引物设计

In-Fusion PCR Cloning Kit -简便的构建重组 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达载体 的基因克隆方法- Creator System 简介 In-Fusion基因克隆配套元件包含pDNR-CMV和pDNR-Dual载体，这些载体是利用Cre-loxP位点将目的基因转移到受体 载体上。这就可以使各种受体载体接受目的基因。 供体载体 受体载体 宝日医生物技术(北京)有限公司 TaKaRa Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd. 地址：北京市昌平区科学园路22号（中关村生命科学园内） 邮编：102206 电话：010-80720985 80720986 免费咨询电话：8008106261 传真：010-80720989 E-mail:service@takarabiomed.com.cn 代理商联系信息 T7 启动子 M13 正向测序引物 SacB 选择标记 6xHN C末端标签 供体载体 启动子/特征 用 途 受体载体 启动子/特征 用 途 研究MCS上游T7 RNA聚合酶的引物/启动子在体内启动表达翻译的可能性 真核生物中通过内含子连接并在C末端添加标签 在细菌中基因的C 末端添加6xHN 标签 研究MCS上游T7 RNA聚合酶的引物/启动子在体内启动表达翻译的可能性 由于CMV启动子的存在，可以在移出哺乳动物细胞之前检验其性能 通过酵母双杂交原理来验证与GAL4 AD融合蛋白的互作 通过酵母双杂交原理来验证与GAL4 AD融合蛋白的互作 通过CMV启动子表达含有c-Myc标签或HA标签的非修饰蛋白并通过 neo抗性基因筛选稳定克隆 在哺乳动物细胞中通过一个读码框来表达靶基因和neo抗性标记 在哺乳动物细胞控制下大量表达 利用逆转录病毒载体在哺乳类细胞控制下大量表达 利用逆转录病毒构建表达载体 用于细菌控制下的大量表达 用于杆状病毒表达 CMV 启动子 M13 F/R 测序引物 T7 启动子 SacB 选择标记 ADH1/GAL4 激活域 ADH1/GAL4 DNA 结合域 Myc 标签融合在CMV/C末端 HA 标签融合在CMV/C 末端 CMV/promoter 和neo 抗性标记 CMV/IRES neo 抗性标记 通过Tet应答启动子诱导的真核载体 通过Tet应答启动子诱导hyg抗 性的逆转录病毒载体 具有CMV启动子和neo抗性标 记的逆转录表达载体 通过Tet应答启动子诱导细菌 内表达的载体 带有原核启动子的杆状病毒特性载体 Matchmaker vector 哺乳动物载体结构 双表达载体 Tet系统相关载体 逆转录病毒载体 原核表达载体 杆状病毒表达载体 引物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 方法 引物设计要点！ 1) 确定载体末端的15个碱基序列。 2) 引物的5'末端附加上述的15个碱基。 In-Fusion基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩 增，与常规PCR法是相同的。唯一的差异是载体末端 序列与引物5'末端附加序列具有15个同源碱基(右图)。 在In-Fusion用户手册中，展示出与pDNR-CMV载体 和pDNR-Dual载体对应的引物序列。如果利用其它载 体进行克隆时，载体末端和引物末端应具有15个同源 碱基。 In-Fusion引物设计，请利用在线支持工具。 http://bioinfo.clontech.com/infusion/ 组合 和 的应用例 无限制性内切酶位点也可以进行基因克隆 PCR扩增 插入片段 M P1 P2 V P1 P2 V M 4 → 3 → 2 → 1 → Type 1 Type 2 kb P1: PCR扩增得到的线性载体pkF3(2.2 kb) P2: 基因克隆所插入的DNA片段(1.1 kb) V: In-FusionTM基因克隆后得到的重组载体 (3.3 kb 单酶切) M: Wide-Ra 【方法】 ① 载体(pKF3(Cmr))做为模板，以载体上任意位点末端序列的互补碱基序列为引物，并用PrimeSTAR HS DNAPolymerase进行PCR扩增。 ② 另一方面，插入DNA片段(Ampr遗传基因)的制作，使用末端附加同源序列(15~16个碱基)的引物结合于上述基因位置附近进行PCR扩增。 ③ 经过PCR处理后，将PCR扩增产物和线性化载体加入In-Fusion反应液中，并进行转化和筛选(用Amp/Cm进行阳性克隆筛选)。 【结果】 鉴定阳性转化子，Type1，2中确定重组表达载体构建完成。 相关产品 货 号产品名称 容 量 主要成分 有无感受态细胞 干粉型（添加Cloning Enhancer） 8 次（8联管×1） 有 24 次（8联管×3） 无 96 次（96孔板） 无 干粉型（标准） 24 次（8联管×3） 有8 次（8联管×1） 有24 次（8联管×3） 无 96 次（96孔板） 无 100 次 无50 次 无 50 次 24 次 液体型 纯化柱 感受态细胞 附加的独特序列 上述15个同源碱基序列 不再受载体和酶切位点的序列限制，不再受多余碱基序列的影响，In-FusionTM 技术实现真正的直接克隆！ 不再受载体和酶切位点的序列限制，不再受多余碱基序列的影响，In-FusionTM 技术实现真正的直接克隆！ 简介 使用任何载体，在任何酶切位点都能够完成目的基因的克隆重组！ Clontech的In-Fusion PCR Cloning Kit是基于In-Fusion酶的专利产品，只要插入的DNA 片段末端与载体末端具有15个同源碱基序列就可以完成克隆重组。选定载体并确定克隆位置 的碱基序列，根据In-Fusion引物设计原则设计相应的引物，然后扩增目的DNA片段。按照简 易操作手册将PCR扩增产物、线性化载体和In-Fusion酶混合只需30分钟，就可以将DNA片 段克隆到载体上！ 传统的克隆是利用限制性内切酶处理DNA片段，并克隆到载体上的方法来构建重组表达载体，构建好后再进行亚克隆 的操作很繁琐！使用In-Fusion技术，以下操作变得简捷有效。 利用In-Fusion PCR Cloning Kit一步反应就能将目的DNA片段导入载体，并且构建出出色的蛋白质表达载体。不受限制 性内切酶的限制并减少亚克隆所带来的麻烦。由于目的DNA序列以外的其它序列不被导入载体，所以只有目的DNA序列表 达出来。 如果载体是使用高保真PCR酶进行扩增，即使序列上没有特定的限制性内切酶位点克隆也可进行（应用实例）。 参考文献 基因克隆高通量（HTP）技术在炭疽杆菌蛋白质结构研究中的应用 ● Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, 2006 Oct, 62, 1267-1275. ● BIO VIEW 53号、26~27页 利用In-Fusion PCR基因克隆高通量 (HTP) 技术构建重组蛋白质表达载体的方法 ● Nucleic Acids Research , 2007, Vol. 35, No. 6 e 45. 一次反应就可以完成克隆与重组蛋白质表达载体的构建，并不产生多 余的碱基序列。 In-Fusion PCR基因克隆操作手册 利用限制性内切酶处理DNA片段，并克隆到载体上的方法。 构建好表达载体后，亚克隆到其它载体比较困难。 除了目的DNA序列还附加其它序列，并担心影响蛋白质的表达量 和溶解性。 DNA片段较长并具有粘性末端，连接效率不高。 利用In-Fusion技术，上述难题就可以得到完全解决！ 设计引物进行 PCR In-Fusion 酶 DNA片段 重组表达 载体 蛋白质表达 In-Fusion PCR基因克隆的应 用文献 目前使用的表达载体 目的基因表达 使用设计好的引物*1进行PCR扩增制备目的DNA片段。 目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1混合到10μl去离子水中，再加入到含有 In-Fusion酶的管中42℃孵育30分种（In-Fusion 1.0）*2，有的在37℃孵育15分 钟然后50℃孵育15分钟 (In-Fusion 2.0)，最后混匀转移到冰上。 转化到大肠杆菌中。 参照操作手册里面In-Fusion primer的设计方法。 克隆长片断时，延长反应时间到2小时。 实验前的准备工作 基因克隆的优点 优化的 ● 设计的引物末端与载体末端具有 15个同源碱基 ● 线性化载体 （实验室现有的就可以） 含有15个同源 碱基的引物 线性载体 基于In-FusionTM Enzyme的铰链置换 转化大肠杆菌培养基筛选 In-FusionTM Enzyme高效活性 反应 30分钟 In-FusionTM Enzyme 将载体和目的基因连接 任意载体 任意载体 任何载体都可以 与In-FusionTM Enzyme 混合 PCR扩增 15个碱基 目的基因 采用柱纯化 添加In-Fusion Enhancer液 （旧版本） 基因克隆法可以将目的基因 克隆到任意载体 不需要柱纯化 可以克隆的DNA片段从0.5 kb~12 kb。 《各种长度DNA片段的克隆》 无论使用限制性内切酶处理，还是进行PCR扩增，只要是线 性化载体就可以。目的DNA片段的PCR扩增产物末端与载体 末端具有15个同源碱基。 In-Fusion 2.0是与Cloning Enhancer相结合，它同时也参与 到连接反应中。 与以前产品相比，克隆效率更高，连接的目的DNA片段更广泛。 插入片段大小 菌落数（接种量） 阳性转化子比率 《载体使用举例》 载体 酶切位点 克隆数 阳性率 载体 大小 利用3-12 kb的10种载体进行In-Fusion基因克隆。相比之下其它克隆方 法需要进行限制性内切酶处理载体，进行简单的基因克隆，而利用In- Fusion可以是任何载体。 用In-Fusion 2.0将0.5~12 kb DNA片段克隆到pDNR-Dual载体(4.9 kb) 上。无论短片段还是长片段DNA克隆效率都很高。 *:凝胶电泳能观察到非特异的条带。 可以克隆通过柱纯化制备的长链目的DNA片段（8 kb、12 kb） 应用各种产品克隆长链目的DNA片段（8 kb、12 kb）的试验比较 公司 公司 插入片段大小（kb） S公司 I公司 插入片段大小（kb） S公司 I公司 表一 转化效率 表二 阳性克隆比例 插入片段的验证 线性化的载体pDNR-Dual，末端序列具有15个同源 性碱基，按照操作手册设计引物。 利用热启动DNA聚合酶PCR扩增8 kb、12 kb目的 DNA片段。 线性化pDNR-Dual载体进行In-Fusion基因克隆 蓝白斑筛选 将S公司和I公司的克隆试剂盒同时克隆8 kb与12 kb 目的DNA片段，并作出比较。I公司使用具有特殊 序列的引物进行PCR扩增，并使用通过柱纯化的目 的DNA片段。 从使用In-Fusion 2.0试剂盒的转化效率(表1)、阳 性克隆的比例(表2)中可以看出，与其他公司产品 相比，In-Fusion 2.0具有良好的性能。 使用In-Fusion是否需要取得进出口许可证？ 如果企业使用，并且用于基础研究，没有必要取得进出口许可证。目 前该试剂盒受到企业很多研究人员的青睐。 In-Fusion酶的机理是什么？ 根据In-Fusion酶特殊的性质，插入片段和载体在同源序列（15个碱 基）处融合。这与一般的同源重组是有差异的，因此克隆不再有位置 和空间的限制。 如何选择PCR酶？ 使用任何PCR酶都可以，但根据上述例子推荐使用PrimeSTAR。 PCR产物的结构有限制吗？ 没有特别的限制。PCR产物末端有无A尾都能使用。 公司 In-Fusion Kit FAQ 载体末端的结构有限制吗？ 没有特别的限制。载体末端是平滑末端或是粘性末端都能使用。 引物附加序列如果不是15个碱基可以吗？ 15个碱基最好。如果引物附加序列为10～20个碱基也可以。 In-Fusion酶的保存应注意什么？ 冻干型室温保存。因为空气中存在湿气，应在干燥器等干燥地方保存。 In-Fusion 2.0 PCR Cloning Kit的Cloning Enhancer的作用是什么？ 在In-Fusion基因克隆时用于PCR产物的预处理。经过处理，能去除 PCR反应液中的引物和dNTP的影响，使In-Fusion酶的性能发挥到 最大。柱纯化会造成样品损失，即使少量的样品也能够达到很好的连 接效果。