胶体金标记氯霉素抗体探针的研究

第 3 7卷第 4期　　　　　　　　　　 　　　　　上海师范大学学报 (自然科学版 ) Vol. 37 , No. 4 2 0 0 8年 8 月　　　　　　　　　　 Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences) 2 0 0 8 , Aug 1 胶体金标记氯霉素抗体探针的研究 王元凤 , 白亚龙 ,魏新林 (上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 200234) 摘 　要 : 研究了胶体金标记氯霉素抗体探针的制备方法 ,通过红外光谱、荧光光谱、热力学公 式等初步探讨了氯霉素抗体与胶体金的相互作用. 结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 :胶体金标记氯霉素抗体探针的最 佳 pH范围为 8～10, 1mL胶体金标记的最小蛋白量是 22μg. 红外光谱表明 :氯霉素抗体蛋白 与胶体金之间无共价结合 ;荧光光谱表明 :胶体金对氯霉素抗体发生静态荧光淬灭 ,经热力学 公式推导 ,两者之间存在比较强的氢键和范德华力. 该研究为氯霉素的胶体金免疫层析技术提 供了一定的理论基础. 关键词 : 氯霉素抗体 ; 胶体金 ; 相互作用 中图分类号 : TS201. 6 　　文献标识码 : A　　文章编号 : 100025137 (2008) 0420408207 　　　　　　　　　　 收稿日期 : 2008206211 基金项目 : 上海市科委技术 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 专项 ( 06DZ05137, 07DZ05027 ) ; 国家高技术研究发展计划 ( 863 计划 ) (2008AA10Z322). 作者简介 : 王元凤 (1974 - ) ,女 ,博士 ,上海师范大学生命与环境科学学院讲师 ;魏新林 (1971 - ) ,男 ,博士 ,上海师 范大学生命与环境科学学院副教授. 0　引　言 近年来农兽药在食品中的残留已经拉响了我国食品安全的警报 ,其中特别是抗生素等药物的残留 , 已经成为食品安全的主要问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 之一. 氯霉素是第一个人工合成的对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用 广谱抗生素 ,因其效价高 ,价格低廉 ,在我国畜牧业中得到广泛应用 ,成为畜禽疾病防治的重要药物 1但 是 ,氯霉素存在严重的副作用 ,能引起人类的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病 ,因此 ,氯霉素 在动物性食品中的残留对人类的健康构成了潜在危害. 欧盟、美国等发达国家相继禁止或严格限制使用 氯霉素. 美国规定 ,在动物性食品中检出任何氯霉素都是违法的. 欧共体不允许氯霉素用于产奶母牛和 产蛋鸡 ,规定在其他大动物中氯霉素的最高残留限量为 0. 01 mg/kg;韩国也规定动物组织中不得检出 氯霉素 ;我国农业部也已禁止使用该药 [ 1 ] . 这就在客观上要求改进传统的检测方法 ,引进先进的检测仪 器 ,寻求快速、精确的检测方法 ,使得检测结果更加准确、可靠. 胶体金免疫层析技术是在酶联免疫分析 的基础上发展起来的一种固相标记的小分子化合物免疫测定技术. 该技术的特点是简单、快速、不需任 何仪器设备 ,几分钟内便可肉眼观察结果 ,并且检测成本很低 ,顺应了快速检测的发展方向 ,在农兽药检 测领域具有广阔的前景 [ 2 ] . 免疫层析法 ( Gold Immunochromatography A ssay, GICA )是将各种反应试剂以条带状固定在同一试 纸条上 ,待检样品加在试纸条的一端 ,将一种试剂溶解后 ,通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上 另一种试剂接触 ,样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体发生特异性免疫反应 [ 3 ] . 胶体金标 记技术 (Colloidal Gold Labeling Technique)是免疫层析快速诊断的核心技术 ,它以胶体金作为示踪标记 物应用于抗原抗体反应 [ 4 ] ,其实质是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程 [ 5 ] . 在免疫 层析中胶体金既是标记物又是显色剂 ,胶体金标记探针的好坏直接关系到检测体系的稳定性和灵敏度 , 故研究抗体蛋白与胶体金颗粒的相互作用对于提高免疫层析诊断技术具有重要的意义. 本研究以胶体金标记氯霉素抗体为材料 ,研究了制备金标氯霉素抗体探针的最佳条件 ,用免疫学方 法和透射电镜 ( Transm issin Electron M icroscope, TEM )进行了鉴定 ,并通过红外光谱、荧光光谱初步探讨 了胶体金与氯霉素抗体的相互作用. 1　材料与方法 1. 1　试剂与仪器 氯金酸 ,购自上海诚心化工 ;氯霉素抗体、羊抗兔二抗 ,购自广西南宁中科科技 ;柠檬酸纳等试剂均 为分析纯 ,购自上海国药集团 ;实验用水均为二次去离子水. 3 - 18K高速冷冻离心机 (美国 Sigma公 司 ) , Cary50紫外 -可见分光光度计 (美国 Varian公司 ) , H - 600透射电镜 (日本 H itachi) , RH KT/C磁 力搅拌器 (德国 IKA 公司 ) , Cray/E荧光光谱仪 (美国 Varian公司 ) , AVATAP330红外光谱仪 (美国 Thermo公司 ). 1. 2　实验方法 1. 2. 1　粒径 15 nm胶体金的制备 1. 2. 1. 1　柠檬酸钠还原法制备胶体金 [ 6 ] 取 0. 01% 氯金酸水溶液 50 mL于恒温磁力搅拌器上加热至沸腾 ,在 100 r/m in转速下 ,快速加入 2 mL 1%的柠檬酸钠溶液 ,持续加热搅拌 15 m in,至溶胶颜色呈透明的酒红色并保持不变. 室温冷却后以 去离子水回复到原体积 , 4℃保存备用. 1. 2. 1. 2　胶体金的质量鉴定 方法 1: 利用胶体金的光散射性与粒径的大小有密切关系的特点 ,用紫外可见分光光度计检测所制 备胶体金的吸收曲线和吸收峰 ,初步确定其粒径大小. 方法 2: 将覆有 Formvar膜的 300目铜网浸入胶体金溶液中 ,取出放在空气中干燥 ,于透射电镜下 观察. 测量 100个胶体金颗粒的粒径 ,计算平均值及标准差. 1. 2. 2　氯霉素抗体与胶体金结合最佳 pH值和最小氯霉素抗体蛋白量的确定 1. 2. 2. 1　氯霉素抗体与胶体金结合最佳 pH研究 取若干个 1. 5 mL试管 ,分别加入 1 mL胶体金溶液 ;用 0. 1 mol/L K2 CO3 溶液将 pH分别调为 4. 0, 5. 0, 6. 0, 7. 0, 8. 0, 9. 0, 10. 0, 11. 0;取一 96孔板 ,按 pH从低到高分别将上述胶体金分别取 100μl加入 孔中 ,做 3次平行 ;每孔分别加入 3μl浓度为 1 mg/mL的氯霉素抗体 ,混匀 ,静止 5 m in后加入 20μl浓 度为 10% NaCl溶液 ,混合 ,室温下放置 10 m in;观察胶体金颜色变化 ,记录保持红色的 pH值. 1. 2. 2. 2　氯霉素抗体最小蛋白量的确定 取一 96孔板 ,每个重复为若干孔 ,分别加入最佳 pH的胶体金 100μl,做 3次平行 ;各孔依次加入不 同浓度的蛋白 0. 05, 0. 1, 0. 15, 0. 2, 0. 25, 0. 30, 0. 35 mg/mL各 10μl,混匀 ,室温下放置 15 m in;加入 20 μl 10% NaCl溶液 ,室温下放置 2h;记录颜色仍保持红色的最小蛋白用量. 1. 2. 3　金标记氯霉素抗体探针的制备和纯化 1. 2. 3. 1　金标记氯霉素抗体探针的制备 将 10 mL胶体金溶液加入 50 mL烧杯中 ,调整胶体金的 pH值到最适 pH值 ,在 250 r/m in的转速搅 拌下 ,逐滴加入 1mL适量浓度的氯霉素抗体蛋白溶液 ,继续搅拌 10 m in,最后逐滴加入 10%的 BSA溶 液 ,使得体系中 BSA浓度为 1% ,置 4℃存放. 1. 2. 3. 2　胶体金探针的纯化 将金标抗体溶液常温下 3000 r/m in离心 15 m in,弃去沉淀. 取红色上清液在 4℃, 10 000 r/m in条件 904　第 4期　　　　　　　　　　　　　王元凤 , 白亚龙 ,魏新林 : 胶体金标记氯霉素抗体探针的研究 下离心 35 m in,轻吸弃去上清液 ;用 1% 的 BSA将沉淀混悬至原量 ,重复离心 2次 ,彻底除去未结合的 蛋白质. 最后一次洗涤离心的沉淀用含 1% 的 BSA和 0. 02 mol/L NaN3 的 PBS将沉淀混悬为原体积的 1 /10, 4℃保存备用. 1. 2. 4　胶体金探针的质量鉴定 1. 2. 4. 1　生物学活性鉴定 吸取 5μl羊抗兔二抗点样在 NC膜上 , 37℃干燥 10 m in,然后取 2μl金标抗体点样于羊抗兔二抗的 点样位置 ,静置 5 m in,迅速用去离子水冲洗点样位置 ,将未结合的金标抗体冲掉 ,观察最终颜色. 1. 2. 4. 2　紫外可见分光光度计分析 将金标记探针进行紫外可见分光光度扫描 ,将吸收曲线与胶体金溶液的吸收曲线进行对比. 1. 2. 4. 3　TEM鉴定 将覆有 Formvar膜的 300目铜网浸入胶体金探针溶液中 ,取出放在空气中干燥 ,于透射电镜下 观察. 1. 2. 5　红外光谱分析 采用液膜法将氯霉素抗体溶液和标记之后的金标抗体溶液进行红外光谱分析 ,之后进行图谱对照 1. 2. 6　荧光光谱分析 图 1　胶体金以及胶体金探针紫外 - 可见吸收曲线 固定氯霉素抗体的量为 22μg不变 ,加入不同浓 度的胶体金溶液 ,用荧光光谱仪分别检测每个体系 的荧光发射光谱 (激发波长为 280 nm). 2　结果与讨论 2. 1　胶体金溶液的表征 制备好的胶体金溶液成亮丽的酒红色 ,用去离 子水做参比 ,经紫外可见分光光度计对其进行全波 长扫描 (图 1) ,其最大吸收波长为 520 nm,根据粒径 与最大吸收波长以及颜色的关系 [ 5 ] (表 1)可初步判 断其粒径在 5～20 nm之间. 表 1　胶体金粒径与最大吸收波长和颜色的关系 [ 5 ] 粒径 吸收波长 溶液颜色 2～5 nm 500 nm 橘黄色 5～20 nm 520 nm 红色 20～40 nm 530 nm 深红色 > 60 nm 600 nm 蓝紫色到青绿色不等 　　如图 2 ( a)透射电镜 ( TEM )扫描图谱所示 ,试验制备的胶体金粒子未发生凝聚 ,颗粒大小均一 ,且都 为比较规整的球形. 随机选取 100个粒子 ,经过测量计算得到其平均直径为 15. 05 nm,标准偏差为 1. 00 nm,变异系数为 6. 66%. 2. 2　氯霉素抗体与胶体金结合最佳 pH值和氯霉素抗体最小蛋白量的确定 蛋白质分子被吸附在胶体金颗粒表面的包被 (胶体金表面被蛋白质分子覆盖 ) 过程就是标记 ,所 形成稳定聚合物就是胶体金探针. 影响结合的主要因素是溶液 pH值、蛋白质浓度等 [ 7 ] . 通过观察最终 显色情况 (见表 2, 3) ,可以确定制备胶体金探针的最适 pH 范围为 8. 0～10. 0之间 ,最小蛋白量为 014 　　　　　　　　　　　　　　　　　　上海师范大学学报 (自然科学版 ) 　　　　　　　　　　　　　　　　　 2008年 ( a)胶体金扫描电镜 　　　　　　　　　　　　　　　 ( b)胶体金探针扫描电镜 图 2　胶体金以及胶体金探针扫描电镜图谱 20μg. 在本试验中 pH选取 9. 0,每 1 mL胶体金溶液蛋白量定为 22μg(包被的蛋白量一般在最小蛋白 量的基础上加 10% ～30% ). 表 2　不同 pH值对于胶体金探针合成的影响 pH 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 9. 0 10. 0 11. 0 一号组现象 蓝紫色 紫红色 红色聚沉 红色聚沉 均一红色 均一红色 均一红色 红色聚沉 一号组现象 蓝紫色 紫红色 红色聚沉 红色聚沉 均一红色 均一红色 均一红色 红色聚沉 一号组现象 蓝紫色 紫红色 红色聚沉 红色聚沉 均一红色 均一红色 均一红色 红色聚沉 表 3　不同蛋白量对于胶体金探针合成的影响 氯霉素抗体量 /μL 0 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5 4. 0 一号组现象 蓝色 蓝色 蓝色 淡红色 红色 红色 红色 红色 红色 二号组现象 蓝色 蓝色 淡红色 红色 红色 红色 红色 红色 红色 三号组现象 蓝色 蓝色 蓝色 淡红色 红色 红色 红色 红色 红色 2. 3　金标氯霉素抗体探针的质量鉴定 2. 3. 1　活性试验 经过去离子水冲洗后的点样位置可以明显的看到粉红色斑点 ,表明金标抗体与二抗发生比较牢固 的结合 ,即金标抗体具有活性. 2. 3. 2　胶体金溶液与胶体金探针紫外 -可见吸收图谱的比较 金溶胶在 500～550 nm之间有强的吸收峰 ,这是金纳米粒子的表面等离子体共振 ( Surface Plasma Resonance, SPR)吸收峰 [ 8 ] ,对比胶体金标记氯霉素抗体前后的紫外 - 可见吸收光谱 (图 1) ,吸收曲线 在 520 nm处的吸光值降低 ,由此可推测氯霉素抗体与胶体金发生了相互作用. 同时 ,可以看到吸收曲线 的最大峰值发生了 10 nm左右的红移 ,根据 [ 9 ]报道 ,当胶体金与周围吸附介质或基质材料相互作用会 引起吸收峰发生红移. 由此可以初步判定氯霉素抗体与胶体金发生了相互结合. 同时 ,根据推测也有另 一种可能性存在 :胶体金在标记前升高了 pH值 ,随着 pH值的增加 ,可能会中和胶体金粒子表面部分的 负电荷 ,使得胶体金颗粒相互凝聚粒径增大 ,从而发生红移. 是否有这种情况需要进一步通过电镜确认. 图 2 ( b)为胶体金探针的透射扫描电镜图谱 ,随机选取 100个探针粒子 ,测量统计后算出 ,平均直径 114　第 4期　　　　　　　　　　　　　王元凤 , 白亚龙 ,魏新林 : 胶体金标记氯霉素抗体探针的研究 (因外围氯霉素抗体蛋白层比较模糊不作为测量范围 )、标准方差和变异系数分别为 15. 04 nm, 1. 2 nm 和 8. 0%. 对于两组数据相关性的分析 ,一般采用 T检验 ,当 T检验结果小于 0. 1表明两组数据有差异 , 当 T检验结果小于 0. 05表明两组数据有显著性差异. 将测量的 100个胶体金粒子直径与 100个探针粒 子直径做 T检验 , T检验结果为 0. 58. 由此可知 ,胶体金颗粒自身没有发生任何的粒径增加现象 ,故第 2 种推测不存在. 2. 3. 3　胶体金溶液与胶体金探针透射电镜图谱的比较 胶体金与氯霉素抗体相互结合后 ,氯霉素抗体蛋白被吸附在胶体金颗粒表面 ,这与透射电镜观察到 的结果完全符合 ,如图 2 ( b)所示 ,与胶体金溶液相比较 ,胶体金探针表面被均匀的覆盖了一层透明状薄 膜 ,其颜色明显区别于胶体金粒子本身以及背景. 2. 4　氯霉素抗体蛋白与胶体金之间的相互作用研究 2. 4. 1　胶体金与氯霉素抗体之间的静电相互作用探讨 pH值是氯霉素抗体蛋白与胶体金相互结合的重要因素 ,它直接决定着胶体金探针制备的成功与 否. 蛋白质是两性电解质 ,当蛋白质所处环境的 pH大于 p I(等电点 )时 ,蛋白质分子带负电荷 , pH小于 p I时 ,蛋白质带正电荷. 一般认为胶体金粒子表面为一层 [AuCl2 ] - ,因此 ,当体系中的 pH值大于氯霉 素抗体蛋白的 p I值时 ,氯霉素抗体和胶体金颗粒因为正负离子相互吸引而结合 ,由此表明氯霉素抗体 和胶体金之间主要作用是正负离子之间的相互作用. 2. 4. 2　氯霉素抗体与胶体金探针的红外图谱比较 红外光谱与分子的结构密切相关 ,是研究表征分子结构的一种有效手段. 许多有机官能团和化学键 等在红外光谱中都有特征吸收. 如图 3所示氯霉素抗体蛋白的红外图谱 , 1680～1630 cm - 1对应的酰胺 I 带 C = 0吸收峰和 1570～1510 cm - 1对应的酰胺 II带的 N - H和 C - N吸收峰是蛋白质的特征吸收峰. 将胶体金探针的红外图谱与氯霉素抗体蛋白的红外图谱进行比较 ,发现两者的峰形基本一致 ,因此 ,可 以推断氯霉素抗体蛋白与胶体金的结合没有发生化学键的改变 ,即两者之间没有发生共价结合. 2. 4. 3　不同浓度胶体金探针与氯霉素抗体的荧光光谱分析 图 3　氯霉素抗体以及胶体金探针红外扫描图谱 蛋白质分子中因含有色氨酸、酪氨酸等氨 基酸残基而产生较强的荧光 ,蛋白质等荧光体 与其他物质相互作用导致荧光强度降低的现 象叫荧光淬灭 ,能使荧光体发生荧光淬灭的物 质称为荧光淬灭剂 [ 10 ] . 固定氯霉素抗体蛋白 的量而胶体金浓度不变 ,可以发现氯霉素抗体 蛋白的荧光强度发生有规律的改变 ,随着胶体 金浓度的增加 ,荧光强度逐渐降低 (图 4) ,表 明胶体金溶液对氯霉素抗体蛋白具有荧光淬 灭作用. 假设胶体金对氯霉素抗体蛋白的作用是 动态淬灭 ,那么可以用 Stern - Volmer方程 Ksv = n ( cop - cp ) / ( cQ ·ncp )来描述两者的相互关系 ,将公式 进行推导后得 : cp / c o p = I o F / IF = 1 + Ksv cQ = 1 + Kq to cQ [ 10 ] 1 其中 , cp 是游离荧光体浓度 , cQ 是淬灭剂浓度 , cop 是荧光体总浓度 , Ksv是动态淬灭常数 , IoF 和 IF 分别是 有淬灭剂和无淬灭剂时的荧光强度. Kq ( Kq = Ksv / to )为动态荧光淬灭速率常数 ,它描述分子间的彼此扩 散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命的影响 ,一般不大于 2. 0 ×1010 L / (mol·s) , t0 为无淬灭剂存在时 荧光分子的平均寿命 ,一般为 10 - 8 s. 将试验数据代入 cp / cpo = 1 + Ksv cQ ,得 Ksv = 4. 38 ×104 L /mol(温度 为 293K下 ) ,再代入 Ksv = Kq to ,得 Kq = 4. 38 ×1012 L / (mol·s) ,远大于 2. 0 ×1010 L / (mol·s). 由此可 214 　　　　　　　　　　　　　　　　　　上海师范大学学报 (自然科学版 ) 　　　　　　　　　　　　　　　　　 2008年 推测 ,胶体金对氯霉素抗体蛋白的荧光淬灭作用不是动态淬灭而是静态淬灭. 偶极 - 偶极无辐射能量转移理论指出 , 当供体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱有 足够的重叠 ,供体与受体之间不超过 7 nm 时 ,会发生非辐射能量转移现象 ,导致荧光体 物质的荧光淬灭. 氯霉素抗体的荧光光谱和 胶体金溶液的紫外光谱确实有一定的重叠 , 但是重叠区域非常小 ,说明非辐射能量转移 淬灭程度十分弱. 2. 4. 4　氯霉素抗体与胶体金的相互作用的 热力学公式分析 物质与蛋白质之间发生非共价的相互作 用 ,主要有疏水相互作用、氢键、范德华力和 静电引力等. 根据文献报道 [ 11 ] ,疏水作用力对 体系的 △H和 △S产生正的贡献 ,氢键或者范 德华力使 △H和 △S变负 ,静电作用力使 △H ≈ 0, △S > 0. 经过测量计算 ,在 293 K和 303 K时 , Ksv分别为 4. 38 ×104 L /mol和 2. 63 ×104 L /mol,将其 代入热力学公式 △G = △H - T·△S, △G = - RTInK, In ( K2 /K1 ) = (△H /R ) · (1 /T1 - 1 /T2 ) ,可算 得在 293 K时 , △H = - 3. 7 ×104 KJ·mol- 1 , △S = - 37. 57 J·K. △H 0, △S 0,即氢键和范德华 力是氯霉素抗体蛋白和胶体金结合的主要作用力. 这与前面的推测氯霉素抗体和胶体金之间主要作用 是正负离子之间的相互作用是相违背的. 原因可能有二 :一是可能胶体金与氯霉素抗体相互之间通过正 负离子相互吸引结合之后是依靠氢键和范德华力进行稳定的 ;另一个原因是 :在荧光分析中所涉到的胶 体金浓度是以 [Au ]来表示的 ,当金聚集成胶体状态 ,其体系可能远比用理论推导复杂的多 ,此试验分析 只是一个初步的探讨 ,需要更多的工作来深化完善. 3　结　论 胶体金标记氯霉素抗体探针的最佳 pH范围为 8～10, 1 mL胶体金标记的最小蛋白量是 22μg. 红 外光谱表明氯霉素抗体蛋白与胶体金之间无共价结合 ,荧光光谱表明胶体金对氯霉素抗体发生静态荧 光淬灭 ,经热力学公式推导 ,两者之间存在比较强的氢键和范德华力. 　　感谢上海快灵生物科技有限公司以及杭州南开日新生物技术有限公司在试验过程中提供的大力 支持. 参考文献 : [ 1 ]　胡项飞 ,沈建忠. 氯霉素类抗生物的残留分析 [ J ]. 中国兽药杂志 , 2001, 35 (5) : 55 - 57. 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Results showed that the op timal pH range was from 8 to 10, and the m inimum antibody p rotein content was 22μg for 1 mL nanogold colloid; . there was no covalent binding between nanogold colloid and immunogold p robe by IR; it happened static fluorescent quenching between nanogold colloid and immunogold p robe by Fluorescence spectra. Besides, it indicated that the main interactions were London - van derW aals force and hydrogen bond between nanogold and Chloramphenicol antibody by thermodynam ic formulas deduction. The study p rovided theoretical foundation for chloramphenicol colloid - gold immune chromatography. Key words: chloramphenicol antibody; nanogold colloid; interaction (责任编辑 :郁 　慧 ) 414 　　　　　　　　　　　　　　　　　　上海师范大学学报 (自然科学版 ) 　　　　　　　　　　　　　　　　　 2008年