NH保护基重复)、))步操作接上第三个氨基酸第四个氨基酸helliphellip最后用无水HF断下高分子得到多肽。优点:()操作简单每步产率高()分离纯化过程无中间产物损失()容易实现自动化。多肽液相合成:繁杂要求有旋光性的alpha氨基酸按一定顺序连接起来又要保持旋光性不变。步骤:()alpha氨基和alpha羧基以及侧链基团的保护()羧基的活化和形成肽键()脱保护基和钝化。固液相合成的比较:相同点:专一性合成多肽不同点:合成顺序不一样脱保护时间不一样纯化过程固相比液相简单固相比液相容易实现自动化多肽中有肽键存在易发生各种反应如水解、氨解等这就要求合成条件必须缓和也就要对参与反应的氨基、羧基进行ldquo活化rdquo使反应容易进行有多个NH和COOH存在可能同时参加反应这就要求把不需要参加反应的NH和COOH暂时ldquo保护rdquo起来只留下参加反应的NH和COOH。保护氨基:常用氯甲酸苄酯保护因为反应后氨基上的苄氧羰基很容易用催化加氢的方法解除保护。活化羧基:常使COOH转化成酰氯酸酐或酯增强COOH中C原子上的正电性利于NH的亲核反应。PS:我觉得超二级结构老师好像是没讲的第七章蛋白质的结构与功能关系论述蛋白质结构与功能的关系(切入角度:、一级结构为构象的基础、构象决定功能)蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质特定的功能都是由其特定的构象所决定的各种蛋白质特定的构象又与其一级结构密切相关。一部分氨基酸残基直接参与构成蛋白质的功能活性区它们的特殊侧链基团即为蛋白质的功能基团这种氨基酸残基如被置换都会直接影响该蛋白质的功能另一部分氨基酸残基虽然不直接作为功能基团但它们在蛋白质的构象中处于关键位置这种残基一旦被置换就会影响蛋白质的构象从而影响蛋白质的活性一级结构不同的各种蛋白质它们的构象和功能自然不同反之一级结构大体相似的蛋白质它们的构象和功能也可能相似举例:来源于不同动物种后的胰岛素它们的一级结构不完全一样但其组成的氨基酸总数或排列顺序却很相似从而使其基本构象和功能相同。蛋白质特定的构象显示出特定的功能构象决定功能别构效应(别位效应、变构效应):当某种小分子物质特异地与某种蛋白质(或酶)结合后(结合部位多在远离活性部位的另一部位通常称为别位)能够引起该蛋白质(或酶)的构象发生微妙而规律的变化从而使其活性发生变化(活性可以从无到有或从有到无也可以从低到高或从高到低)这种现象称为别构效应。别构效应充分说明了构象与功能活性之间的密切关系。活性蛋白质与前体激素与激素原:胰岛素与前体调节生理功能酶与酶原:胰蛋白酶与酶原信号肽蛋白质的变性变性是指在一些物理或化学因素作用下使蛋白质分子空间结构破坏从而引起蛋白质理化性质改变包括结晶性能消失。蛋白质溶液粘度增加呈色反应加强及易被消化水解等尤其是溶解度降低和生物活性丧失的过程。蛋白质变性的机理是分子中非共价键断裂使蛋白质分子从严密且有序的空间结构转变成杂乱松散、无序的空间结构因此生物活性也必然丧失同时由于蛋白质变性后分子内部的疏水基团暴露到了分子的表面因此其溶解度降低、容易沉淀析出。变性的蛋白质大多沉淀但沉淀的蛋白质在蛋白质分离纯化中并不是变性的。血红蛋白的结构和功能血红蛋白(Hb)就是一种最早发现的具有别构效应的蛋白质它的功能是运输氧和二氧化碳Hb运输O的作用是通过它对O的结合与脱结合(释放)来实现的。Hb有两种能够互变的天然构象。一种叫紧密型(T型)另一种叫松弛型(R型)。T型对O的亲和力低不易与O结合R型则相反它与O的亲和力高易于结合O。T型Hb分子的第一个亚基与O结合后即引起其构象开始变化将构象变化的ldquo信息rdquo传递至第二个亚基使第二、第三和第四个亚基与O的亲和力依次增高Hb分子的构象由T型转变成R型。Hb随红细胞在血循环中往返于肺及其他组织之间随着条件的变化Hb的T型与R型不断互变:在肺部毛细血管内O分压很高促使T型转变为R型利于Hb饱和地ldquo装载rdquoO在全身组织毛细血管中O分压较低R型Hb又转变为T型有利于释放O。Hb分子两型构象的互变引起结合O与释放O的变化这就微妙地完成了运O的功能分子病在蛋白质的一级结构中参与功能活性部位的残基或处于特定构象关键部位的残基即使在整个分子中发生一个残基的异常那么该蛋白质的功能也会受到明显的影响。

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