小鼠肝细胞原代培养 材料：小鼠 器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器 试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。 操作步骤： 1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。 2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min，弃上清液。 4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化12-20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。 6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。 7、4度，1000rpm，离心5分钟，弃上清液。 8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 10、将细胞调整到5×105/ml左右，于37度、5%CO2条件下培养。 肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。 目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下： 1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程，直至脾动脉、胃左动脉显露，结扎离断脾动脉、胃左动脉，显露腹腔动脉干。轻轻抬起肝脏，显露其下的门静脉，将其从周围的淋巴组织中分离出来，注射肝素100U。缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支，以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎，并于结扎线间将其离断，这样就可显露脾静脉与肠系膜上静脉的会合处。将灌注导管插入门静脉，并结扎牢靠，在远心端离断肝上下腔静脉，准备肝脏灌注。迅速切除肝脏，术中连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏，最终将肝脏在腹膜后切除，获取肝脏。之后行门静脉插管，准备行肝脏灌注，分离肝细胞。 2:灌注液的配置： Perfusion Solution 1（g/L）： NaCL 8.000 NaH2PO4•2H2O 0.078 KCL 0.400 Na2HPO4•12H2O 0.151 NaHCO3 0.350 EDTA 0.190 HEPES 2.380 Glucose 0.900 磁力搅拌器使固体成分充分溶解，用1M HCL或1M NaOH调定pH 7.2～7.4（使用pH计）， 0.45及0.22双层滤膜负压过滤除菌，4℃保存，使用时液体温度维持在37℃（应用水浴箱）。 Perfusion Solution 2（g/L）： NaCL 8.000 KCL 0.400 CaCL2 0.560 NaH2PO4•2H2O 0.078 Na2HPO4•12H2O 0.151 HEPES 2.380 NaHCO3 0.350 Collagenase Ⅳ 0.500 搅拌器使固体成分充分溶解，4℃冰箱过夜，以后同上。 4:灌注步骤： 4.1 37℃Perfusion Solution 1沿门静脉插管灌注肝脏，流速20－30ml /min，灌洗10min左右，至肝脏呈现灰白色为止 4.2 Hanks液80ml 短时间灌注，约2min，冲出EDTA 4.3 37℃Perfusion Solution 2 沿门静脉插管灌注肝脏，流速20mL/min，灌洗10min左右，循环使用 4.4 肝脏变软，塌陷后用无菌镊钝性分离肝细胞，去除肝包膜及血管等结缔组织，将含有胶原酶的肝细胞悬液放入250ml无菌烧杯中（杯口用无菌锡纸包裹），37℃水浴5min 4.5加入无指示剂的DMEM基培，双层无菌纱布过滤 4.6将滤液放入50ml离心管中，应用无指示剂的DMEM基培，4℃、50g、3min洗涤肝细胞3次 5:获得的细胞经过以下的纯化，应用特定的培养基培养。 提供几篇文章 1. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Chacko, J., and Trump, B. F. (1981). Mouse liver cell culture 1. hepatocyte isolation. IN VITRO Vol.17.No.10 October, 913-925. 2. Kreamer, B. L., Staecker, J. L., Sawada, N., Sattler, G. L., Hsia, M. T. S., and Pitot, H. C. (1986) Use of low-speed ,iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. IN VITRO CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIO. Volume 22,Number 4,April 201-211. 3. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., (1989) Lysis of cultured mammalian cells. Molecular Cloning. 18.34
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