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细胞凋亡及检测方法.ppt

细胞凋亡及检测方法

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2018-05-29 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《细胞凋亡及检测方法ppt》,可适用于市场营销领域

细胞凋亡及凋亡检测一、概述细胞凋亡(apoptosis):由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡(又称为程序性细胞死亡)年由Kerr等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。ldquo凋亡rdquo一词来自希腊语apo意为ldquo分离rdquoptosis指花瓣或树叶的脱落ldquo凋亡rdquo是由这两个词组合而成意指细胞凋亡类似秋天花瓣或树叶的凋落一样研究简史半个世纪前:人们就观察到生理自发退化死亡现象年:发育生物学家Lockshin和Williams首先提出了PCD(程序化死亡)一词用于描述蛾的发育过程年:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概念年:人们注意到在生理或病理性刺激条件下淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。年:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征包括核固缩和DNA降解成寡核苷酸片段等年:wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中证明了信号传递物质对PCD的调控作用。年:Ellis首先发现了线虫(Celegans)体内Ced、两个基因与PCD的发生密切相关随后逐渐发现了多种参与PCD的正相调节基因和负相调节基因细胞死亡的形式坏死:活体组织细胞的死亡凋亡细胞凋亡与坏死的比较坏死凋亡性质诱导因素生化特点形态变化DNA电泳炎症反应凋亡小体基因调控病理性、非特异性强烈刺激随机发生被动过程无新蛋白合成细胞肿胀、细胞结构全面溶解、破坏弥散性降解电泳呈均一DNA片状溶酶体破裂局部炎症反应无无生理性或病理性特异性较弱刺激非随机发生主动过程有新蛋白合成胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩核固缩DNA片段化(bp)电泳呈梯状条带溶酶体相对完整局部无炎反应有有坏死坏死炎细胞浸润凋亡细胞凋亡的生理病理意义①确保正常发育、生长:清除多余的、失去功能价值的细胞(指趾间组织细胞)②维持内环境稳定:清除受损突变细胞自身反应细胞衰老细胞③发挥积极的防御功能:病毒感染细胞凋亡阻止病毒复制二、细胞凋亡的过程细胞凋亡的大致过程:凋亡信号转导凋亡基因激活细胞凋亡的执行凋亡细胞的清除凋亡的四个阶段:凋亡诱导因素受体cAMPCa神经酰胺死亡信号凋亡基因激活DNase激活Caspase激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞凋亡过程Ⅰ受体cAMPCa神经酰胺凋亡相关基因激活信号转导细胞膜细胞核DNase激活Caspases激活凋亡过程ⅡDNase激活Caspases激活凋亡细胞的清除凋亡执行三、凋亡时细胞的主要变化(一)细胞凋亡的形态学改变细胞凋亡的特征是细胞首先变圆,随即与邻周细胞脱离,失去微绒毛,胞浆浓缩,内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合,核染色质密度增高呈半月形,并凝聚在核膜周边,核仁裂解,进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外泄的凋亡小体被吞噬细胞或邻周细胞所识别、吞噬,或自然脱落而离开生物。不引起炎症反应和次级损伤。空泡化固缩出芽边集凋亡小体形态学特征染色质边集嗜酸性小体(凋亡)嗜酸性变及嗜酸性小体肝细胞体积缩小胞浆浓缩红染呈嗜酸性变或胞浆进一步浓缩细胞变圆核碎裂呈嗜酸性小体状(二)细胞凋亡的生化改变DNA片段化:形成bp或整数倍的片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的ldquo梯状rdquo条带是判断凋亡发生的客观指标之一。凋亡后DNALadder的agarose电泳检测内源性核酸内切酶激活及其作用:内源性核酸内切酶在核小体连接部切断DNA双链。凋亡诱导因素rarr细胞内信号转导无活性内源性核酸内切酶活性内源性核酸内切酶rarr核小体连接部切断DNA双链rarr电泳呈特征性的ldquo梯状rdquo条带CaMg激活Zn抑制Caspase的激活及其作用Caspase(含半胱氨酸的门冬氨酸特异水解酶):一组对底物门冬氨酸部位有特异水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶又称死亡蛋白酶主要作用:①灭活细胞凋亡抑制物(Bcl)②水解蛋白质结构导致细胞解体形成凋亡小体③水解级联反应相关活性蛋白使之获得或丧失某种生物学功能Caspase的作用目前被鉴定的哺乳动物CaspaseCaspase的特点含有高度保守的QACXG(X为R、Q或G)五肽序列以半胱氨酸作为裂解底物的亲核基团以天门冬氨酸为特异性底物(羧基端肽键断裂)通常以无活性的酶原形式存在须通过水解其氨基端一段序列激活活化后水解底物通过级联放大诱发凋亡抑制剂防止caspase酶原被偶然激活而对正常细胞造成伤害Caspase触发凋亡途径细胞外途径:细胞表面死亡受体途径细胞内途径:线粒体引发途径内质网介导的凋亡通路细胞外途径细胞死亡信号蛋白结合细胞表面相应受体死亡受体与配体结合导致死亡结构域聚集使死亡受体分子活化Caspase活化:Caspase酶原在局部聚集FADD与procaspase的DED结合形成信号复合物procaspase水解活化形成有活性的caspase细胞凋亡:激活的caspase激活下游的caspase引起细胞凋亡细胞内途径是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径过程:凋亡刺激mdashmdash死亡促进因子包括细胞色素C、凋亡诱导因子、促死亡蛋白、Caspase酶原释放mdashmdashCaspase活化mdashmdash细胞凋亡内质网介导的凋亡通路内质网钙离子内环境紊乱及过量内质网蛋白积累激活Caspase同时胞质中的Caspase移入内质网进一步激活Caspase激活的Caspase可进一步剪切Caspase细胞凋亡(三)细胞凋亡的调控细胞凋亡的相关因素()诱导性因素激素和生长因子失衡:缺乏(ILdarr淋巴细胞凋亡)或过多(糖皮质激素uarr淋巴细胞凋亡)理化因素:射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等免疫性因素:如CTL分泌粒酶rarr靶细胞凋亡微生物因素:细菌、病毒及毒素。(HIV)()抑制性因素★细胞因子:IL、神经营养因子★激素:ACTH、睾丸酮、雌激素等★二价金属阳离子:Zn★药物:苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸★病毒:EB病毒、牛痘病毒CrmA细胞凋亡信号转导凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化及细胞结构蛋白降解的中间环节。凋亡信号转导系统的特点:①多样性:不同种类细胞有不同系统②耦联性:凋亡与增殖分化系统在某些环节耦联同一因素既可引起凋亡也可引起增殖③同一性:不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统④多途性:同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统研究较多的系统:依据:①细胞凋亡时胞内游离Ca浓度显著上升②用Ca载体A人为升高B淋巴细胞Ca水平B淋巴细胞凋亡③用Ca络合剂降低胞内Ca水平阻止细胞凋亡激活Ca依赖谷氨酰胺转移酶Cauarr活化核转录因子.胞内Ca信号系统(Ca为第二信使).cAMPPKA信号系统(cAMP为第二信使)依据:①双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡②糖皮质激素使cAMP上升cAMPuarrrarr激活PKArarr使靶蛋白某些氨基酸(苏、丝AA)残基磷酸化rarr改变蛋白质功能.Fas蛋白Fas配体信号系统Fas蛋白:细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白Fas配体(抗Fas)rarr细胞凋亡机制:①Fas蛋白Fas配体(抗Fas)rarr神经鞘磷脂酶活性uarrrarr产生神经酰胺rarr蛋白激酶激活rarr细胞凋亡②Fas蛋白抗Fas、TNFrarr激活ICE样caspaserarr降解H组蛋白rarr染色体松驰rarrDNA暴露内切酶位点③通过Ca信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡.神经酰胺信号系统神经酰胺:神经鞘磷脂(SM)在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据:用天然神经酰胺处理u白血病细胞诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因:电离辐射、TNFalpha、Fas抗原、糖皮质激素.二酰甘油蛋白激酶C(PKC)信号系统二酰甘油:磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种第二信使物质。依据:①活化的PKCbeta可诱导u白血病细胞凋亡②抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡③PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡(糖皮质激素、T细胞受体激活、IL撤除).酪氨酸蛋白激酶系统生长因子或细胞因子rarr激活酪氨酸蛋白激酶rarr靶蛋白酪氨酸磷酸化rarrRas蛋白激活rarr通过Raf、MAPKK、MAPKrarr蛋白质磷酸化rarr细胞分化生长因子或细胞因子撤除rarr不能激活酪氨酸蛋白激酶系统rarr细胞凋亡凋亡相关基因抑制凋亡基因:Bcl促进凋亡基因:P、Bax、ICE双向调节基因:cmyc、Bclx(B细胞淋巴瘤白血病Bcelllymphomaleukemia基因的缩写)Bcl蛋白:个氨基酸(人)、个氨基酸(小鼠)分布:线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜作用:Bcl高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡依据:①导入Bcl基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的凋亡②淋巴细胞有呈Bcl阳性时预后不佳(耐受放射线、抗癌药物)()Bcl①直接的抗氧化作用②抑制线粒体释放促凋亡蛋白质(细胞色素C、AIF)③抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak的细胞毒作用④抑制凋亡蛋白酶(caspases)的激活⑤维持细胞钙稳态Bcl抗凋亡作用机制:作用:野生型(wtP):DNA结合蛋白诱导细胞凋亡(ldquo分子警察rdquo)突变型(mtP):抑制细胞凋亡野生型P的作用机制:P蛋白rarr细胞周期G期检查染色体DNA损伤(检查点功能)rarr发现DNA损伤rarr剌激CIP的表达rarr阻止细胞进入下一周期启动DNA修复机制rarr修复失败rarr启动细胞凋亡机制rarr细胞凋亡()Pcmyc:一种癌基因它能诱导增殖也能诱导细胞凋亡具有双向调节作用。作用机制:cmyc蛋白为重要的转录调节因子既可介导细胞增殖也可激活介导细胞凋亡其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境(有生长因子rarr增殖无生长因子rarr凋亡)。Bclx:能翻译BclXL和BclXs两种蛋白BclXL蛋白抑制细胞凋亡BclXs蛋白促进细胞凋亡()cmyc,Bclx三、细胞凋亡的发生机制、氧化损伤氧化损伤的后果之一:细胞凋亡依据:①各种氧化剂(HO)可直接诱导细胞凋亡②抑制超氧化物歧化酶(SOD)活性可诱导细胞凋亡③抗氧化剂(VitE、胡萝卜素等)可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素(TNFа、电离辐射)引起的细胞凋亡①引起DNA损伤激活P基因②引起DNA损伤活化多聚ADP核糖合成酶耗竭辅酶Ⅰ(NAD)消耗大量ATP③攻击细胞膜不饱和脂肪酸脂质过氧化细胞膜损伤或产生过氧羟基碳四烯酸④激活CaMg依赖的核酸内切酶⑤细胞膜损伤Ca内流增多及损伤线粒体通透性增加膜电位改变⑥活化核转录因子NFкB、AP加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制:钙稳态失衡细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据:①各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程②凋亡发生时胞浆Ca浓度显著上升并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用(核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活细胞膜的空泡化)③钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病(神经退行性疾病)①激活CaMg依赖的核酸内切酶降解DNA链②激活谷氨酰胺转移酶催化肽链间的酰基转移酶肽链间形成共价键使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联有利于凋亡小体形成③激活核转录因子加速凋亡相关基因表达④Ca在ATP的配合下使DNA链舒展暴露核小体之间的连接区内的酶切位点有利于DNA内切酶切割DNA钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制:、线粒体损伤线粒体的改变:线粒体内膜通透性增大线粒体内膜跨膜电位(△psim)下降能量代谢水平显著降低线粒体改变在细胞凋亡发生中起关键作用依据:①抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡②在细胞核出现凋亡改变之前常先有线粒体内膜跨膜电位(△psim)下降③阻止线粒体通透性的改变可防止细胞凋亡(Bcl)四、细胞凋亡与疾病(一)细胞凋亡不足肿瘤发生机制:细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径结果导致病变组织内肿瘤细胞存活延长存活大于死亡肿瘤细胞数目净增长加大形成新生物。凋亡受抑的依据:①多种肿瘤组织中Bcl表达显著高于周围组织②许多肿瘤P发生突变突变型P抑制细胞凋亡发生机制:从细胞凋亡角度看自身免疫病的发病是由于细胞凋亡不足未能有效清除自身免疫性T细胞所致。依据:糖皮质激素能诱导淋巴细胞凋亡为治疗自身免疫病的有效药物之一。自身免疫病(二)细胞凋亡过度心血管疾病()心肌缺血与心肌缺血再灌注损伤心肌缺血与心肌缺血再灌注损伤造成的心肌细胞损伤不但有坏死也有细胞凋亡(干预靶点)。特点:①缺血早期以细胞凋亡为主晚期以细胞坏死为主②梗死灶中央通常以坏死为主周边以细胞凋亡为主③轻度缺血以细胞凋亡为主重度缺血通常以坏死为主④急性、严重的心肌缺血以坏死为主慢性、轻度的心肌缺血以细胞凋亡为主细胞凋亡的机制:①氧化应激有关(SOD可减少细胞凋亡)②Fas上调通过与FasL反应导致细胞凋亡③与P基因激活有关(缺氧可增加P基因的转录)心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少可能是心力衰竭发生发展的原因之一。①在压力负荷过重引起的心力衰竭动物模型上观察到左室心肌肥大的同时心肌细胞数量减少经分析是由细胞凋亡造成②心衰病人心肌标本心肌凋亡指数高达对照组为诱因:氧化应激、压力或容量负荷过重、神经内分泌失调、细胞因子、缺血缺氧。()心力衰竭在神经系统疾病中有一类以特定神经元进行性丧失为其病理特征的疾病:阿尔茨海默氏病(AD)帕金森氏病多发性硬化症举例:阿尔茨海默氏病(AD)与细胞凋亡的关系:AD患者的尸检发现海马及基底神经核的胆碱能神经元丧失达有时高达大脑皮质也有不同程度的神经元丧失大脑皮质出现广泛萎缩脑沟变宽脑回变窄脑室扩大。神经元退行性疾病诱因:beta淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激、神经生长因子分泌不足可能机制:致病因素(如:氧自由基)rarr神经元Ca内流uarrrarrbeta淀粉样蛋白合成相关基因激活rarrbeta淀粉样蛋白uarrrarr神经细胞凋亡发病机制:HIV感染rarrCD淋巴细胞rarrCD淋巴细胞显著darrrarr免疫功能缺陷细胞凋亡相关因素:①gp糖蛋白:gp糖蛋白受体rarr细胞凋亡②合胞体形成:HIV感染rarr合胞体形成rarr细胞凋亡③Fas基因表达上调:HIV感染rarrFas基因表达上调rarrFasFasLrarr细胞凋亡病毒感染获得性人类免疫缺陷病(AIDS)④T细胞激活:HIV感染rarrCD细胞激活rarr生长因子缺乏rarr细胞凋亡⑤细胞因子:HIV感染rarrTNFuarrrarrTNFTNFRrarr细胞凋亡⑥tat蛋白:HIV感染rarr产生tat蛋白rarrCD淋巴细胞rarr诱导产生氧自由基和Fas基因表达上调rarrFasFasLrarr细胞凋亡⑦HIV慢性感染rarrCD(HIV)淋巴细胞攻击CD(HIV)淋巴细胞rarr细胞凋亡动脉粥样硬化:内皮凋亡过度平滑肌细胞凋亡不足依据:内皮细胞凋亡过度:①LDL升高、血小板激活、AgⅡ、高血压可引起内皮细胞凋亡②检测粥样硬化的冠状动脉病变部位内皮细胞凋亡达远高于对照平滑肌细胞凋亡不足:平滑肌细胞凋亡增多但仅为增殖细胞的细胞凋亡相对不足。(三)细胞凋亡不足与过度并存五、细胞凋亡检测形态学观察方法DNA凝胶电泳酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定流式细胞仪定量分析Westernblot检测(一)形态学观察方法HE染色:凋亡细胞呈圆形胞核深染胞质浓缩染色质成团块状细胞表面有ldquo出芽rdquo现象丫啶橙(AO)染色AO透过胞膜完整的细胞崁入细胞核DNA发绿色荧光活细胞核呈绿色荧光凋亡细胞染色增强核染色质呈黄绿色或橘红色浓聚在核膜内侧(核固缩)可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体坏死细胞:核染色质橘红色台盼蓝染色如果细胞膜不完整、破裂台盼蓝染料进入细胞细胞变蓝即为坏死细胞。如果细胞膜完整细胞不为台盼蓝染色则为正常细胞或凋亡细胞区分坏死细胞透射电镜观察可见凋亡细胞表面微绒毛消失核染色质固缩、边集常呈新月形核膜皱褶胞质紧实细胞器集中胞膜起泡或出ldquo芽rdquo及凋亡小体及凋亡小体被临近吞噬细胞吞噬现象。(二)DNA凝胶电泳检测原理:细胞发生凋亡或坏死其细胞DNA均发生断裂细胞内小分子量DNA片段增加高分子DNA减少胞质内出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间出现-bpDNA片段而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段利用此特征可以确定群体细胞的死亡并可与坏死细胞区别。结果判断正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。(三)酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成可由ELISA法检测。检测步骤将凋亡细胞裂解后高速离心其上清液中含有核小体在微定量板上吸附组蛋白体加上清液使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合加辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合加酶的底物测光吸收值。特点该法敏感性高应用广泛操作简单不能精确定量(四)流式细胞仪定量分析细胞发生凋亡时其细胞膜的通透性也增加但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点被检测细胞悬液用荧光素染色利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。PI单染色法TUNEL法即原位缺口末端标记技术(insituendlabellingtechnique,ISEL)原理:利用TdT(末端DNA转移酶)将标记的dUPT连接到OH端形成新的DNA特点:敏感度高操作简单应用广泛也可以进行形态学观察PIAnnexinV双标法原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测磷脂结合蛋白V(AnnexinV)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白与PS具有高度的结合力将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC)同时结合使用PI染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测且对PI高染)进行凋亡细胞染色。结果判断正常活细胞AnnexinV、PI均低染凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染坏死细胞AnnexinVPI均高染。应用细胞发生凋亡时膜上的PS外露早于DNA断裂因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏不需固定细胞是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。HoechstPI双染色法Hoechst和PI均可以与细胞核DNA或RNA结合但PI不能通过正常的细胞膜而Hoechst为膜通透性荧光染料正常细胞、坏死细胞、凋亡细胞均着色正常细胞为低蓝色低红色(HoechstPI)细胞形态正常凋亡细胞为高蓝色低红色(HoechstPI)核碎片状边集坏死细胞为低蓝色高红色(HoechstPI)(五)其它检测方法Caspase活性的检测Caspase活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用其中caspase为关键的执行分子它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase正常以酶原(KD)的形式存在于胞浆中在凋亡的早期阶段被激活活化的Caspase由两个大亚基(KD)和两个小亚基(KD)组成裂解相应的胞浆胞核底物最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞caspase的活性明显下降。Westernblot分析Procaspase的活化以及活化的Caspase及对底物多聚(ADP核糖)聚合酶poly(ADPribose)polymerasePARP等的裂解。荧光分光光度计分析原理:活化的Caspase能够特异切割DEVDX底物水解DX肽键。根据这一特点设计出荧光物质偶联的短肽AcDEVDAMC(caspase四肽荧光底物)。在共价偶联时AMC不能被激发荧光短肽被水解后释放出AMC自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小可以测定caspase的活性从而反映Caspase被活化的程度。细胞凋亡(科普诗)似秋叶的凋零告别生命之辉煌那难以计数的攻击、诱导轻启着道道程序逼细胞步步走向生命的末端啊活性氧处处肆虐钙波涛惊石裂岸线粒体把生命之光一点一点拧淡危难中的细胞啊你沉稳不乱DNA片片切割化云梯直通天堂细胞体分团相聚把生命的凝重浓集在小体上分别了朝夕相处的伙伴再见了快乐美好的时光这一切的一切又融入临近的胞体腾出的空间再写生命的篇章。

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