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HPLC法测定全血中秋水仙碱.pdf

HPLC法测定全血中秋水仙碱

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2014-03-21 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《HPLC法测定全血中秋水仙碱pdf》,可适用于自然科学领域

中国卫生检验杂志年月第卷第期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnologyAprVolNo【论著】HPLC法测定全血中秋水仙碱陈晓红李小平姚浔平(浙江省宁波市疾病预防控制中心浙江宁波)摘要目的:建立测定全血中秋水仙碱的简便、灵敏、准确的高效液相色谱二极管阵列(DAD)检测方法方法:全血样品经%三氟醋酸乙腈溶液提取后用WatersOasisMCX小柱进行净化在ZORBAXEclipseXDBc柱(mmX.mmxm)上以乙腈.%三氟醋酸()为流动相二极管阵列(DAD)紫外am检测柱温℃外标法定量。结果:秋水仙碱在..ms/L范围内均具有良好的线性血样中定量检出下限为.nqs/L方法回收率为.%一.%RSD小于%。结论:该方法的建立具有灵敏度高、操作简便、快速、准确适用于中毒病人的中毒诊断。关键词】全血秋水仙碱高效液相色谱二极管阵列中图分类号.文献标识码A文章编号()DeterminationofcolchicineinwholebloodbyHPLCChenXiao一LiXiaopingYaoXunping(NingboMunicipalCenterforDiseaseControlandPreventionNingboChina)Abstractbjeetlve:ToestablishasimplesensitiveandaccuratemethodforthedeterminationofcolchicineinwholebloodbvHPLCDAD.Methods:Aftercolchicineinwholebloodwasextractedby%TrifluoroaceticAeetonitrile.thesamplewascleanedwithsolidphaseextractionusingOasisMCXcartridgesandthecolchicineWasseparatedonZORBAXEclipseXDBCcolumn(mmx.mmxm)withDADdetectionatambyusingthemobilephaseconsistingofAcetonitrile(%)and%Trifluoroacetic(%).ThecolumntemperatureWSScontrolledat℃.Results:Calibrationcurvewaslinearwithintherangeof..mg/LandtIlelimitofquantificationwasfoundtobe.mg/LTheextractionrecoveryWasbe.tween.%~.%.the月.sDwaslessthan%.Conclusion:rI'hismethodissensitive.fastandaccuratefordeterminationofRacecolchicineinwholebloodandcanbeusedinthediagnosisoftheclinicalpoisonedpatients.『KeywordswholebloodColchicineHPLCDAD秋水仙碱作为抗痛风药物在临床应用已多年它作为抗肿瘤药尤其是对乳腺癌有较好的疗效但是如果摄入过多就会引起中毒。成人一次食入..mg的秋水仙碱即可引起中毒。一旦中毒便会出现咽干、烧心、口渴、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状严重者可出现血便、血尿或尿闭等现象如果一次食入mg的秋水仙碱就可致人死亡。目前在药物中测定秋水仙碱大都采用电化学法、荧光光度法以及HPLCUV检测法但对于生物样品的检测国内还未见报道。本文采用乙腈.%三氟醋酸()为流动相二极管阵列(DAD)紫外nm检测高效液相色谱法测定全血中的秋水仙碱取得了满意的结果具有简便、快速、准确的优点。材料与方法.试剂乙腈为HPLC级(MerckDarmstadtGermany)三氟醋酸为AR级(MerckDarmstadt.Germany)所有的溶剂使用前均用作者简介陈晓红(一)。女在职硕士副主任技师主要从事理化检测研究。.m滤膜过滤。秋水仙碱(含量>.%Sigma公司)标准贮备液(.mg/m):准确称取.mg秋水仙碱标准于OmI容量瓶中用少量甲醇溶解后并用甲醇定容至刻度实验用水均来自MilliQ纯水系统空白全血(采自健康人静脉经肝素抗凝)OasisMCX固相萃取小柱(ml/mg美国Waters公司)。.仪器AgilentlseriesMSDTrapSL型高效液相色谱一质谱联用仪包括四元泵、在线真空脱气机、DAD检测器、柱温箱、自动进样器和ESI源(美国Agilent公司)YXJII高速离心机(常州澳森电器有限公司)VORTEXGENIE型旋涡混合仪(美国)KQ一型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)全玻璃溶剂过滤器(美国Waters公司)HGC一型氮吹仪(天津恒奥科技有限公司)MilliQ纯水系统(美国Millipore公司)ml的具塞聚四氟乙烯离心管。l色谱条件色谱柱:ZORBAXEclipseXDBc柱(millX.mmxm)流速:.mlfmin柱温:℃流动相:乙腈.%三氟醋酸(十)。维普资讯http:wwwcqvipcom中国卫生检验杂志年月第l卷第期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnologyAprVolNo.样品处理准确取血样于ml具寒聚四氟乙烯离心管中加入的%三氟醋酸乙腈溶液于旋涡混合仪上混合min超声minr/min离心min吸取上清液于另一离心管中再用%三氟醋酸乙腈溶液重复提取一次合并有机相在~C水浴上用氮吹仪浓缩至干用ml.moL/LHC溶解后过OasisMCX固相萃取小柱(预先以ml甲醇和ml水活化)相继以ml.moL/LHC、ml甲醇和%氨水:甲醇(:)淋洗杂质用ml含%氨水:甲醇(:)溶液洗脱待测物洗脱速度控制在.mL/min以下。收集洗脱液在o℃水浴上用氮吹仪浓缩至干残渣用ml甲醇溶解涡旋混合上机自动进样(进样量为)测定(见图)。^|时间(rain圈l血样中秋水仙碱色谱圈结果与讨论.色谱条件的优化.检测波长的选择利用二极管阵列检测器在线扫描扫描波长为nm得到秋水仙碱的紫外吸收光谱图(见图)本实验选择检测波长为nm。波长(rim圈秋水仙碱DAD紫外波长扫描图.色谱柱的选择本实验试验了XDBCI、SBCl及XDBc(均为mm×.mm×I~m)种色谱柱采用不同比例的乙腈.o%三氟醋酸为流动相进行分析的情况。结果表明XDBC柱对秋水仙碱具有较高的灵敏度而且峰型尖、对称性好等优点。..流动相的选择本文参照文献选择乙腈水体系作为流动相在水相中添加三氟醋酸调节pH试验了添加不同浓度的三氟醋酸对检测秋水仙碱的影响实验表明添加低浓度的三氟醋酸不仅能提高灵敏度而且能有效地改善色谱峰的拖尾现象。.进样体系的选择本文分别用乙腈、甲醇和流动相来配制标准溶液进行测定结果显示用秋水仙碱的乙腈溶液其峰型呈馒头型且拖尾。用流动相来配制标准溶液峰尖但存在一定的拖尾甲醇溶液的色谱峰尖且峰型对称。.全血中的提取条件秋水仙碱为碱性化合物根据文献报道提取方法有酸化提取和碱化萃取两种’本实验利用三氟醋酸来沉淀蛋白用%三氟醋酸乙腈溶液进行酸化提取。提取后的样品过固相萃取小柱进行净化。.清洗液、洗脱液的选择提取后的样品过OasisMCX固相萃取小柱(预先以Tlll甲醇和ml水活化)后依次用.moL/L的HC、甲醇和%氨水:甲醇(:)进行清洗除去杂质。由于固相萃取柱是利用固体吸附剂吸附样品中的目标化合物使之与样品基体和干扰化合物分离然后再用洗脱液洗脱达到分离和富集目标化合物的目的。为此本文选择酸和碱进行清洗减少基体干扰清洗时为确保目标化合物不被洗下来必须控制一定的酸碱浓度。结果显示酸洗时HC的浓度不能大于.moL/L而碱洗时甲醇的比例不能大于%。本文试验了各种比例的%氨水与甲醇溶液甲醇比例小于%时其洗脱能力为零随着甲醇比例的增大其洗脱能力也随之最大当甲醇比例达到%时其洗脱能力为lo%为此本实验选用的清洗液甲醇浓度为%洗脱液甲醇浓度为%。.方法专属性准确吸取份健康人空白全血样品各将一定浓度的秋水仙碱标准溶液加入空白全血中按l项进行操作测定用seriesMSDTrapSL型高效液相色谱一质谱联用仪对色谱峰进行鉴定。结果表明样品的平均质谱图与秋水仙碱的标准质谱图完全一致所获得的色谱图具有高度的专属性秋水仙碱的质谱图(见图)。Jjl。..m/z圈秋水仙碱标准一级质谮图.标准曲线和检出限准确吸取份健康人空白全血样品各加入一定量的秋水仙碱标准液配制成相当于浓度为、.、.o、.、.、.mg,/L的秋水仙碱全血样品按上述条件进行测定以秋水仙碱的浓度(Xme,/L)对相应的峰面积(Y)进行线性回归得到回归方程及相关系数Y=.X一.r=.。目标组份在..me,/L范围内均具有良好的线性按S/N=计算检出限为为.me,/L。.方法的回收率和精密度分别在份健康人空白全血样品中加入一定量的标准液其浓度分别为.、.o、.me,/L各份按上述方法检测计算其回收率。每个样本重复测定次方法回收率为.%~.%RSD小于%可满足临床检测要求。.模拟样品测定在份ml空白全血样品中加入一定量的标准液于旋涡混合仪上混合min配制成浓度分别为.、.、.、.、.me,/L的模拟样品按上述方法进行测定。每个(下转第页)维普资讯http:wwwcqvipcom中国卫生检验杂志年月第l卷第期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology。AptVolNo药敏试验详见表。表福氏志贺菌c亚型药敏试验结果S’:表示敏感‘R’:表示耐药。讨论通过以上生化试验、血清学试验、噬菌体裂解试验等特性可以证明这是一株志贺菌新菌型在查阅有关资料。和目前的抗原对照表.以及国外曾有报道来看拟命名为福氏志贺菌c亚型该菌型在我省属首次报道。世界各地流行的菌群每二三十年发生一次变迁。群型的划分对调查传染源判断复发与再感染了解流行菌群、菌型的变迁以及菌苗制备均有重要意义H。所以提醒广大菌种鉴定人员要注意新菌型的出现。此次腹泻患儿起初症状是下腹部持续性钝痛伴有腹泻为黄色稀水样便每日余次无里急后重无发热未予重视。此后症状加重大便性状为暗红色果酱样量不多每日次并伴有低热.~C大便常规检查有脓细胞、红细胞。这些起初的不典型症状提醒基层广大临床工作者由于微生物的变异一些疾病出现了不典型症状所以在诊疗和检验中要细心观察仔细分析才不至于贻误治疗。由于细菌为了生存出现了生化特性的变异。此株细菌与另两株”。靛基质、阿拉伯糖试验结果出现异同。这说明在细菌的鉴定过程中生化试验不能作为鉴定的单独的依据.必须结合形态特征、培养特性、血清学特征等综合判断。通过药敏试验可以帮助临床医师选择效果更佳的药物进行抗感染治疗并能了解本地区致病菌耐药性变迁情况。目前抗生素耐药性问题已成为全球关注的焦点。我国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一.耐药菌引起的医院感染人数已占到住院感染患者总人数的%左右。此次试验也不例外如对治疗菌痢效果比较好的氟哌酸、庆大霉素等都出现耐药性而且氟哌酸试验结果本株与另两株l¨各不相同。细菌耐药性主要是由耐药性(R)质粒所介导J。通过耐药质粒传递的耐药现象在自然界所发生的细菌耐药现象中最重要也最多见在临床上占有重要地位J。R质粒能使细菌产生特异酶可使抗菌药物失效.当微量诱导物如少量抗菌药存在时即可产生大量特异酶增加细菌耐药性。因此建议临床使用抗菌药物应遵循以下原则:首先必须确诊为细菌感染其次查找感染病原再次进行药敏试验根据病原种类药敏结果以及药物自身和在人体内作用特点综合选用药物。预防因为滥用抗菌药物造成更多变异菌株的产生危害人类生体健康。参考文献孙勇详金以森毛建勋等.福氏志贺菌c亚型生物学特性研究ipaH基因检测J中国卫生检验杂志():.余玮.一株Fc型志贺菌的检出J.现代预防医学。():.何晓晴.卫生防疫细菌检验M.北京:新华出版社..吴文漪查祖瑚.传染病学M.南京:东南大学出版社.周贵民张军民.我国细菌耐药性监测应注意的几个问胚J.中华检验医学杂志():.孙长贵.细菌对抗菌药物耐药性研究进展J.临床检验杂志(特刊):.(收稿El期:I)(上接第页)样本重复测定次结果见表l。表模拟样品测定结果(=l小结本文建立的高效液相色谱法二极管阵列检测器测定全血中秋水仙碱检测方法它可为临床诊断提供科学的依据。参考文献卞晓岚翟青张芳华等.高效液相色谱法测定复方秋水仙碱胶囊中秋水仙碱的含量J.广东微量元素科学():.于素华胡教冷宗周.碳糊电极阳极伏安法测定秋水仙碱J.药学学报():刘永明李桂枝.荧光光度法测定片剂中秋水仙碱的含量】.分析化学():.张润生余琛刘罡一等.血液中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的LC/MS/MS分析J.中国法医学杂志():.王朝虹叶敏邢俊波等.高教液相色谱/质谱法测定乌头碱在急性中毒大鼠体内的分布J.色谱():.王兆基何绍基徐树棋.液相色谱/质谱/质谱联用法测定乌头属药材及中成药中鸟头类生物碱含量J.分析化学():l一.RDamsTBen~tsWELamberta.SimultaneousdeterminationofopiumalkaloidsandopioidsinbloodandurinebyfastliquidchromatographydiodearraydetectionfluorescencedetectionaftersolidphaseextractionJ.JChromatogrB():.(收稿日期:)维普资讯http:wwwcqvipcom

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