下载
加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 猪肝酯酶研究进展

猪肝酯酶研究进展.pdf

猪肝酯酶研究进展

用户cagzvvcrf8
2014-01-04 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《猪肝酯酶研究进展pdf》,可适用于高等教育领域

生物技术通讯!"##"$’()#"*’)!),’::摘要!猪肝酯酶是手性合成中重要的水解酶对它的生化特性研究较早。近几年猪肝酯酶的基因克隆研究也取得了较大进展。重组酶具有选择特异性更高的特点与生化提取方法相比成本较低廉。基因工程技术的开展使猪肝酯酶在化学工业、生物制药及相关领域中有了更加广泛的应用前景关键词!猪肝酯酶生化提取分子克隆手性催化立体选择中图分类号<=>>文献标识码:!"#"$’($#")*$*,*("")")"*"’,ABCD)EBFG(*CHCI!BICJBCKJCCLCBMKBNCOPBQ(RBKH:S::*TBK))#UBHBNCOCPQCOPCBPKCIBVWOQKQTROPCPGPCRBKLBQOKPIOVQBKKOCJCKQCOPPVCPQGRBCPLGQHCKCJKBKHIQTBPCKXVCTNCHQVGJTJTBCNCVCKQ#TCOCJVLBKKQCKXVCTPPCNCORNKQHCPPGJTPQTCLCQQCOJQXCRLBBQKRICYCOWORGJBKHCZWCKPCP,CKCQBJCKHBKCCOBKHGPCRKQTBPCKXVCTPLORCKQTCIGQGOCIQTBPCKXVCGPCRBKJTCVBPQOBKRGPQOLBHBJVCRBJBKCWORGJBKHBKRGPQOKRPK"’):WBH!BNCOCPQCOPCLBJTCVBJCZQOJQBKVCJGOJKBKHJTBOJQXBKHPQCOCPCCJQBK酶是一类重要的生物催化剂酶促反应具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、应用范围广等特点。利用酶催化进行有机合成反应尤其是催化不对称合成在分子中引入手性中心进行光学活性化合物或天然产物的合成和拆分已经在医药、农药、环境以及生化研究等领域越来越受到重视。酶主要以以下几种反应形式参与不对称有机合成:!还原反应。此类酶需要辅酶(’’U)作为反应过程中氢或电子的传递体催化如*F!*F)*F)!*F)的进行。"水解反应。参与如酯、酰胺、肽、酸酐和糖苷等的水解反应^。#转移和裂解反应。催化*F*、*F’和*F)以及**、*)等化学键的生成或裂解反应。$异构化反应。催化包括消旋化反应、双键的转移、顺反异构体转化等进行。其中水解酶(TROPCP"*ZZZ)是最常用的生物催化剂占生物催化反应用酶的>‘。它们能水解酯、酰胺、蛋白质、核酸、多糖、环氧化物和腈等化合物。水解酶的种类很多最常见的来源于动物如猪肝酯酶aWBHBNCOCPQCOPCU!"b^、猪胰脂酶aWBHWKJOCPBWPCUU!b或微生物如假单胞杆菌脂肪酶a!"#$’(’)*"PWBWPCb、节杆菌脂肪酶a,,’*#,PWBWPCb及酵母脂肪酶a*)*),*#*BWPC**!b等。猪肝酯酶是从猪肝中提取的一种羧酸酯水解酶("*)它是使用最广泛的合成光学活性醇或羧酸的酯酶它的特点是水解羧酸酯时高度的立体选择性。本文即是对猪肝酯酶近年来研究和应用的概述。猪肝酯酶的生化性质猪肝酯酶属于丝氨酸水解酶。PcB、#cc发现它催化部位的肽段为“FZF*PFUOF#TOFCOFPKFZF”^。从猪肝中直接提取的猪肝酯酶是多种同工酶的混合物其相对分子质量在::de::之间。因为同工酶在底物特异性和立体选择性上的差异使混合酶表现出广泛的底物特异性。现在商业上一般以“U!"”表示自然提取而未经分离的猪肝酯酶同工酶混合物以*TBOXVC"F和*TBOXVC"F表示经分离提纯而得到的猪肝酯酶中的两种单一酶组分。猪肝酯酶的各种同工酶可以由、、’等种亚基随机组成每个亚基相对分子质量在>:::左右。在温度>f、WS>环境下亚基组成的三联体可以完全解离而在低温和较低W环境下三联体形式稳定。种亚基结构见表。因为亚基在同工酶中出现的几率很小所以多研究以和’亚基结合的同工酶。由、’亚基通过共价连接组成同工酶有以下种形式:((’’’)、)(’’)、*(’)、()。从(到型酶的相对分子质量逐渐减小W在ed>e范围内逐渐增大。酶催化反应特性的变化也呈现直线相关关系例如从同工酶(到对以酰基是直链脂肪酸的羧酸酯水解力逐渐增强("*酶特征表现)因此型同工酶以催化脂肪酸族酯水解为主而对芳香族酯、芳胺水解能力则呈下降趋势同工酶(则更多表现的是胆碱酯酶("*e)催化特性即以水解酰基是芳环的羧酸酯为主。现在推测同工酶催化特性的不同是因为组成亚基的*F端的结构或者亚基活性催化部位上的某个氨基酸的差异造成的。造成差异可能是因为对起作用的这些氨基酸修饰不同(见表)。(型同工酶(’’’如表所示为PW)和型同工酶(为,G)的F’含量有很大差别^。猪肝酯酶的文章编号<::gF:::a::b:F:F:综述猪肝酯酶研究进展程婕赵晓瑜a河北大学生命科学学院保定:S::b收稿日期:::FF:作者简介:程婕(gSeF)女硕士研究生。"FVB<hBCJTCKHSeiCGJV同工酶活性的差异一直是生化学家研究此酶的焦点之一如果是某些基团修饰造成的活性差异人们就可以通过控制修饰作用而使酶的活性统一以增大其某一方面的催化活性。现在在酶成分未知的情况下一般以短链的脂肪族酯(如甲酸丁酯、丁酸乙酯)作为测定猪肝酯酶酶活力的底物。同工酶的典型抑制剂为丝氨酸蛋白酶抑制剂!"#$(苯甲基磺酰氯)、$!(二异苯基氟磷酸)和二乙基’硝基苯酚磷脂等。(猪肝酯酶的生化提取及分子生物学研究情况猪肝酯酶的获得一直是以生化提取为主生化提取过程具体可以细化为’个步骤:!酶的提取:绞碎组织加入适量的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液后匀浆匀浆液先后用纱布、滤纸过滤得到澄清粗提液"羧甲基纤维素柱层析:在已经用醋酸醋酸钠缓冲液平衡过的羧甲基纤维素柱中过粗提液整个过程在核酸蛋白检测仪的监测下进行在起峰、峰平稳及峰下降)个阶段收集)个样品#硫酸胺分级分离:向收集到的过柱液中加入(*饱和度硫酸胺静置,(离心去沉淀取上清待上疏水亲和层析柱进一步纯化$苯基琼脂糖疏水亲和柱层析:琼脂糖装柱用(*饱和度的硫酸胺溶液平衡好后将分级分离得到的上清液过柱而后用磷酸缓冲液洗脱。洗脱开始后在核酸蛋白检测仪监测下收集起峰、峰下降阶段洗脱液。最后洗脱液的最高比活可以达到’,’。一直以来生化提取所得的商业产品如#:、<=>A<等公司生产的BC:DEAF,、BC:DEAF(G都是猪肝酯酶的同工酶混合物。对于某些特异性要求高的催化反应商业产品不能胜任。(**,年H:<A等I用<=>A<公司提供的甲醇酵母表达型试剂盒得到一种猪肝酯酶即脯氨酸萘胺酶(JK<ALA>:<:JC>CEK::MA)它是单组分的纯酶。其NOP总长为,Q,I个碱基编码II个氨基酸残基其中第Q碱基编码,个氨基酸残基的信号肽序列第I*到,RR碱基编码成熟蛋白的’个氨基酸残基第*位氨基酸残基为糖基化位点。和商业提纯的猪肝酯酶比较其催化特性有些不同比如当催化(NS#),苯基,丙基醋酸消旋体生成单一醇时商业酶倾向于合成N醇而重组酶则反之这可能是因为重组酶是单一亚基三聚体所致R。经过TA<U:<V序列比较发现此酶与另一种从猪小肠得到的猪肠甘油酯水解酶(JW<A<>AM><:KKEWAKAM>ACEK:MA)基因编码区序列同源性高达QR。猪肠甘油酯水解酶也是一种水解型羧酸酯酶。这两种重组酶经酶活测定都具有和生化提取得到的纯酶相近的酶活力而且重组酶的热稳性和耐碱性能有所提高。)猪肝酯酶的立体选择性研究情况),选择机理猪肝酯酶作为羧酸酯酶的一员从(*世纪I*年代起就开始被研究是目前最常应用于手性催化工业的试剂之一Q。利用猪肝酯酶催化手性拆分的机理为:酶外消旋酯水解:XGN,YBZZN(X(Z!N,YBZZXN,YBZZN(GXN(Z外消旋酯光学活性酸或酯酶(X)N,BZZN(YX(Z!(N(YZXN,BZZN(Y)XN,BZZ外消旋酯光学活性醇或酯内消旋酯水解:,W:>PX酶"酶P!"X酶(,)(,YW:>YW:>W:>YGUX酶"酶U!HX酶(()(Y反应式中P、U代表一对内消旋对映异构体酶即猪肝酯酶"、H为催化产物。反应(,)的酶催化速率常数W:>大于反应(()的常数所以总体倾向于合成"。其中酶PU是反应的中间物中间物的稳定性也决定着产物生成速度,,。酶PU是以酰基酶复合物的形式存在的。针对猪肝酯酶具有激活效应#>JM等提出以下模型:X#X#(FX#"F#"#F#!#FX!!:>CPG:LX"#$WX#("F""F#!"FX!!:>CUG其中"是修饰物#是底物"F和F#分别是修饰物激活复合物和底物激活复合物当中间物"F##F#以速率(分解时因(,反应速率大大提高,(。:A<等进一步提出!HF每个亚单位有两个连接位点催化位点和效应位点。效应位点可激活底物水解反应如对硝基磷酸乙酯的^:从,R‘,*’至)Q‘,*’K<S从R‘,*至*IQ‘,*)KHS激活剂为甲醇、乙腈等小分子有机物或底物本身。同时效应位点还可提高aa(酶抑制剂解离常数)和<(酶抑制剂结合常数)但并不改变抑制常数aa<G,)。说明抑制剂与酶形成复合物的速率可通过效应位点结合调节物大大提高却不改变平衡常数这对于调节猪肝酯酶的催化反应是有利的。)(猪肝酯酶的立体选择性特点)(,反应条件温和猪肝酯酶可在温和条件下催化乙酸环乙酯、,甲基,环戊二烯甲酸乙酯和前列腺素F,甲酯水解如果用化学法水解(酸碱或碱解)这类酯则很容易导致水解反应的发生。这一特性已被成功地用于前列腺素F,合成过程中最后的羧基去保护基反应,’。)((区域选择性特异区域选择性(AMAKAW>=>E)是指在一定的反应条件下优先选择与分子内不同位置的某一相同功能基团起化学反应生成某一种异构体而另一种异构体则很少生成。酯酶催化水解反应具有区域选择性猪肝酯酶能区域选择性地催化苹果酸二甲酯的,羧酸酯发生水解反应。同样由外式和内式双环((,庚酸乙酯组成的混合物猪肝酯酶只能水解混合物中位阻较小的外式羧酸酯而内式羧酸酯则不能被水解反应后两者很容易被分离纯化。)()对映选择性特异对映选择性(A<:<:>MAKAW>=>E)是表,猪肝酯酶三种单体的生化性质比较,*亚基!JO端B端活性部位PP的替换水解活性甲酶丁酯乙酰苯胺’(**QR**I,’**,’RKEKEKEKAbKE:K:TKbPMJPMJXXXXXXXXX程婕等:猪肝酯酶研究进展(()生物技术通讯!"##"$’()#"*’)!),’::指反应优先生成一对对映异构体中的某一种或者使反应优先消耗对映异构体反应物(外消旋体)中的某一对映体后者又称为去消旋化或不对称转化。在内消旋酯拆分中人们常用!胰凝乳蛋白酶和猪肝酯酶催化潜手性二酯不对称化。!!二取代丙二酸二酯可以被猪肝酯酶或!胰凝乳蛋白酶选择性水解为相应的手性单酯分子中$基团较小时(从乙基到正丁基和苯基)猪肝酯酶选择性水解<=型酯当$基团增大后>!"优先催化<=$型酯水解。催化潜手性二酯时具有酯酶催化活性的鲁式不动杆菌(!"#$’()"*’,##)和节杆菌(!**’()"*<)的立体选择性与猪肝酯酶正好相反。猪肝酯酶的催化反应分类酯酶催化的手性中心可以在羧酸部分也可以在醇基部分由此分为酰基催化及醇基催化。酰基催化催化潜手性二酯(如潜手性二羧基二甲酯)、内消旋二酯(如戊二酸二甲酯衍生物和琥珀酸衍生物)、内消旋环状二酯和内消旋双环二酯水解其中水解体积大的内消旋双环二甲酸二酯水解产生光学纯对映体后者是某些生物活性物质合成的起始原料AB。醇基催化催化内外消旋环状二醇二酯水解如水解环戊烯二醇二羧酸酯生成的产物是前列腺素及其衍生物合成的起始原料CB。催化含氮环状二酯水解苄基保护的咪唑酮衍生物为相应单酯此产物是DEF生物素合成的重要前体GB。猪肝酯酶近年来的手性催化应用简介对、间、邻羟基苯甲酸的二酯衍生物用猪肝酯酶、猪胰脂酶及由橘皮中提取的橘皮酯酶水解HB。酶水解双(三氟乙基)二甲基环丙烷双羧酯的产物可以抑制植物的乙烯生成酶的活性从而减少乙烯的合成而众所周知乙烯是植物生长过程开花、成熟、生殖、老化的诱导激素。酶催化消旋双甲氧羰基氧环戊烷生成$$二酯水解它被用于抑制人类免疫缺陷病毒IB。水解羟基苯丙酸酯或其衍生物生成羟基苯丙羧酸后者是合成常用抗抑郁药JKLMJNOM和盐酸PQLRJNOM的前体:B。在猪肝酯酶水解非手性酯产生光学活性单酯时可利用’$检测酶解过程用手性固体物做固定相的气相色谱柱分离对映体。手性色谱法是测定对映体组成的最有效的方法之一色谱固定相或流动相中的手性介质能将对映体直接或间接地完全分离从而确定各对映体的组成。该方法的缺点是手性柱或手性试剂价格昂贵。在手性溶剂、手性衍生化试剂或手性位移试剂作用下对映体分子间、*、>、IS的化学位移不同据此可以测定各对映体的组成情况。丙烯醇的化学拆分法在国外研究很多但步骤繁琐有些拆分剂制备较难特别是化学拆分中结晶收率均不高。付小林利用猪肝脂酶在水相中拆分丙烯醇化学收率为C:T对映体量可达到GTB。在猪肝脂酶催化下外消旋的C二氧杂螺B壬烷G二酮只有一个对映体能发生水解生成羰基庚二酸此庚二酸经过再内酯化和拆分的多次循环可将外消旋体转化成单一的对映体得到螺双内酯。螺双内酯可以进行开环聚合得到体积收缩较小或零收缩甚至体积膨胀的聚合物是一类重要的“膨胀单体”具有广泛的应用前景。猪肝酯酶作为现代化学工业手性催化生产中重要的应用酶类其用途在不断开发之中。随着人们对其酶学性质认识的不断深入以及利用基因工程对酶的优良改造相信在今后它将作为一个稳定、高效、应用范围广泛的手性酶成为绿色生产工业中的重要一员。参考文献B高守海酶催化选择性有机合成新进展UB应用与环境生物学报IICDF:AB杨春龙水解酶在制备旋光性农药中的应用UB化学世界IIID:FV:GBWN#WW>NXNYM=ZJMZN=OJMNUB=ZNYM(NZMK(N<II:GGDFVIB^YNS‘NNK>U^NPPM=MOJP=KP<NXNYM=MJM=MUB=ZNYM(NZMK(N<NIH::DFVAB)MK*M!NM>Q=NPNZJNOOZ=ZJM=NJNOPMJM=MCJ=NKM=NZMJM=MPJMQMKQMD"FUB"Q=U(NZMKIHIVAGCB!OXQNaW*ONOXPQOZJNOML<=MNOOZ=ZJM=NRJNOP=MZKbNOOJ<NXNYM=MJM=MUB*MKbNZMK::VAGCGBQNaW!OX(YM=ML<=MNONOJMMJ#"#))’*#JMOOZMMOOJNMMZJNYNJV’Ma<MZJNOJM<<NZJNOP<NXNYM=MJM=MUBOXMa*MKOJ":::DAFV::HB^YN!,c)dU>Q=NPNZJNOOKMZQ=ZONOXP<=ZNOMNOJMJNOXZM=MJM==MDMYNMOZMP=NJNMOJNJaNJZ=bLMJM=MFUB"Q=U(NZMKIIHDAGFVIBeMM=e‘OX*"OKMP=ZMKNZOJNUB"OKIIHDFV:B*N=KM!N<M"JM=MZ=MMONOXMJOQJ=N"OKMfBB$ZM*K<O>=QZJ^MZ=N<JNO*J’HAICCBJ<UeKNJO"*=bLMJM=MD"*FZK<=NOPWNROMJNZ<=<M=JNMP=MMM<ZNZWMO<NXOLNYM=Z=RbLMJM=MUB*OU(NZMKIIHDAFVACAB!K!e>(=aO,MUM(>NXNYM=MJM=MZJM=NP=ZMKNZ!QbJNJQJM!=LMJM=UBU)=X*MKII:DAAFVAHGHBMKOO"UQOM‘*=ZJM=NJNOPNMOKMP<NXNYM=MJM=MZMKNZ<=<M=JNMUB"Q=U(NZMKIGIDIAFVA:IB,<ON*U(NPQOZJNOZN=OJOYNbNZMKNZKMJRA>=M<=JNOPDFMJ=XMO=LXQJ=JMWMNOJM=RKMNJMJD$FKNO=LbQJ=NZZNO!Z=ONJNOMUB#MJ=RM=O!MJJIHDAFVAAAB(Z$UK<M",,N==,JM=MMMZJNYM<NXNYM=MJM=MZJRM=NP=NXNbNZZMKMNMJM=V<=M<=JNOP<JNZ<Q=MGM<LJMJ=OML=<JNMUB#MJ=M=O!MJJIHADCFV:HGCB!QKMOeZOMNM="OKJNZ=NP<=ZN=ZNNRZZZ<MOJMOMNV<=M<=JNOPD$FOD$F=LZZ<MOJMOM=NYJNYMUB#MJ=M=!MJJIHDAFVAHGAGB‘OXS*U(NPQOZJNOZN=OJOYNbNZMKNZKMJ*N=<=MZQ==JDEFb=JNOODFPZJ=UB#MJ=M=NO!MJJIHDAFVIIIHBQJUSM=JNMbQNNOXbZWP=ZZ<MOJONOJQ=<=QZJUBU*MKNZ"QZJNOIIGDGFV:IB(J=M*"OKMNO=XONZOJMNUB’QZMNMO’QRZMJNMIIIDHF:HI:B*=$NbM=N=$"OKMZJMQ=NPNWJM<=<OMNZNZZNNMJM=ZNOMOXJM<MOMOJ=MYM=PMOJNMRMZJNYNJUBU(=*MKZ::DVFGBMKOO"UQOM‘*=ZJM=NJNOPNMOKMP<NXNYM=MJM=MWNOMJNZUB"Q=U(NZMKIGIDIAFVAI

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/3

猪肝酯酶研究进展

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利