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生命科学基本实验手册.pdf

生命科学基本实验手册

coin6
2014-03-25 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《生命科学基本实验手册pdf》,可适用于自然科学领域

生命科学基础实验手册wwweverylabcomcn上海申实生物科技有限公司EveryLab免疫印记WesternBlot细胞培养CellCulture免疫组化IHC定量PCRrealtimePCRRNA干扰RNAi凋亡研究Apoptosis免疫沉淀IP凝胶停滞实验EMSA染色质免疫共沉淀ChIP因为专业所以信赖我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcn自序目前在每一个生命科学实验室大家都可以随手拿到各大厂商的产品手册和宣传单页里面内容丰富多彩有新技术推广也有新产品介绍。但是作为实验人员大家可能从上面并不能获取自己需要的信息因为这些资料都是从厂商而不是客户的角度撰写的他们的根本目的就是说服客户接受这些品牌自己的信息。至于客户关心的其他竞争产品的信息只会在需要作为负面对照的时候才会提及所以大家从没见过一个品牌在自己的宣传册中赞扬对手的产品。但这就给研究者带来迷惑每一家都说自己的产品技术是最优秀的但究竟谁更胜一筹呢?目前还没有第三方可以给出答案本手册的目的就是希望以客观的角度提供一份公正的产品介绍并以客户的视角阐述研究者希望了解的各项信息。手册耗费了大量的笔墨用于介绍各种常用产品的多种参数包括品牌、性能、价格等。这些信息的提供可以使每一位研究者都能够从自己更关心的方面做出选择他可以将性能放在首位也可以将价格放在首位或者综合起来选择。比如WB用的ECL发光试剂市场上畅销的产品有数十种之多该手册分别挑选出几种畅销产品然后从性能价格等方面对这些产品进行了详细的介绍。如果您更关心性能那就选择Piercefemto级别的产品如果您更关心价格那就选择天根、碧云天的产品如果您更关心性价比那就选择Millipore的产品做出决定非常简单。而在以前更多的时候大家对着推销员热情推荐的多种ECL产品可能是无从下手最后看周边的师兄师姐用什么自己就买什么但是因为您研究的蛋白可能跟他们不一样所以在检测的时候您未必可以获得理想的结果。手册的另一个贡献是提供了实验中涉及每一个产品的货号。因为研究者可能只关心产品名称而不是枯燥难记的数字尤其是类似Roche或者Millipore那种具有很长数字甚至还掺杂字母的晦涩货号很少人能够随口拈来。但无论是文章的发表还是产品的订购可能货号才是唯一被强调的信息毕竟一个品牌内的一个货号只针对一个产品。所以在文章引用或者订购产品时大家可以从手册里面轻松翻出相关产品的货号不用担心以往货号中的一字之差导致产品“谬以千里”。该手册的撰写者都是由具有多年生命科学领域工作经验的研究人员和市场人员组成他们从使用者的角度出发收集各个实验室的多项产品反馈整理出了该领域各项基本实验中最受技术人员欢迎的产品。因为是首次撰写印制手册里面肯定存在一些偏颇的观点甚至错误的信息希望大家作为参考的同时且能去伪存真并欢迎向我们提出反馈(infoeverylabcomcn)。最后祝大家实验顺利、工作愉快!EverLab市场部年月现货抗体离您并不遥远集合AbcamCSTMilliporeEpitomicsAffinityJacksonSIGMA等品牌国内现货库近余种常用现货抗体加速您的实验进程详情联系comAbcamEpitomicsCSTMilliporeAffinityJackson我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcnWesternBlot免疫印记实验蛋白的抽提对于不清楚位置的蛋白或者常规的细胞浆蛋白研究人员可以直接选择蛋白的广谱抽提试剂RIPA具体产品可以选择Pierce的或者Millipore的后者为×包装核蛋白的抽提研究人员可以选择Pierce的细胞核浆蛋白抽提试剂盒该产品不仅可以高效的将核蛋白和浆蛋白分别抽提出来而且抽提出来核蛋白还可以应用于下游的EMSA、IP等实验例如与Pierce的EMSA试剂盒可以配套使用用于验证蛋白与核酸的结合。膜蛋白的抽提研究人员可以根据蛋白的跨膜次数的高低分别推荐以下三个产品:当面对的是普通的膜蛋白(<次跨膜)建议选择pierce的该试剂盒是一款经典而且价格相对低廉的抽提试剂盒但其应用受限于<次跨膜的膜蛋白当面对的膜蛋白跨膜次数>时推荐使用Merck的或者Pierce的。前者是Merck最新推出的一款高性能试剂盒(替代Merck上一代著名的膜蛋白抽提试剂盒)其抽提膜蛋白的高效性正是采用跨膜多次的GPCR受体蛋白做的实验验证所以如果您碰巧在研究GPCR这种多次跨膜的蛋白那么强烈推荐该试剂盒该产品的另外一个优点是抽提出的膜蛋白不仅可以用于WB还可以用于如IP、ELISA等各项实验。Pierce的与前面两个试剂盒采用的常规化学萃取原理不同采用亲和纯化的方法具体流程是首先利用交联剂将生物素标记到所有裸露在细胞膜外的蛋白上然后利用耦联亲和素的琼脂糖凝胶从匀浆后的总蛋白中拉出所有的生物素膜蛋白复合物最后将膜蛋白从琼脂糖凝胶上面的复合物上洗脱该产品不仅得率高而且蛋白具有较高的活性所以尽管是一款较新的产品但近期文献的引用率却很高。线粒体蛋白的抽提Pierce的具有不俗的表现不仅抽提的是完整的线粒体而且可以用于下游的WB等各项实验。不过一般适用于细胞对于组织还需要额外选择的产品(MitochondriaIsolationKitforTissue)。Merck还有一款QIA试剂盒可以分别高度富集胞浆和线粒体用于下游的WB或者ELISA实验细胞各种组分的同时抽提如对一个样本同时研究细胞膜、浆、核、骨架蛋白那么研究人员可以考虑使用Pierce(细胞)(组织)或Merck的产品两种产品均是利用细胞中各种组分蛋白疏水性的不同逐一将各个组分蛋白抽提出来使实验结果更科学。关于蛋白酶抑制剂的使用在前些年实验中都只是使用单一的抑制剂如PMSF、氟化钠等但由于其抑制作用有限目前各个厂家又推出了多种抑制剂的混合装也称之为蛋白酶抑制剂cocktail。由于市场上该类产品很庞杂(单个品牌可能有多个包装多种形式制剂)这使大家常常不知如何选择。在这里我们建议如果您每天的实验中所需量不大那么可以选择液体包装的产品如Pierce的或者Merck的这类液体制品不用溶解尤其是Pierce的产品可以直接度长期保存更省却了分装冻存的操作如果您实验室每天的用量较大即使从性价比的角度考虑Roche的蛋白酶抑制剂都是首选可以选择货号的产品(tablet×ml)也可以选择(tablet×ml)毫不夸张的说Roche的蛋白酶抑制剂绝对是目前最受欢迎的产品。关于磷酸酶抑制剂的使用如果说普通的蛋白酶抑制剂在一些艺高人胆大操作人员的实验中还可有可无的话那么磷酸酶抑制剂的使用对任何人而言都是不可或缺。由于细胞内磷酸化状态的蛋白的微量和敏感性每一个实验人员在蛋白抽提中都会注意保护磷酸化蛋白不被脱磷酸化或者降解。关于磷酸酶抑制剂的选择如果您的实验WB的第一步就是蛋白的抽提蛋白抽提质量的好坏直接影响后期的实验结果。首先我们需要在抽提蛋白前了解该蛋白在细胞里面的定位确认好目标蛋白究竟是浆蛋白还是核蛋白或者膜蛋白后再根据不同的蛋白选择对应的抽提试剂。需要注意的是各种抽提试剂在具体情况下都需要添加蛋白酶抑制剂尤其在涉及磷酸酶化蛋白的抽提时不仅要添加普通的蛋白酶抑制剂还需要添加磷酸酶抑制剂。我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcn室用量较少那么还是建议您考虑Pierce的该产品是普通蛋白酶磷酸酶的双联液体制剂不仅省却了添加普通蛋白酶抑制剂而且可以度长期保存如果您的用量较大或者您对Roche品牌很有好感那么就选择Roche依然称霸市场的磷酸酶抑制剂cocktail产品吧货号(tablet×ml)或者更大包装的产品货号(tablet×ml)。蛋白的定量蛋白抽提出来后需要对总蛋白进行定量从而确定蛋白上样的体积。目前比较流行的定量方法有BCA检测法、Bradford法(考马斯亮蓝法)和Lowry法其中BCA检测更为灵敏和去污剂的耐受性更佳因此更受大家欢迎。关于BCA的产品就要推荐Pierce的相关试剂盒了目前该产品是美国FDA指定产品同时也是Pierce全球销售量前十产品其权威性和普及性毋庸置疑Bradford法因为涉及的试剂组分更简单(磷酸考马斯亮蓝BSA标准品)所以很多实验室都是自行配制当然大家也可以选择商业化的试剂盒如Pierce的Lowry法检测灵敏度很高但是对去污剂变性剂耐受性较差所以目前使用的人越来越少不建议使用。目前市场上还出现了各种蛋白浓度的检测仪器如Thermo的nanodrop和Millipore的DirectDetect™可以直接对微量(ul)样本进行浓度测定省却了标准品和标准曲线的制作所以实验室资金充足也可以考虑直接购买该类仪器。蛋白的上样和电泳首先谈及SDSPAGE的上样缓冲液通常也被大家成为LoadingBuffer以前一般都是由自己配制但是对于WB实验量少或者强调试剂稳定性的实验室我们还是推荐使用商业化的相关试剂。Fermentas早期曾推出过一款明星产品R产品性价比非常高但是被Thermo收购后因为产品线的整合该产品被取消了目前的替代产品是Pierce的该产品包装小价格贵。但是贵有贵的理由除了具有Fermentas的高品质外它还有一项功能就是该缓冲液里面含有的红色染料可以在蛋白变性的过程中使蛋白着色在后期的转膜过程中可以直观的看出蛋白的转膜质量省却了后期的丽春红染色步骤很是方便。蛋白的电泳是WB流程中是最为复杂和耗时的步骤配胶的好坏和电泳参数的设置直接影响后面蛋白条带的质量因为其中涉及的各项试剂以及电泳的各项参数基本都是不变的所以在这里不再赘述。唯一需要提醒大家的是预制胶正在走入各个实验室商业化的预制胶不仅节约了时间而且避免了常规配胶、跑胶可能带来的不利因素建议实验经费充足的实验室选择或者再追求好图片的时候使用预制胶。蛋白marker:蛋白上样的时候除了目标蛋白还要上样蛋白marker这样才能在后期截取相对应的条带进行杂交显色或者明确目标蛋白的分子量。最新调查发现以上的重点实验室使用的蛋白marker都是Fermentas的产品剩余的使用的是BioRad的产品其余的就是非主流了。因此蛋白marker产品选择很简单直接在网上找到Fermentas的一张marker产品示意图即可(如下页上图)。根据研究的蛋白分子量先查看是否落在最畅销的SMSM(KD)产品的范围里面如果蛋白分子量过小可以选择小分子量蛋白markerSM(KD)如果太大可以选择大分子量蛋白markerSM(KD)另外广谱的SM(KD)也很受欢迎。可能还会有些实验室对于可在胶片上显影的蛋白marker有特殊需要那么可以考虑Pierce的但购买的时候注意这两个产品对一抗的种属有一定要求。蛋白浓度检测后就可以确定相关的上样体积这时就需要进行下面的上样和电泳步骤了尤其对于后者更为关键我们在后期的显色和发光时发现条带的各种怪异现象如笑脸、空心等很多情况下都是因为电泳中间出了问题有时是电压参数不合理有时是聚丙烯酰胺凝胶配制出了问题等等所以我们在WB的制胶跑胶过程中要谨慎确保不要留下各种隐患。我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcnSMSMSMSMSMSMXULXULXULULXULXULUL转膜转膜中涉及的产品主要是耗材这就包括滤纸和转印膜。先从简单的滤纸谈起前期可能主要用的是普通的滤纸需要多层叠加后使用这样的选择可能会导致气泡的产生而影响转膜结果。后期各大厂商均开始提供mm的超厚滤纸这样正负极内侧仅各需一张滤纸即可而且不必担心滤纸中间的气泡。可以提供超厚滤纸的厂商较多但从客户端的反馈来看伯乐的超厚滤纸(XcmXcmX)更受大家欢迎。关于转印膜目前用于WB的转印膜主要有两种一个是传统的纤维素滤膜NC膜一个是后起之秀PVDF膜两者对比纤维素滤膜优点是其与蛋白的亲和力相对较高而且使用前不需预处理缺点是韧度较差PVDF膜的优点是蛋白的载量较大韧度好可以多次操作缺点是使用前需要使用甲醇预处理。当然如果仅仅从实验的角度来看两者性能并无显著差异所以选择哪一种膜更多来源于实验室的使用习惯。纤维素滤膜目前做的最好的就是Whatman品牌中的SS膜(um,cmxm)PVDF毋庸置疑最好的产品来自Millipore公司毕竟Millipore是PVDF的发明者其产品为IPVHISEQ(um,cmxm)。其他的品牌如PallRoche等也有品质不错的产品但是知名度和市场占有率还有差距。如果实验中涉及荧光WB时常规的PVDF自身具有的荧光本底可能会产生明显的背景信号从而降低荧光WB检测的信噪比所以特殊的lowfluorescencePVDFmembrane转印膜就非常必要如Millipore的IPFL。除此之外膜的孔径也需要大家注意当研究的蛋白低于KD尤其是低于KD的时候um的膜在很多情况下已经是爱莫能助了需要更换为um的滤膜防止这些低分子量的蛋白穿透而丢失。抗体的选择WB实验里面最为昂贵的产品可能就是抗体了(主要是指一抗)知名的抗体品牌很多AbcamCSTMilliporeBDSantaRD等等都是实验中常用的国外品牌但是在WB领域建议大家先在CST品牌里面查找需要的抗体因为CST不仅是WB抗体的金标准而且价格相对低廉。当然由于CST抗体产品在研究方向研究种属方面的限制抗体的种类远远不能满足每一位研究者的需要那么这就需要大家在其他如Abcam、Millipore等品牌中选择需要的抗体这里建议大家的是选择抗体的时候最好看看说明书里面是否有可供参考的验证图片因为图片可我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcn以在很大程度上看出抗体的特异性如何。最后如果大家碰到急需各种一抗的时候建议大家不妨考虑选择国内的一些OEM厂商如Epitomics、Affinity等品牌的现货产品前者目前已经被Abcam收购所以品质大可放心。还有内参抗体也很重要它的实验结果首先决定了实验体系的是否工作正常。如果内参条带就没有出来那就说明实验体系就有问题需要检查内参抗体甚至WB的各个步骤是否有问题如果内参条带正常那么WB的整个工作体系没问题目的条带如果没有出现那么主要有两种可能一是一抗没有工作二是样本中可能没有目标蛋白。内参另外一项更重要的功能就是在对目标蛋白进行(半)定量时作为control使各个样本中的目的蛋白量都能得到平衡。所以选择一支好的内参抗体尤为重要这里推荐的是稀释比例很高的sigma的产品如Abetaatcin的内参抗体该抗体的工作稀释高达::而且使用后的内参抗体稀释液收集后还可以多次反复使用且不会影响实验结果条带依然很“浓”这从侧面证明了sigma抗体的强悍。内参一般会考虑选择betaactinGAPDHtublin等蛋白而且大家可能更倾向于GAPDH但是在某些含酶量丰富的组织细胞里面建议避开该蛋白选择betaactin或者tublin为宜。关于酶标二抗的选择相对很简单很多用户可能都在使用Sigma、Pierce、Jackson等品牌的大包装抗体但是也有不少用户可能直接使用国产的二抗因为二抗种类有限所以每家抗体公司都可以把这个产品做的很出色进口与国产的产品品质几乎没有差距(它们的工作稀释比例甚至都可以高达:,)所以该类产品的选择没有多少技术含量。但是酶标二抗的使用在一些情况下倒是很容易出问题由于酶标二抗的廉价大家在实验中都会倾向于过量添加但这也就意味着HRP的过量过量的酶在很短的时间可能就会把ECL发光底物耗尽所以在后面的曝光中甚至看不到条带所以“多多益善”的法则在实验检测中并不适用为了避免这个问题的发生建议大家仔细阅读各种ECL产品的说明书。最后在选择的时候稍微注意下二抗的种属来源最好是羊驴而非鼠兔因为羊驴种属与人亲缘关系相对更远所以在交叉反应这块会做的更好。化学发光检测目前主流的WB后期检测手段还是化学发光法检测这里面涉及的主要是化学发光底物的产品从Pierce、Millipore、GE、PE到Biorad不仅各家都推出相关的产品而且每家可能推出不止一个灵敏度的产品如Pierce就推出了个级别类近种的产品所以大家在选择合适的产品感到无从下手。从各个实验室的统计来看目前使用率最高的是Pierce的pico级别产品毕竟该品牌在化学发光底物市场还是全球的老大所以其supersignal系列的产品占有率仍然遥遥领先于其他对手。但是Millipore的发光试剂WBKLSWBKLS凭借突出的性价比最近两年在国内也扩张了很大的市场份额。从实验的具体需要出发如果是检测低丰度的蛋白或者未知丰度的蛋白我们建议使用Pierce的femto产品因为该产品是目前检测灵敏度(达到飞克级别)最高的产品可以在最大程度上发现是否有目的蛋白的表达避免由于化学发光底物灵敏度的不足使研究者错失了关键的目标蛋白所以在个别低丰度的蛋白检测或者首次确认蛋白是否表达的实验中该试剂必不可少如果是常规蛋白的检测可以选择性价比最高的Millipore的WB产品该产品的灵敏度在duro(杜克)级别可以胜任绝大部分蛋白的检测如果您在使用冷光CCD成像那么建议您考虑Pierce的ECLplus(以前该产品线属于GE)该产品的性价相对较高最后如果您觉得您研究的蛋白丰度非常高那么推荐您使用Pierce的经典产品性价比尤为突出目前BioRad还推出了ClaritywesternECL系列产品号称该底物则带来了高灵敏度(fg级别)、持久信号和低背景(即使是长时间曝光)。这种特性的组合让它很适合胶片或CCD成像系统上的常规使用以检测高丰度和低丰度蛋白。以上介绍了ECL市场常见的几个进口品牌的主流产品其实在个别实验室也存在其他品牌的产品如GEPE天根碧云天等客户的端的反馈也都不错所以对于技术含量并不复杂的ECL发光试剂而言大家选择很多。如果您实验经费有限可以考虑常规检测使用价格低廉如国产产品探索性的或者微量蛋白的检测可以使用高端的如femto级别的产品如果您实验室经费充足那就更简单了直接购买femtopico级别的进口产品的即可实验更无忧。我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcnWB实验结果的优化在很多的情况下研究人员对WB的条带亮度不满意总是希望条带可以更浓一些下面会依次介绍多种改善手段。第一种即从源头上开始解决上样样品中目的蛋白的量由于大家在抽提总蛋白时蛋白浓度可能因为抽提试剂的用量不等导致总蛋白浓度不一所以浓缩蛋白溶液可以在一定程度上加大目的蛋白上样量用于浓缩的工具就是Millipore的蛋白浓缩管根据目的蛋白的分子量可以选择Millipore一系列的不同规格产品一般选择蛋白分子量或者截留分子量的滤膜产品防止目的蛋白的丢失。选择高灵敏度的ECL发光试剂如Pierce的飞克级超敏试剂盒也是解决这个问题的一个方法当然高灵敏度的发光试剂也会带来高背景的问题尤其是使用传统胶片曝光的时候这时候就需要搭配使用Pierce的胶片背景去除试剂盒该试剂盒可以非特异性的清洗胶片上面多余的杂带(见左下图)。但是如果采用高灵敏度的检测方法遇到杂带也比较浓那依赖非特异性的胶片背景去除试剂盒也无能为力了因为洗脱时间过久的同时目的条带同样会被洗脱掉。这时候就需要考虑Merck的产品和Pierce的另一个产品了(见右下图)因为两者的功能都是加强一抗和抗原二抗的结合效力(这个是特异性的作用)所以在一定程度上甚至可以降低一抗二抗的使用量(降低抗体的使用量同时也降低了由其带来的非特异性杂带)而且也增强了目的条带信号的发光强度。在很多的实验室我们发现strippingbuffer也即抗体剥离液并没有被广泛使用很多研究者并未注意到该产品在很多情况下是一个非常给力的工具。如果在一个样品中您需要研究的蛋白不止一个而且这两个蛋白的分子量又很接近那么您在不用抗体剥离液前提下需要跑多次胶转多次膜而如果您采用了抗体剥离液您可能仅仅需要跑一次胶、转一张膜即可而且所有的指标在一张膜上面依次检测的结果更科学。Pierce的产品可以反复在膜上剥离次而不会对膜上的各种蛋白产生明显的影响。当然遇到下面两种情况时需要更改不同货号的剥离液产品当目的蛋白与抗体的结合较为“顽固”时建议使用Pierce加强型的剥离液当实验要求剥离WB荧光抗体时需要使用Pierce专门应对的产品RestoreFluorescentWesternBlotStrippingBuffer。每一位研究者的实验发现最终都需要以文字图片的形式呈现出来发表文章除了涉及的文字表述需要精雕细琢图片的选择更是百里挑一当然我们更希望图片尤其是WB的图片能够一次成功所以每次实验都能对WB的实验结果进行优化就显得格外重要。无论是非特异性的胶片洗脱剂还是一抗二抗稀释液在很大的程度上都能使图片的信号更明显背景更干净。我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcnCellculture细胞培养和转染实验细胞培养器皿的选择细胞培养用器皿一般为细胞培养板、培养皿和培养瓶大家根据实验室的使用习惯或者具体的实验需求可以随意选择。关于产品的品牌目前主流的有进口品牌Corning、BD和NUNC和国产品牌如NEST(耐思)等其实Corning和NUNC的细胞培养耗材早在几年前已经开始了国产化换句话说实验室目前在使用的所谓进口品牌的耗材十之八九都是产自国内据终端反馈品质还是要比先前的纯进口产品差那么一点点当然这个差距在培养大众化的细胞方面还是不易察觉。在这些所谓进口的品牌里他们的品质或者价格并没有太大的差距所以更多的情况下还是从实验室的使用习惯中选择品牌。在这里我们值得提出的是NUNC的培养瓶由于底层表面的修饰可以更好的使细胞贴壁所以研究贴壁细胞的时候可以倾向性的选择NUNC的细胞培养瓶。血清的选择血清主要是分为胎牛、新生牛、小牛血清后两者一般品质差别不是很大品质仅能满足各种肿瘤细胞或者细胞系的培养而且大部分情况下用于工业化大规模细胞培养所以科研中使用这种血清的实验室很少。需要提醒一点如果您在使用这些血清仅仅从血源品质来看(不包含加工工艺)国内的血源要比国外无论是Hyclone还是Gibco的血源更为优秀。关于国内常规的胎牛血清其中绝大大部分的血源来自于澳洲和南美(因为欧洲、日本和北美的血源因为疯牛病的原因进不到国内)对于不同血源产地的品质比较目前的看法是北美血源>澳洲血源>南美血源。在国内北美的血清应以Gibco的为代表无论是价格还是血清品质都有很大的竞争力但问题主要是非正规渠道所以运输供应并不是很有保障而且最近出现了很多假货让部分忠实于该产品的客户难以甄别。而对于由正规渠道进入国内的澳洲血清Gibco的占据着大半江山遥遥领先于其他竞争对手。其稳定的品质深得大家信赖对于刚刚接触细胞培养尤其是原代细胞培养时建议大家可以选择这款产品其次就是Hyclone的SH也占有一定的市场份额该产品品质适中价格相对较低而且依赖Hyclone的口碑仍具有一定的竞争优势除此之外我们在这里需要提到另一个品牌Biochrom这是个德国的品牌虽然进入国内时间不长但是品质在客户端的反馈相当不错中科院生化细胞所有不少实验室都在使用据说该澳洲来源的血清不仅可以饲养普通的传代原代细胞甚至可以饲养各种干细胞而且品质不俗的同时价格却相当亲民。提到南美血清必须要介绍Hyclone的SV南美血清该血清在国内的年销量遥遥领先于其他竞争对手占有中低端血清市场中的绝大部分份额。该产品血源来自于南美洲的个别国家血源进入国内后在Hyclone的国内工厂进行灌装所以该产品的价格相对澳洲、美洲血清相对低廉但品质却足以满足各肿瘤细胞细胞系的培养要求。如果实验室经费有限那么建议大家可以考虑采购该血清用于饲养普通的肿瘤细胞或者细胞系。关于细胞培养中涉及的另外一类细胞即干细胞的培养除了目前愈来愈流行的无血清培养基外就是对高品质血清的要求。干细胞中的间髓充质干细胞要求相对较低普通澳洲血清或者SH就可以满足其培养需要甚至南美胎牛血清SV也有成功应用的案例。但是对于胚胎干细胞尤其是人的胚胎干细胞因为要求比较苛刻所以就需要使用经过胚胎干细胞经过验证的血清才能满足培养要求这里推荐大家可以选择我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcnHyclone的SHE该血清是Hyclone首次在国内推出的澳洲血源的ES血清。GIBCO也有系列干细胞血清很遗憾由于产地北美(和)所以进入不到国内同样Hyclone的一款经典ES血清SHE金标血清也因为该原因进不到国内。培养基的选择十年前大家使用的哺乳动物细胞培养基清一色的Gibco产品经费充足用量较少的实验室使用其GIBCO美国原装进口的液体培养基经费有限用量较大的实验室购买其袋装的粉剂。但是Hyclone国产液体培养基(如下列表)的推出很快就打破了GIBCO在国内细胞培养基领域的垄断仅仅元ml的销售价格和稳定的品质很快从液体培养基市场上抢占了半壁江山而且这个差距在逐步扩大并抢走了Gicbo前期的不少使用干粉培养基的客户。这直接刺激了各大培养基国外品牌包括GIBCOCellgro等都在涉足培养基的国产化生产其中Gicbo的液体培养基价格比Hyclone稍贵大约在元ml品质也很优秀。液体培养基从成本和稳定性角度来看取代粉剂是早晚的事情所以如果大家在饲养普通的细胞可以直接选择购买各大品牌的国产化液体培养基该产品品质完全胜任一般的细胞培养。货号品名货号品名SHBDMEM低糖SHBRPMISHBDMEM高糖SHBDMEM高糖(含丙酮酸钠)SHBDMEMF(:)SHBMSHBMEMSHBPBSSHBFSHBαMEMSHBDPBSSHBIMDM胰酶双抗三抗等各种添加物的选择胰酶的表现在各大品牌里面可能还是数GIBCO产品如(EDTA)较佳但Hyclone等品牌的产品如SH(EDTA)的品质也可以完全可以胜任普通的实验要求。坦率的说抗生素并非是一个细胞培养中必须的组分而且在一些特殊的细胞培养中还需要避免使用他们但是在各个普通细胞培养实验中其实大家都倾向于添加他们原因就是抗生素的存在是一种保险避免个别细菌的污染。关于抗生素的选择只要是进口的产品基本都可以满足实验需要比如较为常用的就有GIBCO的和Hyclone的双抗SV。另外目前部分细胞培养中用到了三抗(青链霉素两性霉素)产品从现货的角度考虑可以选择Hyclone的SV产品。G这个抗生素一般用于各种转染后的细胞筛选能够提供G的厂家多如牛毛常见就有MerckRocheInvitrogenSigmaHycloneAmresco等各大知名厂商在这里无论从性价比还是从市场占有率我们都倾向于推荐Merck的产品。另外市场上G所谓进口分装的产品不仅选择多而且价格非常低廉建议大家慎用。特殊培养基的选择无血清培养基产品在科研领域很大一块是用于胚胎干细胞的培养如Gicbo的KnockOut™SerumReplacement产品可以说基本占据了国内的绝大部分科研市场另外一部分是用于昆虫细胞的培养Gibco的和Hyclone的SH应用都比较普遍。还有就是针对间充质干细胞的培养基如Invitrogen的成脂培养基AStemPro®AdipogenesisDifferentiationKit成骨培养基AStemPro®OsteogenesisDifferentiationKit。。我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcn细胞冻存产品的选择关于细胞的冻存冻存耗材可以选择Coring或者Nunc的冻存管两个品牌的产品内壁都进行了化学修饰使其对各种蛋白的非特异性结合降到最低。另外冻存管分为内旋和外旋从避免污染的角度出发建议使用外旋产品如Nunc的。冻存的另外一个耗材就是NUNC的等温梯度降温盒C该产品目前在各个实验室正在逐步普及价格也相对低廉所以如果以前没有使用过的客户可以考虑尝试下。冻存涉及的关键试剂就是二甲基亚砜DMSO该级别的产品在科研上基本上都是由SIGMA的D一统江山。细胞培养产品中遇到的问题血清在融化过程中经常出现不同程度的絮状沉淀这些沉淀的出现给后面的实验带来了不少影响如细胞状态变差细胞在显微镜视野下不清晰等等。但关于沉淀的解释无论是GIBCO还是Hyclone等其他厂家都有类似的解释即这些沉淀仅仅是血清中各种纤维蛋白等营养物质的凝集不会对血清的品质造成影响……所以作为用户大家所能做的一个是避免选择有大量沉淀发生的血清批次(轻微絮状沉淀的血清很常见)。如果购买的血清不幸遇见有沉淀那么建议按照以下方法处理:量较少的时候静置后取上清直接使用量多的时候将血清过滤后使用。很多实验室在更换不同品牌或者不同批次血清的时候会发现细胞状态变差这时候就会质疑新血清的品质。其实很多情况下这与新血清的品质没有关系主要是因为细胞直接接触一个新的培养环境而产生不适随着时间的推移细胞的状态会逐渐转好。当然也可以选择更好的解决途径研究人员需要在更换血清时做驯化试验即利用新血清逐渐替换老血清的比例不要一次性的将老血清全部替换掉这样使细胞能够逐渐适应新的培养环境。细胞培养液在培养后的过程中出现游动的小黑点随着小黑点的增多细胞状态会变差甚至死亡。很多用户认为这些小黑点是血清里面带来的所谓“黑胶虫”但是各个血清厂家对此说法予以否认他们的解释是“磷酸钙等不溶性无机盐造成的沉淀在做布朗运动”。当然作为一种生物的黑胶虫的确在采用各种检测方法后确认为是不存在的但是其是不是与血清相关我们暂时也不好排除。如果有不幸的客户遇到了这种状况建议更改血清的同时改善各项培养条件为宜。细胞的转染谈及转染Invitrogen认第二没人敢认第一。这么多年来Invitrogen一直保持着转染市场的领先地位经典的阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine对于做转染的人来说几乎是无人不晓直至今日仍然占据着市场的最高份额。为什么Lipofectamine会这么受欢迎?根据Invitrogen网站的资料Lipofectamine已经证实可用于高达种细胞株(覆盖了相当广的范围)而且Lipofectamine可以适用于包括DNAsiRNA,dsRNA荧光标记的Oligo,RNA等在内的核酸转染这使得Lipofectamine适用范围也非常广泛无论是基因表达分析的DNA转染或者是RNAiLipofectamine都能胜任。除了诸多优点Lipofectamine还有一项最为人称道的是其高转染效率相关数据再Invitrogen的网站也有提供。当然它唯一的缺点就是该试剂对细胞的毒性相对较大。同Invitrogen的Trizol一样由于产品的极度畅销市场上出现了很多的假货甚至有不法商贩将正品稀释后分装这更让人抓狂。所以购买相关产品一定要选择正规渠道。最后研究人员在使用Lipo的时候需要注意以下几点:I制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂因为血清的存在会影响复合物的形成II转染的时候培养基中不能添加抗生素III该试剂只能度密封保存切记不能冻存。市场上的主流产品除了Invitrogen的Lipo外另一个大块头就是Roche的系列产品了。首先是前两年其销售的FugeneHD系列产品由于该试剂在保证一定转染效率的基础上对细胞的毒性非常小所以深受客户喜爱并因此抢走了不少Lipo的客户(但目前该系列产品的销售权已经转给了Promega公司)。后面它又同时推出了XtremeGENE和XtremeGENEHP转染试剂。前者为多种常用的细胞系带来了高效的性能而后者则更适合于难转染的细胞比如原代细胞、昆虫细胞。这两款试剂有一点与Fugene很相似那就是对细胞温和。所以如果对细胞的毒性有特别要求的话可以考虑Roche的产品。我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcn免疫组化实验IHC免疫组织化学(IHC)从免疫学的大范畴而言包括石蜡切片的免疫组化(IHCP)、冰冻切片的免疫组化(IHCF)免疫荧光(IF)免疫细胞化学(ICC)等几种。IHC一抗的选择在IHC领域比较经典的抗体品牌有Neomarker、DAKO和Lifespan但前两个品牌由于市场推广策略的问题正逐步淡出用户的视线只有很多病理科的老师对他们仍然钟爱有加而Lifespan品牌由于价格的昂贵在国内也并没有被大家所接受。现在更受研究者青睐的是Abcam、CST、Millipore等主流品牌尤其是Abcam的抗体种类多、品质优而且说明书上面提供了丰富的验证图片更加受到客户的喜爱。选择IHC一抗首先比较各品牌实力和验证图片然后查看抗体用途、工作稀释比例和种属来源。如果迫不得已不经意选择一个不常见的hamster作为一抗的宿主那么在很多状况下可能要花费额外的钱去购买一个价格不菲针的antihamster酶标二抗。另外绝大多数的抗体品牌如Abcam在阐述抗体的用途时所提及的都是具体的应用如说明书仅提及IHC用途说明该抗体只能做IHCP或IHCF其他如ICC和IF均未经过验证。但是有个品牌RD例外其抗体的用途提及IHC时基本上都是指上述所有的用途如IHCF、IF、ICC等这可能源于它们制备抗体时使用的免疫原为重组蛋白相关且抗体大部分是多抗的原因所以大家选择需要注意。多抗好还是单抗好?不仅在IHC在WB同样会面临这个问题很多客户可能都会认为单抗好。这里需要给大家做个澄清单克隆是指由一种克隆产生特异性的抗体其能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合所以它在WB检测时因为条带单一更受大家欢迎因此客户在做WB最关心的就是抗体是不是单抗多克隆抗体是指由好几种单克隆抗体的混杂物一般都是免疫动物后直接收集的抗血清前期的多抗因为仅仅利用proteinAG纯化所以非特异性的抗体就会掺杂其中给实验带来很高的背景。然而目前在多抗生产中除了使用proteinAG纯化有些还采用了抗原亲和纯化这就确保收集的抗体都是针对目标蛋白的各个抗原决定簇的所以彻底消除了非特异性的因素而且由于针对多个抗原决定簇所以捕捉的目标蛋白信号更明显对IHC检测更有帮助。多抗贵还是单抗贵?这个问题可以结合上一解释结合不同厂商的生产流程有不同的结论。一般单抗的制备较为复杂需要免疫老鼠脾细胞骨髓瘤细胞融合筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞培养收集培养上清proteinAG纯化多个繁琐步骤才能获得单抗但是理论上只要培养细胞抗体的得量就是无限的所以如果量小成本就很昂贵如果量大平摊后每支的成本就很低廉相比较单抗多抗的制备相对简单免疫动物收集抗血清proteinAG纯化抗原纯化看似步骤简单但是抗体得量有限如果实验中需求的抗体量少成本相对较低否则就较高毕竟动物成本和抗原的成本都要考虑。究竟是选择单抗还是多抗研究人员应该综合上述细节作出决定。选择SABCSP显色系统还是普通的酶标二抗?这个更多的决定于您研究目的蛋白在组织里面的丰度和实验室习惯我们从各大厂商IHC抗体的验证图片上发现很多情况下厂家仅仅使用了一个普通的酶标二抗。当然很多公司比如invitrogenZymed或者Neomarker、DAKO等品牌都有相关的级联放大的检测系统如SABC或者SP产品推荐这些产品在一定程度上更能使染色更清晰图片更漂亮所以不少客户更加倾向于这类产品的使用。相关的产品建议大家可以选择InvitrogenZymed的Histostain®SP系列产品或者选择博士德的产品SA(SABC(小鼠)POD试剂盒)或者SA(SABC(兔)POD试剂盒)后者虽然国产但价格低廉而且在IHC方面的产品表现的确不俗。现货产品实验技巧实验效率寻现货找申实我们不仅提供产品还提供技术服务上海申实生物科技有限公司wwweverylabcomcninfoeverylabcomcn抗原的修复需要根据具体的组织来源和抗体的说明书建议进行主要有两种修复方法:)抗原热修复:适用的抗原有:ARBaxBclCfosXjunCkitCmycEcadherinChromograninACyclinERHeatshockproteinHPVKiMDMZppppPglycoproteinPKCPRPCNArasRbTopoismeraseⅡ等。)酶消化方法适用的抗原有:CollagenComplementCytokeratinCerBGFAPLCALN等。对于非特异性的染色研究人员需要考虑:a对于内源性酶或生物素丰富的组织如肝脏、肾脏等是否有效地去除了内源性酶和生物素(Zymed可以灭活)b是否选择使用了正确的封闭血清c清洗是否充分。因在缓冲液中含有一定量的盐这亦有利于减低背景着色溶液内加入吐温效果更佳。封闭用的血清在IHC中涉及种类较多而且在面对不同的样本和抗体来源尤其在涉及双染时时选择合适的血清种类尤为重要。正常驴血清元mlJackson正常兔血清元

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