基因敲除KnockOut背景介绍1981年Evans等首次在体外分离和培养ES，成功建立了小鼠胚胎干细胞系1985年Smithies最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础同源重组HomologusRecombination同源重组是指发生在姐妹染色单体（sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组同源重组示意图一、Cre/Loxp系统Cre重组酶（37℃）位点特异性重组酶，介导loxp位点间的序列同源重组70%重组率，无需辅助因子，多种结构的DNA底物Loxpsite34bp反向重复序列Flp/Frt重组系统P1噬菌体Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码343个氨基酸。Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。（1）重组方式（2）基因敲除机理基因敲除机理（续）二、基因敲除的基本流程（1）打靶载体构建ConditionalKnockoutExon13NGT/AGAttention:（2）转化ES细胞电穿孔或是显微注射方法将构建好的打靶载体导入ES细胞电转需要的细胞数量2-5x107（3）阳性克隆筛选 随机整合 定点整合 没有整合DTA(白喉毒素A亚基）白喉毒素是一种毒性分子，可以杀死宿主细胞筛选出阳性ES细胞后，需要把其发育成一个完整的个体G418抗生素，neo表达一种酶，对抗生素产生抗性作用（4）囊胚注射小鼠的遗传背景取决于ES和囊胚细胞在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）（5）嵌合体小鼠嵌合体小鼠和野生型亲本进行回交，回交次数一般不能少于12代（6）品系纯化Loxp2小鼠品系建立完成纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种三、Cre工具鼠的构建DNA显微原核注射，是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。注射发生在哺乳动物受精卵发育前期，即两个原核时期，这两个原核分别来自于卵母细胞和精子，随后这两个原核将发生融合，注射DNA整合到染色体中。诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建D.S.Sohal,M.Nghiem.Temporallyregulatedandtissue-specificgenemanipulationsintheadultandembryonicheartusingatamoxifen-inducibleCreprotein.CircRes.89:20-25(2001).MHC(cardiac-specifica-myosinheavychain)Mer(mutatedmurineestrogenreceptorligand-bindingdomainaminoacids281to599,G525R)Cre基因约1.1kb，编码343个氨基酸为了获得在心脏组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠,我们选择A-肌球蛋白重链(A-MHC)启动子，体外和体内试验均证实，其在整个心脏发育的阶段都有所发表。MerCreMer融合蛋白该系统将雌激素受体(EstrogenReceptor,ER)的配体结合区(ligand-bindingdomain,LBD)和Cre重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。TheEnd基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码343个氨基酸。Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。电转需要的细胞数量2-5x107白喉毒素是一种毒性分子，可以杀死宿主细胞筛选出阳性ES细胞后，需要把其发育成一个完整的个体G418抗生素，neo表达一种酶，对抗生素产生抗性作用在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）嵌合体小鼠和野生型亲本进行回交，回交次数一般不能少于12代注射发生在哺乳动物受精卵发育前期，即两个原核时期，这两个原核分别来自于卵母细胞和精子，随后这两个原核将发生融合，注射DNA整合到染色体中。Cre基因约1.1kb，编码343个氨基酸为了获得在心脏组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠,我们选择A-肌球蛋白重链(A-MHC)启动子，体外和体内试验均证实，其在整个心脏发育的阶段都有所发表。
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