胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B_1的研究

2007, Vol. 28, No. 02 食品科学 ※分析检测232 胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉 毒素B1的研究 邓省亮，赖卫华，许 杨* (南昌大学 食品科学教育部重点实验室，江西 南昌 330047) 摘 要：本文应用胶体金免疫层析技术，建立了一种快速检测食品中黄曲霉毒素B1的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。采用柠檬酸三钠还 原法制备胶体金颗粒，标记抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体并喷于玻璃纤维上，黄曲霉毒素B1偶联抗原和二抗鼠抗驴 分别结合于硝酸纤维膜上，依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡 中。测试结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明黄曲霉毒素B1快速检测试纸条的灵敏度为5ng/ml，检测时间为10min，批内和批间重复性为 100%，假阳性率和假阴性率均为0。使用简单方便，非常适合现场快速检测黄曲霉毒素B1。 关键词：黄曲霉毒素B1；胶体金免疫层析；试纸条；快速检测 Study on Gold Immunochromatography Assay for Rapid Detection of Aflatoxin B1 DENG Sheng-liang，LAI Wei-hua，XU Yang* (Key Laboratory of Food Science, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China) Abstract ：To establish a rapid assay for detection of aflatoxin B1, gold immunochromatography assay(GICA)was studied. Colloidal gold marked coupled with monoclonal antibody against aflatoxin B1 was jet sprayed onto the glass fiber. Aflatoxin B1- BSA and anti-donkey anti-mouse immunoglobulins were jet-positioned onto a nitrocellulose membrane. Sample pad, gold jed pad, nitrocellulose membrane and absorbent paper were assembled and cut into detecting card, respectively. The results showed that the sentitive standard of rapid assay for aflatoxin B1 visual detection limit is 5 ng/ml and detection time within 10 min. Repeatability of strip is 100%. The assay gives no false positive and false negative results. So it is very simple and convenient to rapidly detect aflatoxin B1 on the spot. Key words：aflatoxin B1；gold immunochromatography assay；strip；rapid detection 中图分类号：TS37 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)02-0232-05 收稿日期：2005-12-22 *通讯作者 基金项目：“十五”国家重大科技专项(2001BA804-A20)；南昌大学基础理论研究项目(2004) 作者简介：邓省亮(1980-)，男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。 黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，称AFB1)是真菌的次级 代谢产物，主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生 曲霉(Aspergillus parasiticus)和特曲霉(Aspergillus nomius) 产生[1]。它易天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和 稻米等农作物中，具有强烈的毒性和致癌性。它是目 前化学致癌物中最强的一种致癌诱变剂，其毒性比氰化 钾强10倍，其致癌性比二甲基亚硝胺强75倍。1993年 黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定 为Ⅰ类致癌物，其作用的靶器官主要为肝脏[2]。我国曾 对肝癌高发区的江苏、广西等省连续多年进行流行病学 调查和监测，并在1982年颁布了粮油和发酵食品中的 AFB1允许量标准[3]。目前，黄曲霉毒素B1的检测方法 主要包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、 酶联免疫吸附法(ELISA)。TLC法虽然具有设备简单的优 点，但其灵敏度低。高效液相色谱法具有灵敏度高、 分离能力强、特异性好和测定结果可靠等特点，但如 果食品成分复杂，在进行液相色谱分离前，需对样品 作彻底有效的净化处理，不适合于大批量样品的检测， 并且设备仪器昂贵，不易普及。酶联免疫吸附法是目 前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、可定 量、对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的 检测，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时 间相对较长，所以不适合现场快速检测。 胶体金免疫层析方法(gold immunochromatography assy, GICA)是20世纪80 年代发展起来的一种将胶体金 免疫技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法 233※分析检测 食品科学 2007, Vol. 28, No. 02 [4]。它不仅具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性 好、操作简便、无需任何仪器设备，而且结果判断直 观可靠、容易被基层单位人员掌握，现在已广泛应用 于临床诊断及药物检测等领域。随着人们生活的进一步 提高，相应对食品的安全性也提出了更高的要求。本 研究采用胶体金免疫层析法快速检测食品中黄曲霉毒素 B1，取得了较为理想的结果。 1 材料与方法 1.1材料与仪器 黄曲霉毒素B1 标准品 北京标准物质研究中心； 黄曲霉毒素B1腹水 中国协和医科大学基础医学研究 所；AFB1偶联抗原(AFB1-BSA)、氯金酸(HAuCl4·3H2O) 美国Sigma公司；酶标板 Coster公司；柠檬酸三钠、 碳酸钾 上海化学试剂公司；硝酸纤维素膜(NC膜)、 玻璃纤维、样品垫、吸水纸、 德国S&S公司。 XYZ 3000平台系统、试纸条切刀 美国Biodot公 司；Ultrospec 4300 紫外可见光分光光度计 瑞典 Pharmacia公司；H-600 透射电镜 日本Hitachi公司； 高速冷冻离心机 美国Sigma公司；MA磁力搅拌加热 器 德国Electromantle公司。 1.2方法 1.2.1抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体纯化 取2 ml AFB1腹水加入4 ml 0.06 mol/L pH 5.0 的乙酸缓 冲液，用0.1mol/L的HCl 调pH 至4.5。于室温搅拌下 逐滴缓慢加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33 μl搅拌 30min，4℃静置2h。4℃ 10000 r/min 离心30min，取 上清。4℃ 10000 r/min 离心30min，取上清。 上清经砂芯漏斗过滤，加入1/10体积的PBS(pH7.4)， 在4℃冰浴下加入0.277 g/ml的硫酸铵，静置2h，4℃ 10000 r/min，离心15min，弃上清，沉淀溶于0.01mol/L PBS 中进行透析。 1.2.2胶体金的制备 准确称取1g 氯金酸溶于100ml 双蒸水中，配成1% 氯金酸盐溶液，然后将5ml 1%氯金酸溶液加入495ml超 纯水。然后加入圆底烧瓶中加热，煮沸后立即加入13ml 1% 柠檬酸三钠溶液，溶液的颜色由黑色→紫色→深蓝→ 酒红色，当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，继续 回流5min后停止加热，冷却至室温，4℃贮存。 1.2.3胶体金的电镜观察和紫外扫描 将制备好的胶体金分别进行电镜观察和紫外扫描， 测量其颗粒大小和最大吸收波长。 1.2.4胶体金标记抗体 取10ml胶体金，用0.2mol/L K2CO3 调pH为8.2， 用磁力搅拌器均匀搅拌，同时缓慢加入5 μg抗AFB1单 克隆抗体，继续搅拌30min。加入适量1% PEG, 继续 搅拌15min，加入10% BSA溶液，使终浓度为1%， 继续搅拌15min。4℃ 1500r/min离心10min，取上清。 4℃ 6000r/min 离心30min，小心吸去上清，缓冲液重悬 沉淀。 1.2.5胶体金免疫标记快速检测试纸条的组装 用XYZ 3000平台系统在玻璃纤维上喷金标抗体，室 温干燥2h。偶联抗原AFB1-BSA用0.01 mol/L PBS(pH 7.4) 稀释至0.3 mg/ml，用XYZ 3000平台系统喷于硝酸纤维 膜(NC膜)上，室温干燥2h，此为检测线。在离检测线 3 mm处喷上驴抗鼠IgG(0.5mg/ml)，此为质控线。将NC 膜、胶金垫、样品垫和吸水纸依次组装在底板上，用 Biodot公司切刀切割成4mm宽的试纸条装入检测卡中。 1.2.6检测方法 试纸条检测卡平放，将样品加到检测卡的样本垫 上，10min看结果。如果检测线上出现红色条带，说 明样品呈阴性，如果检测线上没出现红色条带，说明 样品呈阳性。如果质控线无条带，说明试纸条无效。 1.2.7试纸条的灵敏度和检测范围 用甲醇稀释AFB1标准品至10 μg/ml，加入适量的 PBS稀释至1μg/ml，使其含20%的甲醇，再用甲醇:PBS (1:4,V/V)依次稀释，使其终浓度为0、2、3、4、5、 10、20、50、100、200 、500、1000ng/ml。分别 加入试纸条检测卡孔中，判断结果为10min，每个浓度 重复5次。 1.2.8试纸条的特异性 分别配制黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤 霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、桔霉素和展青霉毒标 准品，浓度分别为0、5、10、20、50、100、200 ng/ml。用快速测卡检测，每个浓度重复3次，判断试 纸条的特异性。 1.2.9试纸条的批内和批间重复实验 将同批和不同批次的试纸条分别检测0、5、10、 20、50、100 ng/ml的AFB1标准品，每个浓度重复3次， 观察其重复性。 1.2.10试纸条稳定实验 将试纸条密封分别存放于37、25和4℃，观察不 同温度对试纸条的影响。保存于37℃的试纸条每天取出 4条分别检测0、5、20、100ng/ml的AFB1标品。保 存于25℃的试纸条每3d取出4条分别检测0、5、20、 100ng/ml的AFB1标品。保存于4℃的试纸条每周取出4 条分别检测0、5、20、100ng/ml的AFB1标品。 1.2.11检测样品 将不同产地的4份大米、4份花生、3份玉米碾磨 2007, Vol. 28, No. 02 食品科学 ※分析检测234 粉碎，分别称取2g，每份样品加入2.5ml提取液(每100 ml中含60ml甲醇、40ml蒸馏水、4g氯化钠)，在振荡 器上振摇3min，5000r/min离心5min，吸出上清液，分 别用0.01mol/L PBS稀释1倍，即为样品检测液。分别 加入70 μl于试纸条检测孔中，每个重复3次，10min判 断结果。同时用ELISA方法进行对比。 2 结果与分析 2.1抗体的效价和纯度分析结果 抗体经紫外扫描，测得抗体浓度为2.85 mg/ml，经 间接ELISA测得腹水和抗体效价分别为1:2.0×106 和1: 1.0×106，表明抗体的活性基本未受影响。经SDS-PAGE 电泳，抗体仅出现两条带，一条为IgG重链，约50kD； 另一条为轻链，约25kD，而腹水则出现许多条带，表 明抗体纯化取得了较好的效果。 2.2胶体金的质量分析结果 将制备好的胶体金经紫外可见分光光度计在400～ 600nm扫描，以超纯水为参比，在533nm有最大吸收 峰，OD533=1.004，见图1。制备好的胶体金溶液经透 射电镜观察结果显示，所制备的胶体金粒径均匀，随 机测量100个颗粒，胶体金粒径在40nm左右，见图2。 图2 胶体金电镜扫描图 Fig. 2 Determination of colloidal gold by transmission electron microscope 2.3试纸条的灵敏度和检测范围结果 0ng/ml AFB1(阴性)检测时，检测线出现很深的红色 条带，随着AFB1标品浓度的增加，检测线条带逐渐减 弱；当AFB1标品浓度增至5ng/ml时，检测线无红色条 带；当AFB1标品浓度继续增加至1000ng/ml，检测线 都无红色条带；质控线均出现深红色条带(见表1)。由 此判断，该试纸条的灵敏度为5ng/ml。 表1 黄曲霉毒素B1快速检测试纸条的灵敏度 Table 1 Sensitivity of AFB1 rapid test strip 注：－ 表示阴性，+ 表示阳性。 黄曲霉毒素B1浓度(ng/ml) 0 2 3 4 5 10 50 100200 检测结果 － － －/+ +/－ + + + + + 2.4试纸条的特异性结果 表2 黄曲霉毒素B1快速检测试纸条的特异性 Table 2 Specificity of AFB1 rapid test strip 试纸条检测结果(ng/ml) 0 5 10 20 50 100200 黄曲霉毒素B1 － + + + + + + 赭曲霉毒素A － － － － － － － 玉米赤霉烯酮 － － － － － － － 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 － － － － － － － 桔霉素 － － － － － － － 展青霉毒素 － － － － － － － 由表2可知，黄曲霉毒素B1快速检测试纸条与其它 真菌毒素没有交叉反应，只针对AFB1有特异性结合。 2.5重复性和稳定性结果 经验证AFB1快速检测试纸条的批内和批间重复性 为100%，假阳性率和假阴性率均为0。试纸条分别在 4℃和25℃下保存2个月以及37℃保存10d，检测结果均 未发现改变。 2.6样品检测结果 11份样品经试纸条检测后，除了2份花生结果显示 阳性，其他检测检测结果显示均为阴性。用ELISA检测 11份样品，检测结果显示也仅有上述2份花生中AFB1高 于我国限量标准，表明两种方法结果一致，结果见表3。 样品 ELISA (μg/kg) GICA 大米1 0.63 － 大米2 1.46 － 大米3 0.35 － 大米4 5.58 － 花生1 2.12 － 花生2 0.93 － 花生3 ＞100 + 花生4 22.21 + 玉米1 1.70 － 玉米2 5.88 － 玉米3 1.56 － 表3 GICA与ELISA检测样品中AFB1结果的比较 Table 3 Comparison of detecting results between GICA and ELISA 1.000 0.800 0.600 400.0450.0500.0550.0600.0 吸 光 度 波长(nm) 图1 胶体金紫外可见光分光光度计扫描图 Fig. 1 Determination of colloidal gold by spectrophotometry 235※分析检测 食品科学 2007, Vol. 28, No. 02 3 讨 论 目前，我国规定检测粮食、花生及其制品、薯 类、豆类、发酵食品及各种食品中AFB1的标准方法是 TLC和ELISA[5]，由于上述两种方法需借助仪器设备来 完成，检测过程时间较长，不适宜现场快速检测。胶 体金免疫层析方法由于具有简单快速、灵敏特异、结 果直观、无需仪器等特点，因此被广泛地应用于医疗 诊断以及药物检测等领域[6-7]，而应用在真菌毒素上的检 测报道甚少[8-9]。胶体金免疫试纸条的作用原理主要有双 抗夹心和竞争结合，我们研制的 AFB1胶体金免疫试纸 条采用了竞争原理，试纸条底板为双面胶白色塑料板， 从加样处开始分别为样品垫、胶金垫、N C膜和吸水 纸。胶体金标记抗AFB11单克隆抗体喷涂于胶金垫上(玻 璃纤维)，NC膜上分别喷涂偶联抗原AFB1-BSA(检测线) 和驴抗鼠IgG(质控线)。该法检测线出现红色条带，结 果显示阴性，检测线无条带，结果显示阳性。这是因 为当被检物质溶液中不含AFB1时，由加样区释放胶体 金标记有抗AFB1单克隆抗体的反应位点便会被检测线处 的偶联抗原AFB1-BSA物质识别并被结合，因而被截留 在该处，当累积到一定的程度在此处便出现红色线，但 弱阳性时会出现反应强度减弱的检测线。当被检物质溶 液中AFB1的浓度达到一定时，AFB1就会把胶体金标记 上的抗AFB1抗体的反应位点全部结合完毕，这样当免 疫胶体金到达检测线时便不能再与此处喷涂有偶联抗原 发生反应，因而也就不出现红色线。无论被检测物质 中有无AFB1，胶体金标记的抗AFB1单克隆抗体都会与 喷涂在NC膜上的羊抗驴二抗发生免疫反应，即在质控 区出现一条红色线，见图3、图4。 影响试纸条的质量有很多因素，如胶体金颗粒大 小、胶体金标记抗体量、包被抗原浓度、N C膜的选 择都非常重要。胶体金颗粒粒径愈大，其均一程度愈 高，在N C膜上泳动的速度愈慢；粒径愈小，则离散 度愈大，泳动的速度就愈快[10]。在胶体金免疫快速试 纸条中，检测信号是由于胶体金在检测线或质控线上聚 集而成，所以如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信 号，导致目测效果较差。如果太大又会遇到空间位阻 的问题，空间位阻可以阻止小分子蛋白质接近金颗粒的 zeta电位[11-12]。根据实验结果，我们选用了直径为40nm 左右的胶体金。由于黄曲霉毒素B1快速检测试纸条是采 用竞争原理设计的，因此标记抗体量尤为关键，标记 抗体量过多，灵敏度就会降低，达不到应用的价值； 反之，标记抗体量过小，尽管能提高灵敏度，但是会 使阴性显色条带较淡，不易与阳性进行比较。通过多 次摸索，抗体标记量为0.5μg/ml时，AFB1试纸条最低 检测限达到5ng/ml，与Barbara[13]报道的灵敏度相同。用 于胶体金快速检测试纸条试验的膜多为硝酸纤维素膜， 对膜的选择常有蛋白质结合力、孔径大小、流动速率、 黄曲霉毒素B1胶体金试纸条由于具有快速、单份 测定、操作简单，不需添加其他试剂和孵育、洗涤步 骤的优点，因此大大地提高了检测效率，十分适合现 场快速检测。尽管此方法目前还只能达到半定量，但 作为一种快速筛查的手段，可以有效地弥补广大基层单 位因设备和经费问题而无法开展食品中AFB1的检测和监 控，具有重要的经济价值和社会价值。 参考文献: [1] MIGUEL M J, LUCIA M V S, ESUARDO S S, et al. 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[7] 杨书豪, 张云汉, 王玉金, 等. 血清甲胎蛋白胶体金免疫层析快速检 测法的建立及应用[J]. 实用肿瘤杂志, 2004, 19(1): 48-51. 膜的厚度和抗张强度。我们在实验中发现孔径大、流 动速率较快的NC膜更适合AFB1检测试纸条。另外偶联 抗原包被浓度也非常重要，如果包被量过大不但降低了 试纸条的灵敏度，而且提高了实验成本(AFB1-BSA非常 昂贵)甚至造成“堵金”现象，但包被量过少会致使检 测线偏淡，经过试验使用0.3mg/ml AFB1-BSA偶联抗原 进行包被比较合理。 图3 黄曲霉毒素B1快速检测试纸条作用原理图 Fig. 3 Principle of AFB1 rapid test strip 样品垫胶金垫 NC膜 检测线 质控线 吸水纸 阴性 阳性 图4 黄曲霉毒素B1 快速检测卡示意图 Fig. 4 Sketch map of AFB1 rapid detecting card 阴性 阳性 无效 S T C S T C S T C 2007, Vol. 28, No. 02 食品科学 ※分析检测236 [8] SUN Xiu-lan, ZHAO Xiao-lian, TANG Jian, et al. Preparation of gold- labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin B1[J]. Food Microbiology, 2005, 99: 185-194. [9] 赖卫华, 熊勇华, 许杨, 等. 应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素 A的研究[J]. 食品科学, 2005, 26(5): 204-207. [10]虞伟, 廖建辉, 葛存旺, 等. 胶体金纳米粒子及其蛋白标记物在电场 中的泳动行为研究[J]. 纳米材料与结构, 2003(9): 35-38. [11]CHANDLER J, GURMIN T, ROBINSON N. The place of gold in rapid tests [J]. IVD Technology, 2000(6): 37-49. 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Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China) Abstract ：The contents of trace elements Zn, Mg, Mn, Sr, Fe, Pb, Cu and Se in the corn collected from 10 provinces were studied by ICP-AES with high pressure nitrifying pot. This method is easy operational, rapid, highly sensitive, and accurate, and can determind many elements simultaneously. Its relative standard deviation is below 5%. Key words：ICP-AES (iductively coupled plasma-atomtic emission spectrometry)；trace elements；corn 中图分类号：TQ 351.37.7 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)02-0236-02 玉米在世界多个国家都广泛种植[1]。在我国玉米是 第三大粮食作物[2]。近年来随着我国人民生活水平的不 断提高，人们的营养意识也随之改变，从过去的大量 需求动物蛋白，转为对粗粮如玉米的需求逐年增加。玉 米中富含对人体健康有益的物质，如蛋白质、脂肪、 维生素以及微量元素。微量元素其特点是数量少，功 能作用大，对许多生物活性分子往往起着关键的调控作 用[3]。但长期以来，对食品营养的研究通常都偏重于有 机成分的研究。但是从某些微量元素在体内的重要作用 来看，尤其是有机营养成分中的羟基、酚基、氨基、 杂环氮以及硫巯基等和微量元素的相互作用以及它们生 成的配合物所产生的生物活性来看，对玉米中的微量元 素[4]的研究的确是不容忽视的。因此，分析测定全国不 同地区的玉米中微量元素的含量具有极其重要的意义。 1 材料与方法 1.1仪器 使用Optima 5300 DV 电感耦合等离子体原子发射光 谱仪 美国PerkinElmer公司。轴向观测，观察位置自 动优化。中阶二维色散分光系统，GEM TIPIM型交叉雾 化器，三通道蠕动泵，分段式电感耦合检测器SCD， 40MHz自激式射频发生器，CFT-33水冷循环系统。样 品经过高压硝化处理后采用ICP-AES法测定其中的元素 含量。考察了功率、载气流量等主要因素对元素测定 的影响，选定仪器工作参数如表1所示。 1.2原料