VIGS技术在植物基因功能研究中的应用

植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年4月 379 VIGS技术在植物基因功能研究中的应用 杨迎伍，李正国 ，宋红丽，杨平 重庆大学生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院基因工程研究中心，重庆市高校功能基因及调控技术重点实验室，重庆 400044 Application of VIGS in Plant Gene Function Study YANG Ying—W u，LI Zheng—Guo ，SONG Hong-Li，YANG Ping Genetic Engineering Research Center,College ofBio—Engineering，Chongqing University,Key Laboratory ofFunctional Gene and Regulation Technologies under Chongqing Municipal Education Commission,Chongqing 400044,China 提要：文章就病毒载体选择、目标基因插入片段 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 、病毒嫁接技术、环境条件控制、沉默植株检测等方面对应用病毒 诱导的基因沉默(VIGs)技术研究植物基因功能应遵循的基本原则进行介绍，并讨论了其在应用中存在的一些问题。 关键词：病毒诱导的基因沉默(VIGs)；植物基因功能；应用；基本原则 病毒诱导的基因沉默(virus．induced gene silencing，VIGS)是近年来发现的一种转录后基因 沉默(post—transcriptional gene silencing，PTGS)现 象，可引起内源mRNA序列特异性降解(Ratcliff等 1997；王宏芝等2005)。即如果在病毒载体中插 入 目标基因片段，侵染寄主植物后，植物会 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现 出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型，从 而可以确定基因功能。其作用机制为：含有 目的 基因片段的病毒载体在被侵染的植物组织中大量复 制，病毒载体中的 目的基因片段在 RNA引导的 RNA聚合酶(RNA—directed RNA polymerase，RdRP) 作用下合成大量的双链RNA(double—stranded RNA， dsRNA)；dsRNA在Dicer酶作用下产生21~25个核 苷酸的短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)； 然后，siRNA的反义链与RNA诱导基因沉默复合 物(RNA—induced silencing complex，RISC)结合， 特异性识别细胞质中的目的基因的单链 mRNA， 造成目的基因mRNA特异性降解，从而导致目的 基因在RNA水平上的沉默(Bartel 2004；Burch． Smith等 2004；Klahre等2002；Martinez等 2002； Waterhouse等 1 998)。 与其它导致基因功能缺失的研究方法(如反义 抑制、基因突变等)相比，病毒诱导的基因沉默 具有研究周期短、不需要遗传转化、可在不同的 遗传背景下生效以及能在不同的物种间进行基因功 能的快速比较等优点，此种技术正在发展成为一 种简单、快速、有效、高通量的分析基因功能的 方法(Burch．Smith等 2004；王宏芝等2005)。 但如何有效地在植物中应用 VIGS技术，获 得可靠的数据，是人们在实际应用中最为关心的 问题。本文结合我们实验室的工作，介绍 VIGS 应用过程中应该遵循的一些基本原则。 1选择合适的病毒载体 经过几年的发展，已有多种病毒载体在VIGS 上成功应用，如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus． TMV)、马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)、番茄 金色花叶病毒(tomato golden mosaic virus，TGMV)、 烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)、卫星 病毒诱导的沉默系统(satellite virus—induced silencing system，SVISS)、大麦条状花叶病毒(barley stripe mosaic virus，BSMV)、甘蓝缩叶病毒(cabbage leaf curl virus，CbLCV)等(Burch—Smith等2004； 王宏芝等 2005)。但每种病毒载体都存在一定的宿 主范围，诱导沉默效果也不同。例如 PVX病毒 虽然具有较好的稳定性，但只有3个植物宿主家 族，而TMV则有9个植物宿主家族(Brunt等1996； Burch．Smith等2004)。而且，有些病毒载体感染 植物后会引起较强烈的疾病表型，干扰目标基因 沉默的表型，以致 目标基因的功能分析很困难， 如TMV和 PVX等病毒载体(Ratcliff等 2001)。另 外，许多病毒不能侵染宿主植物的生长点或分生 组织 ，以致这些组织的目标基因无法有效沉默 (Ratcliff等2001)。但采用TRV病毒载体能有效的 收稿 2006一l2．2O 修定 2007—03．09 资助 国家自然科学基金(30600422、3037l006)和重庆市自 然科学基金(2006BB 11 39)。 通讯作者(E-mail：zhengguoli@cqu．edu．cn；Tel：023- 65l204831。 维普资讯 http://www.cqvip.com 380 植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月 使目标基因在生长点或分生组织中沉默，产生系 统的沉默效果(Liu等2002b)。 因此，在应用 VIGS研究植物基因功能时， 所选择的病毒载体应对实验植物有很好的侵染性、 在寄主植物中不产生疾病表型或只有轻微的疾病表 型，最好能在寄主植物中产生系统的沉默效果。 2选择正确的目的基因片段和适当的长度 根据 VIGS的作用机制，理论上引起目的基 因沉默的最小插入片段为 23个核苷酸(Bartel 2004)，但在实际操作中23个核苷酸长度常常不 能够有效地启动目标基因沉默的发生，所以需要 选择更长的目标基因片段(数倍于23 nt)(Ekengren 等 2003；Ratcliff等 1997)。但如果插入片段太 长，可能会导致病毒不能在宿主植物体内传播， 也可能导致插入片段易于丢失，如PVX或TRV的 病毒载体允许的最大插入片段为1．5 kb(Thomas等 20011。为了使 目标基因能够有效的沉默，有人 对此研究的结果表明以300~500 bp插入片段的沉 默效果最佳(Burch．Smith等 2004；Ekengren等 2003；Lu等2003b)。当然，也可能存在其它影 响沉默效果的因素，如目标基因序列的核苷酸组 成(Thomas等2001)、siRNA及 目标序列的碱基对 的热力学特性等(Khvorova等2003；Schwarz等 2003)。 由于VIGS可能引起任何与目标序列存在至少 23个核苷酸一致的转录产物的降解，所以在选择 目标基因的插入序列区域时必须非常慎重。通常 事先进行BLAST序列比对或DNA杂交分析以核实 是否可能引起基因家族的其他成员的沉默是非常必 要的(Burch．Smith等 2004)。当然，对于单拷贝 的基因，理论上开放阅读框(open reading frame， ORF)内的任何区域都可以用于基因沉默。然而， 如果要使基因家族中的单个基因沉默，必须要谨 慎选择插入病毒载体的基因片段区域，保证不能 含有与家族其他成员具有 23个或更多核苷酸的一 致序列。如果家族基因之间具有高度保守的开放 阅读框，则可以选择非翻译区(untranslated region， UTR)作为目标基因的插入片段。相反，要想同 时沉默一个基因家族中的多个基因，则可以选择 高度保守的区域，同时还可克服可能存在的基因 功能冗余(Lu等2003a)。VIGS在沉默基因家族中 单个基因或几个基因方面的灵活性，可能会成为研 究基因家族中基因之间交迭功能非常有用的工具。 根据目前的研究及 VIGS的作用原理，目标 基因片段在病毒载体中的插入方向对基因的沉默效 果没有影响，即正向插入或反向插入都能达到同 样的沉默效果。 3同时使几个不同基因沉默的方法 ． 对于几个基因之间不存在多于 23 nt保守序列 或几个基因根本就不属于一个基因家族，易于想 到的方法是分别构建几个不同基因的病毒载体， 然后共感染植物。但此方法在 目前的情况下很难 获得满意的结果，这主要是由于 目前病毒诱导的 基因沉默技术并不能保证所有被感染的植物都能产 生系统的沉默效果，即几个病毒载体同时感染植 物后可能产生基因沉默的部位不一致；另外，此 方法也很难确保病毒在植物体内的传播和作用的同 步性。所以，对于不具有保守序列的几个不同基 因来说，有效的方法是把几个基因的片段串联构 建到同一个病毒载体上，这样可保证vIGS作用部 位和时期的同步性。如Peele等(2001)用TGMV病 毒载体使编码镁离子螯合酶亚组分的基因(su)和增 殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)(或称为细胞周期蛋白)的基因共沉默； Turnage等(2002)用CbLCV病毒载体在拟南芥中共 沉默 Chlorate 42和 PD 基因。 4病毒载体的嫁接技术 如何有效地使病毒载体转入植物细胞，是病 毒在植物体内复制与转移，以及发生目标基因沉 默的关键。目前通常把含 目标基因的病毒载体转 入农杆菌中，然后通过农杆菌介导法感染宿主植 物。迄今已发展了几种病毒嫁接方式，如牙签接 种(Lu等2003a)、注射渗透(Fu等2005)、高压喷 射(Liu等2002a)及真空渗透(Ekengren等2003)等。 但对于不同的植物和不同的病毒载体来说，每种 嫁接技术的效果也不同，所以在实际工作中应根 据植物和病毒载体的种类选择合适的方法(Ekengren 等 2003；Liu等 2002a)。例如，用 PVX病毒侵 染烟草只需用牙签挑取含 PVX载体的农杆菌，刺 伤叶片即可引发足够强的感染(Lu等2003a)，但此 方法在应用 T R v 感染番茄时的效果却不好 (Ekengren等2003)。对于TRV在番茄和烟草中的 维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯 第43卷 第 2期，2007年 4月 38l 应用，实验 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 真空渗透和高压喷射幼叶都能获 得很好的感染效果(Ekengren等 2003；Liu等 2002a)。如果要在植物的局部区域获得有效的沉 默，注射渗透技术比较理想(Fu等 2005)。例如， 可以通过注射花柄或果梗的方式获得基因在花或果 实中的沉默。虽然各种方法在方式上存在很大的 差异，但引发VIGS发生的基本原理是一致的， 即含有目标基因片段的病毒载体被接种到幼嫩的植 物体内，然后随着植物的生长，病毒从接种的部 位传播到生长区域，进而引发PTGS(Dinesh-Kumar 等 2oo3；Liu等 2oo2a，2002b；Ekengren等 2003)。 迄今，病毒载体的接种技术还没有形成一套 非常成熟有效的方法，已有的报道也只是在少数 物种中获得成功 ，如烟草、番茄、拟南芥等， 许多接种条件还需要进一步优化，如农杆菌株系 的选择、农杆菌的感染活力、感染缓冲液的选 择、农杆菌感染液浓度的确定以及接种方式的优 化等。所以，在实际应用中，尤其对于尚无VIGS 报道的植物，预备试验是必不可少的。 5 VIGS环境条件的控制 成功的基因沉默依赖于病毒在植物体内的传 播和植物生长之间的相互作用，而这 2个方面都 受到环境条件的影响(Burch—Smith等 2004)。对于 病毒的传播和有效的沉默，温度是最重要的影响 因子之一。而对于不同的植物，有效沉默所需要 的温度也可能不同。例如，用TRV感染番茄，较 好的沉默表型在22℃或更低的温度下发生；而用 TRV感染烟草，合适的温度则在25℃左右(Burch— Smith等2004；Ekengren等20o3；Liu等2002a； Nethra等 2006)。目前的研究证明，植物培养室 (growth chamber)是进行VIGS实验较为理想的选 择，而控温较差和温度波动大的温室不适宜于做 VIGS实验。另外，Fu等(2006)发现，低温和低 湿的条件可以增强基因沉默的强度和延长沉默的持 续 时间 。 6设计合理的实验对照 对于每个 VIGS实验，都必须要有合适的对 照来监控沉默的效果。阳性对照通常采用八氢番 茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)基因的 沉默，因为PDS沉默能引起沉默区域发生光漂 白，并迅速产生可见的表型(Kumagai 1995)。也 有一些研究选用镁离子螯合酶(magnesium chelatase) 基因作为阳性对照( emtrup等 1998；Peele等 2001)。实验中，为了说明病毒 自身是否会引起 表型，还必须用空病毒载体接种植物作为阴性对 照。另一方面，阴性对照也可以显示接种技术对 植物生长的影响。我们在实验中观察到，较强烈 的接种处理对植物自身生长可能会产生一定的影 响，如真空渗透处理番茄幼苗 10 d左右的时间 内，对番茄植株的生长具有较明显的抑制(未发表 资料)。如果阴性对照(空病毒载体接种的植物)出 现非正常的表型，往往还需要添加新的阴性对 照，即以不含病毒载体的水或侵染缓冲液采用相 应的接种技术处理植株。以便明确非正常的表型 是来自于病毒自身的原因，还是由于接种方式引 起的，从而可以进一步选择合适的方法或优化条 件来消除此不利影响。另外，阴性对照对后继的 沉默检测也是必不可少的，所有的检测都应该以 接种空病毒载体的阴性对照材料作为检测的阴性对 照 。 7沉默植株的检测 植物接种含病毒载体的农杆菌后，随着植物 的生长，病毒从接种位点传播到植物的生长区域 并引发 目标基因的沉默。从接种到引发基因沉默 所需的时间与多种因素有关，如病毒载体的类 型、植物的种类和植物生长条件等。而随着植物 体内防御系统的启动，VIGS将被减弱或消除，从 而恢复目标基因的表达。所以，病毒诱导的基因 沉默通常只能存在于当代的植物中，甚至只是病 毒感染后的某个阶段。因此，选择沉默植株检测 的时机非常重要。另外，检测材料的选择也非常 重要，通常应选取植株上端的新生叶(Burch—Smith 等 2004；Ekengren等2003；Liu等 2002a)。 VIGS技术并不能使接受侵染的全部植株都发 生目标基因的沉默，因此首先必须筛选出沉默植 株。对于目标基因的沉默能引起植株产生较为明 显的表型，则可以通过表型分析初步确定沉默植 株，再采用分子生物学的方法进一步验证。但对 于目标基因的沉默后没有明显表型的植株，则只 能通过分子生物学的方法确认。分子生物学的方 法筛选沉默植株有 2种方式：一是直接通过半定 量或定量RT—PCR技术检测目标基因的表达量来确 维普资讯 http://www.cqvip.com 382 植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年4月 定(Liu等2002a)；二是在病毒侵染后的早期阶段(如 番茄约 1周左右)提取新生叶RNA，并反转录成 cDNA，PCR检测病毒序列来确定病毒是否侵染 成功，从而缩小半定量或定量 RT．PCR鉴定沉默 植株的范围，减少检测的工作量(Fu等 2006)。 值得注意的是，采用半定量或定量RT．PCR 检测 目标基因的表达量时，引物应该设计在 目标 基因转录本内，且至少有一条引物必须设计在 VIGS载体中目的基因片断之外，以避免扩增出病 毒中的目标基因序列。另外，还必须选择植物中 组成型表达的基因作为半定量或定量RT．PCR的内 参照，如Ubi3、actin等。 沉默植株确定后，即可进行目标基因功能的 相关研究，如沉默植株的表型分析、生理生化指 标测定、通过半定量或定量PCR检测相关基因的 表达情况等 。 8结语 二十一世纪的分子生物学已经进入后基因组 时代，植物功能基因研究已成为植物分子生物学 研究的热点。但由于植物的生长周期长，传统的 植物基因功能研究方法越来越不能满足植物功能基 因组研究。而病毒诱导的基因沉默技术具有简 单、快速 、高通量等优 点，可望解决植物基因 功能研究周期长的瓶颈问题。虽然VIGS技术短短 几年中取得较大的发展，但此种技术 目前仍然存 在一定的缺 陷。 首先，VIGS引起 目标基因的沉默特征不具 有遗传性(Burch．Smith等 2004)，以致VIGS技术 并不能彻底揭示基因的功能，这是此种技术 自身 最大的局限性。但VIGS技术可以对植物EST序 列进行快速的高通量筛选，初步确定功能基因， 再通过传统的植物基因功能研究手段对基因功能进 行进一步的研究，从而节约大量的时间、人力和 物力。另外，由于VIGS采用幼苗或植株局部接 种的方式，且不具遗传性，所以无法应用于种子 萌发和在幼苗生长早期表达的功能基因研究。 其次，如何获得 目标基因的系统性沉默仍然 是VIGS技术 目前需要解决的问题。据目前的研究 发现，VIGS虽然可以引发目标基因的系统性沉 默，但植株各个部位的沉默效率往往表现出不一 致性(Ekengren等2003)，即有些部位沉默效率很 高，但有些部位只有轻微的沉默表型。我们用组 成性表达 GUS基因的转基因番茄植株为材料，研 究 VIGS的组织特异性也获得了相似的结果(未发 表资料)，有些沉默植株甚至只在局部组织有表 型。如果 目标基因沉默不能引起植株的明显表 型，判断是否系统性沉默将是非常困难的工作， 这也往往会对研究结果产生一定的影响。 第三，沉默持续的时间问题。目前的研究发 现，VIGS持续的时间可达到2 个~(Liu等2002a， 2002b；Lu等2003b；Ratcliff等 2001)，这对于 生长周期较长的植物显然还不够。虽然在番茄中 采用低温和低湿的方法可适当延长VIGS的作用时 间(Fu等2006)，但过低温度和湿度对植物本身生 长将会产生影响，并延长植物的生长周期，以致 目标基因的沉默仍然不能维持到植物生长的后期。 通过病毒载体的选择或改造来增强病毒的活性， 从而延长VIGS的作用时间和增强目标基因的沉默 效果，可能是今后值得尝试的工作。 第四，目前最稳定和最有效的VIGS载体都 有一定的宿主范围限制，其中绝大部分都只是在 烟草和茄科植物(如番茄)中应用(Burch．Smith等 2004)。发展更宽宿主范围的VIGS载体，尤其是 能易于在拟南芥和水稻上有效应用，对植物功能 基因组研究将是非常有用的。另外，应用 VIGS 研究特定的基因需要相关序列信息，使此技术在 目前只有相对小的EST库的物种中的应用将受到 限制 。 第五，病毒载体如何有效地接种入植物体 内，并产生较强的沉默效果，是 VIGS技术实验 操作中的关键性步骤。接种过程中的多种因素都 可能影响接种效果，如接种方式、农杆菌的活性 及浓度、缓冲液的类型等。针对不同的植物和病 毒载体，探索出相应的有效接种方法将是VIGS技 术应用中需要解决的问题。 虽然 VIGS技术目前还存着一些问题，但随 着VIGS技术研究的深入必将得到逐步完善。相信 VIGS技术必将在更多的植物物种中得到应用，并 将成为植物功能基因组学研究中广泛应用的技术。 参考文献 王宏芝，李瑞芬，王国英，马荣才，魏建华(2005)．病毒诱导的基因 沉默及其在植物功能基因组学研究中的应用．自然科学进展， 维普资讯 http://www.cqvip.com 植物生理学通讯 第 43卷 第2期，2007年4月 383 l5(1)：8-14 Bartel DP(2004)．MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism， and function．Cel1．116：281-297 Brunt AA，Crabtree K，Dallwim M J，Gibbs AJ，W atson L，Zurcher EJE f1996)．Plant viruses online：descriptions and listsfrom the VIDE database．Version：20 th August 1996．URL：http：／ ／image．fs．uidaho．edu／vide／descr803．htm#Range Burch—Smith TM ，Anderson JC，M artin GB，Dinesh—Kumar SP (2004)．Applications and advantages of virus—induced gene silencing for gene function studies in plants．Plant J，39： 734-746 Dinesh．Kumar SP，Anandalakshmi R，Marathe R，Schiff M ，Liu Y (2003)．Virus—induced gene 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