单克隆抗体的制备
流程
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(一)动物的选择与免疫
1.动物的选择 纯种 BALB/C 小鼠,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,
食量及排污较小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的
实验室多选用纯种 BALA/C 小鼠。
2.免疫
方案
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选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质
量的 McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,
免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
(1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加
佐剂。常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射
(一般 0.8~1ml,0.2ml/点)
↓3周后
第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或 ip(腹腔内注射)
(ip剂量不宜超过 0.5ml)
↓3周后
第三次免疫剂量同一,不加佐剂,ip(5~7天后采血测其效价)
↓2~3周
加强免疫,剂量 50~500μg为宜,ip 或 iv(静脉内注射)
↓3天后
取脾融合
目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:
①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降
低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使
用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。
(2)颗粒抗原免疫性强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为
例,免疫时要求抗原量为 1~2×107个细胞。
初次免疫 1×107/0.5ml ip
↓2~3周后
第二次免疫 1×107/0.5ml ip
↓3周后
加强免疫(融合前三天)1×107/0.5ml ip 或 iv
↓
取脾融合
(二)细胞融合
1.细胞融合前准备
(1)骨髓瘤细胞系的选择:
骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂
交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。
(2)饲养细胞:在组织培养中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,若
加入其它活细胞,则可促进这些细胞生长繁殖,所加入的这种细胞数被称为饲养
细胞。在制备 McAb 的过程中,许多环节 需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛
选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:
小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤
维细胞系 3T3 经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为 2×104或
105细胞/孔。
2.细胞融合的步骤
(1)制备饲养细胞层:一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。
与免疫小鼠相同品系的小鼠,常用 BALB/C 小鼠,6~10 周
↓
拉颈 处死,浸泡在 75%酒精内,3~5min
↓
用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入 5~6ml 预冷的培养液(严禁刺破肠管)
↓
反复冲洗,吸出冲洗液
↓
冲洗液放入 10ml 离心管,1200rpm/分离 5~6min
↓
用 20%小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬,调整细胞数至
1×105/ml
↓
加入 96 孔板,100μl/孔
↓
放入 37℃ CO2孵箱培养
(2)制备免疫脾细胞
最后一次加强免疫 3天后小鼠拉颈处死
↓
无菌取脾脏,培养液洗 一次
↓
脾脏研碎,过细胞筛
↓
离心,细胞用培养液洗 2次
↓
计数
↓
取 108脾淋巴细胞悬液备用
(3)制备骨髓瘤细胞
取对数生长骨髓瘤细胞离心
↓
用无血清培养液洗 2次
↓
计数,取得×107细胞备用
(4)融合
①将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1:10 或 1:5的比例混合在一起,在 50ml 离心
管中用无血清不完全培养液洗 1 次,离心,1200rpm,8min;弃上清,用吸管吸净
残留液体,以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略
松动。
②90s 内加入 37℃预温的 1ml 45%PEG(分子量 4000)溶液,边加边轻微摇
动。37℃水浴作用 90s。
③加 37℃预温的不完全培养液以终止 PEG 作用,每隔 2min 分别加入 1ml、
2ml、3ml、4ml、5ml 和 6ml。
④离心,800rpm, 6min。
⑤充上清,用含 20%小牛血清 HAT 选择培养液重悬。
⑥将上述细胞,加到已有饲养细胞层的 96孔板内,每孔加 100μl。一般一
个免疫脾脏可接种 4块 96 孔板。
⑦将培养板置 37℃、5%CO2培养箱中培养。
(三)选择杂交瘤细胞及抗体检测
1.HAT 选择杂交瘤细胞
脾细胞和骨髓瘤细胞经 PEG 处理后,形成多种细胞的混合体,只有脾细胞与
骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在 HAT 选择培养液中培养时,由于骨髓瘤
细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶,故不能生长繁殖,而杂交瘤细
胞具有上述两种酶,在 HAT 选择培养液可以生长繁殖。
在用HAT选择培养1~2天内,将有大量瘤细胞死亡,3~4天后瘤细胞消失,
杂交细胞形成小集落,HAT 选择培养液维持 7~10 天后应换用 HT 培养液,再维
持 2 周,改用一般培养液。在上述选择培养期间,杂交瘤细胞布满孔底 1/10 面
积时,即可开始检测特异性抗体,筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期
间,一般每 2~3天换一半培养液。
2.抗体的检测
检测抗体的
方法
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应根据抗原的性质、抗体的类型不同,选择不同的筛选方法,
一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有:(1)放射免疫测定(RIA)可用于可溶性抗原、细胞 McAb
的检测。(2)酶联免疫吸附试验(ELISA)可用于可溶性抗原、细胞和病毒等 McAb
的检测。(3)免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的 McAb 的检测。(4)其它如间
接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。
(四)杂交瘤的克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过 HAT 筛选后的杂
交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更
多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体(特异性抗
体)分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆
化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化,否则抗体
分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗
体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆
化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,
从而丧失产生抗体的能力。
克隆化的方法很多,最常用的是有限稀释法
有限稀释法克隆
(1)克隆前 1天制备饲养细胞层(同细胞融合)。
(2)将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干,计数。
(3)调整细胞为 3~10 个细胞/ml。
(4)取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板,每孔加入稀释细胞 100μl。
孵育于 37℃、5%CO2孵箱中 。
(5)在第 7天换液,以后每 2~3天换液 1次。
(6)8~9天可见 细胞克隆形成,及时检测抗体活性。
(7)将阳性孔的细胞移至 24孔板中扩大培养。
(8)每个克隆应尽快冻存。
(五)杂交瘤细胞的冻存与复苏
1.杂交瘤细胞的冻存
细胞冻存液:50%小牛血清;40%不完全培养液;10%DMSO(二甲基亚砜)。
冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至 0℃后放
入-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。
2.细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出,放 37℃水浴中,在 1min
内使冻存的细胞解冻,将细胞用完全培养液洗涤两次,然后移入头天已制备好的
饲养层细胞的培养瓶内,置 37℃、5%CO2 孵箱中培养,当细胞形成集落时,检测
抗体活性。
(六)单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:
(1)体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从一清液中获取单克隆抗
体。但此方法产量低,一般培养液内抗体含量为 10~60μg/ml,如果大量生产,
费用较高。
(2)体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。
①实体瘤法:对数生长期的杂交瘤细胞按 1~3×107/ml 接种于小鼠背部皮
下,每处注射 0.2ml,共 2~4 点。待肿瘤达到一定大小后(一般 10~20 天)则
可采血,从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到 1~10mg/ml。但采血量有限。
②腹水的制备:常规是先腹腔注射 0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于
BALB/C 鼠,1~2周后腹腔注射 1×106个杂交瘤细胞,接种细胞 7~10 天后可产
生腹水。