恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶胶体金免疫层析法检测试纸条的研制

·论著· 恶性疟原虫重组乳酸脱氢酶胶体金免疫 层析法检测试纸条的研制 3 李莉1 , 劳海苗2 , 吴英松2 , 郝文波2 , 李明2 3 3 (1. 南方医科大学基础医学院实验管理中心 ,广东广州 510515 ; 2. 南方医科大学生物技术学院) 【摘要】　目的 　用氯金酸标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LD H) 单克隆抗体 (McAb) ,研制用于诊断恶性疟原虫和间日 疟原虫感染的胶体金免疫层析 ( GICA)试纸。　方法 　采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒、标记抗恶性疟原虫重组 乳酸脱氢酶单克隆抗体 ,制成免疫层析检测试纸条。用该试纸条检测已知疟疾病人及健康人血样 ,鉴定方法的敏感性和 特异性。　结果 　检测重组 LD H 抗原的最小量为 5 ng/ ml ;对 30 例恶性疟病人血样及 40 例间日疟病人血样进行检 测 ,敏感性分别为 83. 33 %和 57. 50 % ,检测 100 例健康者血样特异性为 98. 00 %。　结论 　初步建立了同时诊断恶性疟 原虫和间日疟原虫感染的 GICA 检测法。 【关键词】　疟原虫 ,恶性 ; 乳酸脱氢酶 ; 单克隆抗体 ; 胶体金免疫层析试纸技术 【中图分类号】　R382. 31 　　　【文献标识码】　A 　　　【文章编号】　167325234 (2006) 0520348204 Preparation of gold2immuochromatography assay test paper for Plasmodium f alci pa rum lactate dehydrogense L I Li , LAO Hai2miao , WU Ying2song , HAO Wen2bo , L I Ming 　( S outhern Medical Universit y , Guang2 z hou 510515 , China ) 【Abstract】　Objective 　To establish a gold2immunochromatographic assay ( GICA) st ripe for detecting both falciparum and tertian malaria using chloroauric acid2labelled monoclonal antibody against lactate dehydrogense (LD H) of Plasmodi2 um f alci parum . 　Methods 　Collodial gold was coupled with monoclonal P. f alci parum LD H antibody to prepare a GI2 CA test paper. The2gold2anti2LD H conjugate reacted with LD H in serum and migrates up the nit rocellose st ripe on which anti2LD H was immobilized , thus producing the detection reaction. GICA stripe was then evaluated for it s sensitivity and specificity. 　Results 　 The lowest concentration that could be detected was 5 ng/ ml. The thirty cases of falciparum and forty cases of vivax malaria patient s were detected , which showed that the GICA strip had the sensitivity of 83. 3 % and 57. 5 % for detecting falciparum and vivax malaria respectively , and the specificity 98 % for both kinds of malaria. 　Con2 clusion 　GICA was established in this study is sensitive and specific for detecting both falciparum and vivax malaria , and is potentially useful in developing reagent kit s for clinical use. 【Key words】　Plasmodi um f alci parum ; LD H ; McAbs ; gold2immuochromatography assay test 乳酸脱氢酶 (LD H) 是广泛存在于动植物及微生 物细胞内的一种重要的同工酶 ,是糖酵解途径的末端 酶 ,疟原虫 LD H 在疟原虫的整个红内期均表达 ,在疟 原虫能量代谢中发挥重要作用[1 ,2 ] 。早期的研究已经 揭示了在各种疟原虫 LD H 之间不但有共同抗原表 位 ,还具有种特异抗原表位 ,因而能同时鉴别诊断恶性 疟和间日疟[3 ] ;另外 LD H 仅由活虫体产生 ,因此可用 于鉴别原虫的死活 ,监测治疗效果和复燃情况[ 4 ] ,是理 想的疟疾免疫诊断的靶抗原[ 5 ,6 ] 。 目前对疟原虫 LD H 研究只限于恶性疟原虫和诺 氏疟原虫 ,间日疟的 LD H 还未见报道 ,而且间日疟原 虫不能体外培养。本研究根据恶性疟和间日疟原虫的 LD H 具有交叉抗原的特性 ,利用基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 技术获得高 纯度、具有生物学活性的 LD Hpf 重组抗原。用该抗 原从本室制备的 11 株抗 LD Hpf 单抗中 ,筛出能与恶 性疟原虫反应的种特异性和能与恶性疟和间日疟同时 反应的属特异性单抗 ,并将其优化组合 ,建立了同时诊 断恶性疟原虫和间日疟原虫感染的胶体金免疫层析 (gold2immuochromatograp hy assay , GICA)检测法。 材料和方法 1 　材料 1 . 1 　抗体和血样 　抗 LD Hpf 单克隆抗体由本室制 备 ;恶性疟病人血样、间日疟病人血样由杭州艾康公司 ·843· 中 国 病 原 生 物 学 杂 志 J ournal of Pathogen B iology 　 2006 年 10 月　　第 1 卷第 5 期 October 2006 , 　Vol. 1 , 　No. 5 3【基金项目】　广州市科技计划项目 (No. 2002 E32E4012) 。 【作者简介】　李莉 (1975 - ) ,女 (汉) ,河南人 ,2004 年毕业于第一 军医大学免疫学专业 ,硕士。现为南方医科大学基础医学院实验 管理中心讲师 ,主要从事基因工程抗体方面的研究。 E2mail : helansll @21cn. com3 3【通讯作者】　李明 提供 ;健康人血样由杭州第一人民医院提供。 1 . 2 　试剂 　氯金酸 ( HAuCl4 ·4 H2 O) ,Sigma 公司产 品 ;蛋白分子质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,购自鼎国生物技术公司 ;硝酸 纤维素膜、玻璃纤维、聚酯膜、滤纸、塑料板、色卡均由 杭州艾康公司提供。 2 　方法 2 . 1 　单抗的纯化 　采用饱和硫酸铵法。11 株单抗腹 水各取 5 ml ,分别按 1 ∶4 比例稀释 ,稀释液为 PBS ;搅 拌条件下加入 20 ml 饱和硫酸铵 ,磁力搅拌 30 min , 3 000 r/ min 离心 10 min ,弃上清 ,沉淀溶于 3 ml PBS 中 ,混匀 ;加入 3. 6 ml 饱和硫酸铵 ,磁力搅拌 30 min , 3 000 r/ min 离心 10 min ,弃上清 ,沉淀溶于 2 ml PBS 中 ,混匀 ,装入透析袋 ,PBS 中透析 48 h ,其间更换 3 次 透析液。用紫外蛋白检测仪测定蛋白浓度 ,分别为 1C6 7. 3 mg/ ml ,3C9 4. 1 mg/ ml , 7D2 5. 4 mg/ ml , 2D7 2. 2 mg/ ml , 6 G7 5. 5 mg/ ml , 2B11 3. 2 mg/ ml , 2C6 4. 8 mg/ ml , 1 E7 0. 9 mg/ ml , 6D3 10. 3 mg/ ml , 3C9 4. 1 mg/ ml ,3D10 9. 4 mg/ ml , 2F12 3. 7 mg/ ml。 2 . 2 　胶体金的制备 　参照文献[7 ] 进行。取 0. 01 % HAuCl4水溶液 100 ml ,加入 10 g/ L 柠檬酸三钠水溶 液 2 ml ,加热煮沸 15～30 min ,待溶液由蓝逐渐变为 紫红色 ,直至变红 ,即为胶体金溶液 ,颗粒直径为 40 nm。 2 . 3 　胶体金标记物制备 　参照文献[ 7 ] 。取胶体金 1 ml , 用 0. 2 mol/ L 碳酸钾调 p H8. 2 ,0. 45μm 滤膜过 滤 ,分光光度计测 A450 值。在搅拌下快速加入单克隆 抗体 30. 8μg , 继续搅拌 30 min 后 ,加入 10 %BSA , 4 ℃放置 3 h～4 h ,3 000 r/ min 离心 10 min ,弃沉淀 , 上清液再 12 000 r/ min 离心 20 min ,小心吸弃上清 液 ,经 0. 45μm 滤膜过滤即为胶体金标记溶液。 2 . 4 　标记胶体金聚酯膜的制备 　将调好终浓度为 A450 = 80 的标记胶体金按 1ml/ 条的量由点金标机均 匀涂布在聚酯膜上 ,并做好标记 ,喷量 3μl/ cm ,37 ℃ 干燥过夜 ,备用。 2 . 5 　单克隆抗体及羊抗鼠 Ig G的包被 　计算各单抗 所需体积 ,调整蛋白浓度为 2. 5 mg/ ml。分别将两种 抗体装入两支洁净专用扫描笔中 ,设定测试带 (单克隆 抗体)和质控带 (羊抗鼠 Ig G)宽度均为 0. 1 cm ,二者间 距为 1 cm ,位于 NC 膜中部 ,将程序输入自动点膜机 , 喷量为 1. 0μl/ cm。进入工作状态 ,按启动键 ,开始包 被 ,做标记符号。将包被有抗体的 NC 膜置 37 ℃孵箱 放置过夜 ,即为包被膜。 2 . 6 　试纸条组装 　整个试纸条由 NC 膜、玻璃纤维 膜、聚酯膜、滤纸、塑料板组成。首先取洁净塑料板 ,将 包被膜用双面胶固定于塑料板固定位置上 ;将吸水滤 纸连接在 NC 膜上端 ,玻璃纤维连接塑料板下端 ;胶体 金标记物附着在玻璃纤维下 ,与包被膜衔接 ;均匀、轻 微滚动式推进 ,以加强粘和力 ,用切割机将贴好的板切 割成 3. 3 mm 宽的条 ,即为成品试纸条。 2 . 7 　测试方法 　将试纸条装入全血板 ,样品池一端滴 入 10μl 病人全血和 20μl 缓冲液 ( PBS) 。血样中的 LD Hp 通过玻璃纤维的层析作用上行与胶体金标记的 抗体结合形成抗原抗体复合物 ,再移行至包被膜 ,与包 被抗体发生反应 ,形成双抗体夹心复合物 ,呈现出目测 可见的红色条带 ,全部试验过程需 5～20 min。结果 判断 :阴性 :试纸条测试带 ( T)不显色 ,仅质控带 (C) 显 色 ,出现 1 条红线 ;阳性 :试纸条测试带和质控带均显 色 ,出现 2 条红线 ;若试纸条测试带和质控带均不显 色 ,无红线出现 ,则测试无效 ,表示试纸条已经失效。 结 　果 1 　盐析单抗的活性 11 株单抗腹水经过硫酸铵盐析后用 EL ISA 检测 抗体活性 ,效价与盐析前基本相当。 2 　GICA 反应模式的初步建立 GICA 反应模式的建立分两步进行。第 1 步 :初 步筛选。选择 11 株单抗中任何一株单抗 (3C9) 点膜 , 然后与另外 10 株单抗配伍 (金标) ,选择反应最强的配 伍对。本实验用 3C9 点膜 ,1 E7 做金标反应最强 ;第 2 步 :进一步筛选。选择单抗 1 E7 作金标 ,再分别与点 膜的另外 10 株单抗配伍 ,选择反应最强配伍对 ,结果 同前。 3 　灵敏度试验 3 . 1 　最低检测量 　以 3C9 为包被抗体 ,1 E7 为标记抗 体的模式检测重组抗原 ,抗原的量依此为 1、5 、10、 100、500 ng/ ml ,结果显示本试纸条检测重组抗原的最 低量为 5 ng/ ml。 3 . 2 　疟疾血样的检测 　以上述反应模式 (3C9 为包被 抗体 ,1 E7 为标记抗体) 检测 30 例恶性疟病人血样及 40 例间日疟病人血样 ,分别有 25 例和 23 例阳性 ,与 镜检法结果的符合率分别为 83. 33 %和 57. 50 %。 4 　特异性试验 检测 100 例健康人全血标本 , 2 例阳性 ,特异性为 98. 00 %。 5 　重复性试验 用同一批不同试纸条测定同一样品 ,或用 3 个不 同批号试纸条测定同一样品时 ,其测试带、质控带的显 色时间、颜色深浅和最终结果判断基本相同。 6 　稳定性实验 将试纸条置 4 ℃干燥保存 ,分别于 1 月、3 月、6 月 抽检 ,测定疟疾病人及健康人血样 ,其敏感性和特异性 未见明显改变。 ·943· 中 国 病 原 生 物 学 杂 志 J ournal of Pathogen B iolog y 　 2006 年 10 月　　第 1 卷第 5 期 October 2006 , 　Vol. 1 , 　No. 5 　　 1 　恶性疟病人血样　2 　间日疟病人血样　3 　重组抗原 4 　健康人血样　5 　缓冲液 图 1 　GICA检测疟原虫 LD H结果 1 　Pf sample 　2 　Pv sample 　3 　The recombinant protein 4 　Negative cases 　5 　Cushion fluid Fig. 1 　The picture of sample detecting 讨 　论 胶体金快速免疫层析技术 ,具有快捷迅速、灵敏准 确、安全简便、成本低廉、结果易于判定等优点 ,已被广 泛用于临床。其基本原理是在 NC 膜的捕获线上包被 一针对分析物的特异性单抗 ,同时将另一株抗体偶联 在胶体金上 (由于胶体金的颗粒表面带负电荷 ,与蛋白 质所带正电荷基团之间形成非共价键的静电吸引而牢 固结合 ,所以这种结合对所标记的蛋白质生物活性无 明显影响)作为检测试剂。当加入待测标本后 ,由于层 析作用 ,样品上行与胶体金标记的抗体结合 ,形成抗原 抗体复合物 ,再移行至包被膜 ,与包被抗体发生反应 , 构成双抗体夹心复合物 ,呈现出目测可见的红色条带 , 颜色反应的强弱与样本中的抗原浓度成正比。 目前 ,疟疾诊断技术或方法主要有 :1) 厚、薄血膜 染色镜检法 ,该方法费时费力、对低原虫血症者易漏 诊[8 ] ;2)探针技术和 PCR 技术 ,用于检测疟原虫特定 的抗原和核酸 ,其最突出的优点是对低原虫血症者检 出率高、敏感性和特异性好 ,但需要特殊设备和试剂 , 其应用受到限制 ; 3) 免疫学方法 ,如间接荧光试验 ( IFA) 。Dip stick 抗原捕获法 ( Parasight2F 实验) 、免 疫色谱测试法 ( ICT) 、OptiMAL 法 ,均是利用免疫层 析技术的基本原理制备的试剂盒 ,其操作简便、快速、 结果易于判定 ,已成为疟疾诊断研究发展方向。 Dip stick 抗原捕获法 ( Parasight2F[9. 10 ] 实验) 和免 疫色谱测试法 ( ICT)都是基于 HRP2Ⅱ为诊断抗原 ,由 于抗原本身特点 ,存在以下缺陷 :1)不能发现原虫出现 前期患者或血中仅含成熟配子体的病人[ 11 ,12 ] ; 2) 在血 液中活虫体消失后 ,仍可检出 HRP2Ⅱ抗原 ;3) 类风湿 因子 ( rheumatoidfactor , RF) 可与该系统的单克隆抗 体 Ig G发生交叉反应 ,出现假阳性。 OptiMAL 法以乳酸脱氢酶 (LD H) 为诊断抗原。 LD H 是糖酵解途径的终止酶 ,在疟原虫的整个红内期 均表达。pLD H 具有种、属特异性抗原 ,是检测疟原虫 理想的靶抗原。这是目前报道的既能鉴别诊断恶性疟 和间日疟又能对治疗效果进行监测的一种快速、简便 的免疫检测方法 ,也被用于流行病学调查。 尽管目前国外已生产出以 LD Hpf 为检测靶抗原 的 OptiMAL [13 ]试剂盒 ,但价格昂贵 ,病人难以承担。 本研究用金标记 11 株抗重组 LD H 单抗制成免疫层 析检测试纸条 ,筛选得到 3 株与恶性疟原虫和间日疟 均反应的单抗 ,经过两次配伍优化组合发现以 3C9 包 被抗体 ,1 E7 标记抗体为 GICA 较适反应模式。以此 反应模式制备的免疫层析条对 30 例恶性疟病人血样 及 40 例间日疟病人血样进行检测 ,敏感性分别为 83. 33 %和 57. 50 % ,特异性为 98. 00 %。敏感性较 Palmer 报道的 OptiMAL 法低的原因可能有以下几个 方面 :1)制备免疫层析条的 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 ,如 NC 膜的孔径大 小、质量好坏 ,抗体与膜材料的结合和稳定性 ,抗体包 被量等 ;2) pLD H 是疟原虫本身所固有的一种具有特 异酶活性功能蛋白 ,其稳定性受外界条件变化的影响 , 从而影响阳性检出率。研究证实 ,样品反复冻融和样 品长期保存时可使 pLD H 受到破坏。因此 ,检测新鲜 血样中的 pLD H 效果最好 ,如需冻融时可加入蛋白酶 抑制剂以避免 pLD H 破坏[14 ] 。 在今后研究中 ,期望获得高亲和力、高特异性 ,同 时又能针对恶性疟原虫和间日疟原虫共同表位的单克 隆抗体 ;进一步完善免疫层析条的制作工艺 ,开发出高 性价比恶性疟和间日疟同步诊断试剂盒。另外 ,根据 间日疟和恶性疟的乳酸脱氢酶基因具有的相同序列片 段 ,通过制备抗恶性疟原虫 LD H 多抗和属特异性单 抗 ,尝试调取间日疟原虫的 LD H 基因 ,解决间日疟诊 断抗原的问题。 【参考文献】 [ 1 ] 　Brasseur P ,Agnamey P ,Moreno P ,et al . 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