紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究

生Chin a F ood A 坌塑 砌 y ：：：2===： 紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜 蛋白酶活力的测定方法研究 欧英杰，曾暖茜2，冯志强 ，许佩勤 (1．广东省食品质量监督检验站，广州 510308； 2．广东省食品工业公共实验室，广州 5 10308) 摘 要：木瓜蛋白酶具有分解蛋白为氨基酸的能力，是市场上嫩肉粉的主要成分。本文通过测定嫩肉粉 中木瓜蛋白酶的酶活力大小，为判断嫩肉粉质量优劣提供参考依据。把嫩肉粉溶于盐酸半胱氨酸溶液，取该 混合液与酪蛋白溶液反应 10min，用紫外分光光度法测得反应所生成酪氨酸的含量。该方法具有较好的准确 性和重现性，添加标准回收率为96．8％～105．8％；且步骤简明，所需测试仪器简单。在该方法条件下，每分 钟水解酪蛋白生成 1 酪氨酸所需样品的量为 1个酶活力单位。此种酶活力表述方式亦为国内关于各种酶活 力的表述所常用，便于酶活力数据的比较与换算。通过测定，发现市售各种嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力参 差不齐，则嫩肉粉对肉类的嫩化能力强弱亦有差别，体现在使用添加量的多少和对肉类浸泡时间的长短上。 也有发现酶活力为0的，说明该产品中的木瓜蛋白酶已失去活力，或者根本没有添加木瓜蛋白酶，属于伪劣 商品。 关键词：紫外分光光度法；嫩肉粉；木瓜蛋白酶；酶活力 中图分类号：TS207．3 文献标识码：A 文章编号：1006—2513(2010)02—0214一o3 Determination of papain’S enzyme activity in meat tenderizer by UV spectrophotometry OU Ying-jie ，ZENG Nuan-xi ，FENG Zhi-qiang ，XU Pei-qin (1．Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station，Guangzhou 5 10308； 2．Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry，Guangzhou 5 10308) Abstract：Papain can decompose protein into amino acids and is the essential ingredient of meat tenderizer．This paper studied the determination of papaing enzyme activity in meat tenderizer． Th e results can be used for estimating the qual- itv of meat tenderizer．Dissolve meat tenderizer in L—eysteine hydroehloride monohydrate solution，mix the meat ten- derizer solution and casein solution for chemical reaction 10 mi nutes and detect the content of reaction product tyrosine by UV Speetrophotometry．This method just needs simple equipment and is convenient，accurate and practica1．The recovery rate Was 96．8％ ～105．8％ ． Under the conditions．the am ount of meat tenderizer for decomposing casein into 1 g tyrosine per mi nute is defined one enzyme activity unit． Th is kind of definition about enzyme activity is usually used in home，SO the data is convenient for compare and conversion． After determination，we found the enzyme activity of papain in different meat tenderizers sold in market were different，and the tender capability of meat tenderizers were alsO different．So how much to use and how long to marinate the meat，different meat tenderrizers had different an— swers．We also found some enzyme activity Was zero，that indicated the papain had lost its enzyme activity，or the meat tenderizer had not added papain． Key words：UV speetrophotometry；meat tenderizer；papain；enzyme activity 收稿日期：2009-05—08 作者简介：欧英杰 (1982一)，男，本科，研究方向为食品检验。 木瓜蛋 白酶 (Papain EC 3．4．22．2)属于巯 基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨 酸的羧基端，并能优先水解在肽链的 N端具有 2 个羧基的氨基酸或芳香 L氨基酸 (如酪氨酸)的 肽键。其最适作用 pH为5．0～7．0，在中性或偏 碱性时亦有作用，耐热性强⋯。 目前市场上嫩肉粉的成分主要是木瓜蛋 白 酶，木瓜蛋白酶通过分解胶原蛋白、弹性蛋白， 降解胶原纤维和结缔组织蛋白成为小分子的多肽 甚至氨基酸，令肌肉肌丝和腰筋丝断裂，因此嫩 肉粉能使老牛肉、猪肚、腊肉等较坚韧肉类迅速 嫩化，有利消化并提高营养价值，并可节省烹调 时间与能源，适合饭店、宾馆及家庭使用 J。 酶活力是酶性质的重要参数，显示酶分解底 物能力的强弱。木瓜蛋白酶酶活力的测定，采用 不同底物衍生的测定方法也不同，所取得的数值 也不能进行直接比较。传统的作法，木瓜蛋白酶 是用明胶或血红蛋白作底物来测定的。由于要求 底物具有较高的专一性和便于标准化，新的测定 方法往往采用合成的N一苯甲酰 一L一精氨酸乙酯 (BAEE) J。但以 BAEE为底物的测定方法所涉 及到的仪器设备昂贵，成本偏高 J。本文采用以 酪蛋白为底物的紫外光谱法来测定嫩肉粉中木瓜 蛋白酶的活力，该法所需测试仪器简单，步骤简 明，容易掌握；并且该法也常被国内用来测定各 种酶的活力，所得的数据便于比较。对嫩肉粉中 木瓜蛋白酶活力的测定，可为嫩肉粉质量优劣提 供一项重要的参考指标。 1 实验部分 ． 1．1 仪器 恒温水浴锅；751一GW分光光度计。 1．2 试剂 酪蛋白溶液：取酪蛋白 0．6g，加 0．05mol／L 磷酸氢二钠溶液 80mL，置沸水浴中煮 30min，时 时搅拌，冷至室温，加 0．1mol／／L盐酸调节 pH值 至 7．0±0．1，用水稀释至 100mL，用前配制。 酶稀释液：取盐酸半胱氨酸 2．635g，氯化钠 11．7g，加水 250mL溶解，另取 乙二胺四乙酸二 钠 1．115g，加水 100mL溶解，合并两液混匀，用 4．0moWL氢氧化钠溶液调节 pH值到 5．5，加水 坌塑 堡C生h in a F ood Additives 稀释到500mL，用前配制。 三氯乙酸溶液：取三氯乙酸 1．8g，加乙酸钠 2．99g和冰乙酸 1．9mL，加水溶解并稀释至 100mL。 1．3 对照品和样品的处理 对照品溶液的制备：精密称取已在 105~C干 燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0．1mol／／L盐酸 溶液制成每 mL中约含401~g的溶液。 供试品溶液的制备：取嫩肉粉约0．5g，精密 称定，加酶稀释液搅拌，稀释至 100mL。 1．4 测定法 准确量取供试品溶液各 1．0mL，分别置于 2 支 10mL具塞试管中，于 (37．4-0．2)℃水浴预热 5min，准确加入 (37．4-0．2)℃预热的底物溶液 5．0mL，立即振摇，置 (37 4-0．2)oC水浴中，精 确反应 10min后，加三氯乙酸溶液 5．0mL，振摇， 于 (37±0．2)℃水浴中放置 40min，用干燥滤纸 过滤，滤液在 2h内采用分光光度法以水为空白， 在275nm的波长处测定吸收度 A； 再精确量取供试品溶液 1．0mL，置于 10mL 具塞试管中，于 (37±0．2)℃水浴预热 5min，加 入三氯乙酸溶液5mL，振摇，置 (37士0．2)oC水 浴中，反应 10min后，准确加入 (37±0．2)oC预 热的底物溶液 5．0mL，振摇，于 (37±0．2)℃水 浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内 采用分光光度法以水为空白，在 275nm的波长处 测定吸收度 An。 另取酪氨酸对照溶液，以0．1mo~L盐酸溶液 为空白，在 275nm处测定吸收度 A 。 1．5 结果计算 酶活力( )= × xll xn x1000 式中： w 一对照品溶液每 1mL中含酪氨酸的量， 单位为微克 ( g)； w一供试品的取样量，单位为毫克 (mg)； l0一反应时间； 1l一测定总体积； n一供试品的稀释倍数； 100o一毫克与克的转换倍数。 在上述条件下，每分钟水解酪蛋白生成 1txg 酪氨酸所需的嫩肉粉的量为 1个酶活力单位。 生 Chi 垦na F oo dAd ditives坌堑 蔓 ：：： 2 结果与讨论 2．1 标准曲线的绘制 用 1001~g／mL的酪氨酸标准溶液配制标准系 列溶液，在 275．0nm处进行测定，并绘制标准曲 线，见图1，以0．1mo]／L盐酸溶液为空白。其回 归方 程 y=0．0075x一0．0019，相关 系数 r= 0．9996。在酪氨酸浓度为 0～ 1001．~g／mL范围内， 酪氨酸浓度与吸光度具有良好的线性关系。 0 20 40 6O 8O 酪氨酸浓度 ( #mL) 图1 酪氨酸标准曲线 Fig．1 The standard curve of Tyrosine 2．2 精密度 取市售嫩肉粉样品l，做 6个平行样， 可知，酶活力相对标准偏差为 2．6％。 表 1 精密度实验 Tab．1 The reslllts of the precision test l00 由表 1 2．3 加标回收率 取市售样品，按 1．4的方法处理，测定其酪 氨酸含量；再在样品中分别加人标准酪氨酸溶液 (1O00p．g／mL)0．1mL、0．2mL、0．4mL，进行测 定，实验结果见表 2。由表 2可以看出，回收率 为96．8％～105．8％，平均回收率为 101．6％。 表2 回收率测定结果 Tab．2 Results of recovery 2．4 样品的检测与分析 分别取市售不同嫩肉粉，按上述方法处理， 测定其酶活力，结果见表 3。 表3 样品测试分析结果 Tab．3 Results of analysis sample 结果表明，市售各种嫩肉粉中木瓜蛋白酶活 力参差不齐，则木瓜蛋白酶对肉类的蛋白分解能 力也有较大差异，最终将影响到嫩肉粉的嫩化作 用。其中，嫩肉粉 2酶活力最高，其每次使用添 加量少且肉类浸泡时间短 (见该产品的外包装说 明)；嫩肉粉 1酶活力适中，其每次使用添加量 比嫩肉粉2略多且肉类浸泡时间也略长 (见该产 品的外包装说明)；嫩肉粉 4酶活力较低，其每 次使用对肉类需浸泡较长时间 (见该产品的外包 装说明)。嫩肉粉 3酶活力为0，可能该产品里面 的木瓜蛋白酶已失去活力，或者该产品根本就没 有添加木瓜蛋白酶，属于伪劣商品。可见，嫩肉 粉酶活力的大小直接反映了该产品的质量优劣。 3 结论 利用紫外分光光度法能准确地测定嫩肉粉中 木瓜蛋白酶的活力，该法样品处理简便，所需仪 器简单，步骤简明，能快速、直观地测出嫩肉粉 中木瓜蛋白酶分解肉类蛋白能力的强弱，为判断 嫩肉粉产品质量优劣提供重要参考。 参考文献： [1]张春红．食品酶制剂及应用 [M]．北京：中国计量出版社， 2008：107． [2]牟利辉．木瓜蛋白酶的应用研究 [J]．广东化工，2008，35 (10)：96—97． [3][德]B·施特尔马赫著，钱嘉渊译．酶的测定方法 [M]． 北京 ：中国轻工业出版社 ，1992：243． [4]方焕，生吉萍，吴显荣．工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测 方法比较 [J]．食品与机械，2000，(6)：29． 8 7 6 5 4 3 2 1 0 O O 0 O O O O 0 《避