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蛋白质纯化

nini
2013-11-21 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《蛋白质纯化pdf》,可适用于工程科技领域

GEHealthcare蛋白质纯化手册imaginationatworkAntibodyPurificationHandbookTheRecombinantProteinHandbookProteinAmplificationandSimplePurificationProteinPurificationHandbookIonExchangeChromatographyPrinciplesandMethodsAffinityChromatographyPrinciplesandMethodsHydrophobicInteractionChromatographyPrinciplesandMethodsGelFiltrationPrinciplesandMethodsHandbooksfromAmershamPharmaciaBiotechReversedPhaseChromatographyPrinciplesandMethodsExpandedBedAdsorptionPrinciplesandMethodsChromatofocusingwithPolybufferandPBEMicrocarriercellculturePrinciplesandMethods蛋白质纯化手册前言第一章纯化策略一个简单的方法样品准备三步纯化策略蛋白质纯化的总体指导原则第二章样品准备纯化开始之前样品的提取和净化第三章三步纯化策略原理纯化技术的选择组合样品状态第四章捕获第五章中度纯化第六章精细纯化第七章蛋白纯化策略的例子重组酶的三步纯化重组抗原结合片段的三步纯化单克隆抗体的两步纯化膜内蛋白质的一步纯化目录第八章储存条件提取和净化步骤第九章纯化技术的原理和标准条件离子交换(IEX)疏水性相互作用(HIC)亲和作用(AC)凝胶过滤作用(GF)反相作用(RPC)膨胀床吸附作用(EBA)前言蛋白质纯化技术和方法的进展一直是推动生物技术进步的最基本的前提条件。本手册为顺利进行蛋白质的纯化提供了一些建议和例子。蛋白质纯化方式多种多样从简单的一步沉淀操作到大规模的有效的生产过程。经常采用一步以上的纯化步骤达到想要得到的纯度。对蛋白质进行成功有效的纯化的关键是选择最适宜的纯化技术优化它们的操作过程来满足所要求达到的纯度并且将它们以合乎逻辑的方式组合起来使用最少的纯化步骤达到蛋白质产量的最大化。大部分的纯化方案都包含一些色谱技术。因此作为研究结果色谱技术在那些需要进行蛋白纯化的实验室里已经成为了一个基本的工具。不同的色谱技术有不同的选择性它们可以形成强大的组合来纯化任何活质分子。重组DNA技术的发展使蛋白质的产量得到很大的提高。重组蛋白的制备经常以方便后续的色谱纯化的形式存在。然而这仍然不能解决所有的问题。宿主污染问题仍然存在与样品的可溶性蛋白结构的完整性和生物活性等的相关问题仍然存在。尽管在纯化过程中可能需要考虑大量的参数但是按照一些简单的指导原则和应用三步纯化策略仅仅需要了解一些色谱技术基础知识的细节就可以使整个纯化过程能够简单容易的设计和完成。建议符号:对于纯化的一般建议大规模纯化的建议小规模纯化的建议捷径对于介质选择的建议第一章纯化策略――一个简单的方法应用系统化处理方法来研究纯化策略。第一步是描述基本的纯化方案。一般需要考虑回答的问题例如:制备产品的目的是什么?什么样的原材料是可以使用的和如何处理它?纯度问题与材料的来源有什么样的关系和终产品的预期使用由什么联系?什么东西必须去除?什么东西必须完全去除?最终纯化的规模是什么?如果需要扩大规模用已选择的纯化技术将会产生什么样的后果?在经济方面的限制是什么?什么样的资源和设备是可以利用的。多数纯化步骤需要经过一步以上的方法来达到预期想要的产品纯度。这包括任何需要改变样品条件的限制性步骤即将产品从一种纯化技术转移到另一种适合于进行下一步纯化操作的状态这一过程中的每一步都将会导致产物的丢失。例如假定每一步能够获得的产量那么如图所示经过个纯化步骤后总产率将被减少到仅仅。因此使用最少的步骤和最简单可行的设计来达到预期的产量和纯度增加步骤是无效的除非已经完全满足了纯化所需要达到的产量。在某些特殊的情况下通过简单的增加重复步骤就可以很容易使样品达到可以使用的纯度。但是经验表明即使是那些最具挑战性的样品纯化高纯度和高产量的制品也是可以通过恰当的选择并有效的组合少于四步的纯化步骤高效率的完成。各种技术应该以逻辑的顺序组合起来避免改变样品条件的步骤恰当的选择色谱技术使纯化步骤尽可能的少。在纯化过程中限制纯化步骤数ₔ俓᪟stepstepstepstepstepϖ䛾()图多步骤纯化的产量。样品制备为了高效、经济的获取足够纯度和数量的蛋白我们可以使用每一种纯化方法。设定纯化物的纯度、数量和维持生物活性和限定经济的框架和工作时间框架是非常重要的。所有涉及到目标蛋白的特性和污染物的信息都会对纯化的进展有所帮助的。用一些简单的实验来反映样品和目标分子的特性是一个非常好的方式。随着纯化技术的进展和评价纯化效果的需要发展快速的和值得信赖的分析方法是最非常重要的。样品的制备和提取过程的发展应该优先于使用色谱技术进行第一步纯化。在有样品背景信息的情况下分析样品和样品制备步骤可以放在三步纯化策略中考虑。三步纯化策略想象纯化样品要经历三个阶段样品捕获中度纯化和样品的精细纯化。在三步纯化策略中特定的目标物在纯化过程中的每一步都要进行分配。在目标物捕获阶段样品经过分离、浓缩并且对目标物进行稳定化处理。在中度纯化阶段样品中大量杂质被去除例如其它的蛋白和核酸、内毒素和病毒。在样品精细纯化阶段通过去除任何残留的微量杂质或者密切相关的物质来达到较高的纯度。选择和优化组合纯化技术对于样品的捕获、中度纯化和样品的精细纯化是非常关键的确保快速纯化方法的研制在更短的时间里完成产物的纯化并且实现经济节约的目标。最终的纯化过程应该包括样品的制备当需要时应该有样品的提取和净化接下来是三种主要的纯化步骤理想的组合在一起如图所示。纯化的步骤数主要依赖于对纯度的要求和蛋白最终的使用目的。StepPurityᄣ೗ጚԢ༵ൽࢅ৫ࣅᄣ೗վइዐ܈كࣅ৛ဦكࣅܵ⻪��⊂㑘঻⽢჉ࡅำ⤵࣪ำ๖҂⼞⮳ᱱ䉗䓭ݟᰯ㏷倇㏞Ꮥ⮳㺰ⅱ图样品制备和三步纯化策略。蛋白质纯化的指导原则在这里所示的蛋白质纯化指导原则可以被用于任何纯化过程并且可以作为如何系统化处理样品的建议用来研制任何有效的纯化策略。作为一个提醒这些纯化方法将在下面适当的章节进行重点强调。明确目标对于纯化样品明确最终产品需要达到的纯度、活性和产量要求要避免过度纯化或者使用的纯化不够达不到要求的纯度。明确需要纯化的目标蛋白质的特性和关键的杂质对纯化技术的选择要简单化并且要产生最佳的纯化效果。发展检测分析技术能够快速的检测蛋白质的活性回收率和关键的污染物。使每一阶段处理的样品最小化避免过多的处理步骤过多的处理步骤有可能会损失样品活性降低回收率。尽可能少地使用添加剂可能需要额外的纯化步骤去除添加剂否则添加剂可能会干扰样品的活性分析。尽早去除对样品有损伤的杂质例如蛋白酶在每一步纯化过程中使用不同的纯化技术充分利用样品的特性对样品进行分离纯化(样品大小、电荷、疏水性、配基的特异性)使用的纯化步骤尽可能少额外的纯化步骤将会减少目标蛋白的产量和增加纯化时间要合乎逻辑的组合纯化步骤。保持简单化!第二章样品准备实验开始之前为了能够有效的、经济的获取足够纯度和质量的某种蛋白质使用任何有效的纯化方法从样品的制备到富集蛋白从提取样品为了获取样品的生物化学特性到大规模生产治疗性重组蛋白。设定目标蛋白要求达到的纯度和产量的目标维持生物活性和以钱和时间方式来衡量的纯化过程的经济性是非常重要的。对纯度的要求必须要考虑原料的性质最终产品的预期使用目的和特殊的安全问题。例如区分那些必须要去除的杂质和可以忍受的杂质是非常重要的。其它因素也能影响物质的优先次序。高产量通常是关键目标但是对于那些样品很容易获得或者那些仅需要很少数量的产物追求高产量就不是那么关键了。在缺少ÄKTA™设计色谱系统资源的条件下要求多方面纯化方法的进展或许是不可能的。同样时间压力与一个缓慢的分析流程相结合将会引导蛋白质纯化朝向更少的监测和最优化的组合方向发展。所有涉及到靶蛋白特性和污染物的信息在纯化方法研究过程中都将会有帮助作用使选择更快、更容易的纯化技术和优化纯化条件成为可能同时可以避免那些可能使靶蛋白失活的因素。随着蛋白纯化方法和评价纯化效果(产量、生物活性回收率)的进展研制快速和可以信赖的分析方法已经成为必需。明确目标目标:为纯度和产量设定最少的目标维持生物学活性和节约钱和时间。按照对产品的最终使用来规定产品纯度要求下面所示的是对纯度要求的例子。纯度非常高>用于治疗体内试验纯度高X(射)线衍射晶体分析法和多数物理、化学特性鉴定方法纯度适中<用于抗原来制备抗体、N端测序分析明确“关键”污染物尽可能快的鉴定可能残存的污染物的特性有研究指出某种蛋白的纯度大于(即靶蛋白占总蛋白的)是远远不能保证这个纯度能够满足某种预期的应用。对于那些通常的注释例如“蛋白经过考马斯亮蓝染色SDSPAGE后证明是同质的”同样是正确的。如果残留物由的无害的杂质组成那么的纯度或许是可以接受的。然而即使是很少量的可能存在生物学活性的杂质也可能在研究和治疗应用方面产生显著的问题。所以区分那些必须被完全去除的污染物和那些减少到一定水平就可以接受的污染物是非常重要的。既然不同的起始物质类型会含有不同的污染物种类它们会产生不同的污染问题。在所需要的纯度之上要优于在所需要的纯度之下。尽管纯化步骤数应该最少化但是最终产物的质量不能打折扣。如果纯化产物的纯度低并且污染物是未知的随后的一系列研究结果的可信性将会受到怀疑。那些能够使蛋白降解或者失活或者干扰分析结果的污染物应该尽可能早的去除。在整个纯化进展过程中在纯化的每一个阶段都必须考虑维持蛋白活性的需要。如果在纯化的第一步蛋白酶就被除去将靶蛋白转移到一个友好温和的环境中是特别有益的。下游的生产过程是在限定的经济框架里完成的用安全的和可以信赖的方法完成靶蛋白的纯化达到需要的纯度和回收率。经济是一个非常复杂的问题。在商业化生产中时间对于市场来说是非常重要的它能够弱化一些问题对纯化方法进行有效的组合使回收率、容量或者速度三者达到最佳的组合。产品的稳定性和可靠性同样受到很大的关注因为一个批次产品的失败会产生很多严重的后果。生物制药方面的纯化或许涉及到一些特殊的安全问题例如检测和去除病原体、热原、免疫原等污染物和致癌的危害物质。用分析技术锁定特殊的污染物质为了证明它们已经被降低到可以接受的水平是必须的。定义靶蛋白的特性和关键的杂质目标:为靶蛋白确定一个“稳定性窗口”为了更容易的选择纯化技术和优化组合并且避免在纯化过程中蛋白质失活。检查蛋白稳定性窗口至少包含溶液的pH值和离子强度。所有涉及到靶蛋白和污染物特性的信息都将有助于指导选择蛋白纯化的分离技术和试验条件。对于靶蛋白或者相关蛋白的基础数据包括蛋白的大小、等电点(pI)和疏水性或者可溶性数据。非变性一维和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳能够表明样品的复杂性和靶蛋白及主要污染物的特性。特别重要的是对蛋白质稳定性窗口的了解可以避免使蛋白质发生不可逆失活的条件。检查靶蛋白质对溶液pH值和离子强度的稳定性窗口是明智的。表显示的是不同蛋白质的特性是如何能够影响一个纯化策略的。表蛋白质特性和它们对选择纯化策略的影响样品和靶蛋白质特性对选择纯化策略的影响对温度的稳定性需要在更低的温度下快速操作pH稳定性提取或者纯化缓冲液的选择。离子交换条件的选择亲和或者反相色谱的选择。对有机溶剂的稳定性选择用反相色谱条件去污剂需要量考虑色谱步骤的影响和去除去污剂的需要。考虑去污剂的选择。盐(离子强度)针对沉淀技术、离子交换技术和疏水性相互作用色谱选择需要的条件。辅助因子对于蛋白稳定性或者添加剂、pH值、盐和缓冲液的选择对活性蛋白酶的敏感性需要快速去除蛋白酶或者加入蛋白酶抑制剂对于金属离子的敏感性需要在缓冲液中加入EDTA或者EGTA对氧化还原剂的敏感性需要加入还原剂分子量选择凝胶过滤介质蛋白质电荷选择离子交换条件生物专一性的亲和力选择配基作为亲和介质翻译后修饰选择簇特异性亲和介质疏水性相互作用针对疏水色谱选择介质建立分析测定法目标:随着纯化技术的进展评价纯化效果(产量生物活性回收率)和帮助优化纯化方法。选择快速和可以信赖的分析方法为了在纯化方法的研究中取得有效的进展应该评价每一步纯化的效果。实验室应该使用下列分析方法:针对靶蛋白的快速和可以信赖的分析方法。•确定纯度。•确定总蛋白量。•针对那些必须被去除的杂质的分析。•针对靶蛋白的可以信赖的分析方法的重要性无论怎么强调都不过分。检测色谱收集馏分应该能够确保所使用的分离缓冲液不会干扰分析结果。靶蛋白质的纯度经常用SDSPAGE、毛细管电泳法、反相色谱法或者质谱法进行评价。Lowry或者Bradford分析方法经常用于总蛋白质含量的测定。Bradford分析方法非常适用于那些脂类含量高的样品的分析而脂类杂质可能会干扰Lowry分析方法的结果。对于大规模蛋白的纯化针对靶蛋白质和关键杂质进行分析经常是基本的要求。在实践中当为了某种研究目的而纯化某种蛋白质鉴定和建立那些有害污染物的特殊的分析方法太消耗时间以至于不去鉴定和建立那些有害污染物的分析方法。一个实用的方法是将蛋白纯化到某种水平然后在存放一段时间后用SDSPAGE分析蛋白质检查蛋白酶的切割作用。对实验进行适当的质控包括对蛋白质生物活性的分析将会指示杂质是否会干扰研究结果。样品提取和澄清样品处理最小化添加剂的使用最小化尽早去除对目标蛋白有损伤作用的污染物定义:从原材料中将靶蛋白进行初级分离目标:为了进一步的纯化准备澄清样品。去除微小的颗粒物质或者其它与色谱分析不相溶的污染物。样品制备是否优先于第一个色谱纯化步骤取决于样品的类型。在一些情况下可以将样品直接用于第一步步骤即样品捕获。例如细胞培养上清可以直接用适宜的色谱基质例如Sepharose™FastFlow进行纯化可能仅仅需要一个小的pH值的调整或者离子强度调整。然而对于一些样品提取和澄清步骤是最基本的。如果样品需要进行提取那么所选择的技术必须是稳定的和适用于将来可能用到的所有规模的纯化。我们必须注意到某种技术例如硫酸铵沉淀法经常用于小规模的纯化可能不适用于非常大规模的样品制备。如果一个纯化方法将要用于扩大规模生产缓冲液和添加剂的选择必须要仔细考虑。在这些例子中便宜的缓冲液例如在实验室常用的醋酸缓冲液或者柠檬酸缓冲液较适用于更复杂的组分。同样我们也应该注意到透析和其它用来调整样品状态的通用方法不适用于非常大量的或者非常小量的样品准备。对于重复性纯化使用一种稳定的和能够处理样品差异的提取和澄清技术。这样可以确保在下一次的纯化步骤中得到同一个重复性的产物不管是否与开始物质具有差异性。只有在必要的时候才使用添加剂来保证样品的稳定性或者提高样品的提取效果。选择那些容易被去除的添加剂。添加剂可能需要通过额外的步骤去除。使用Sephadex™G凝胶过滤介质预装柱应用于实验室规模的快速的样品净化如表所示:表针对样品净化的预装柱预装柱每次运行的样品体积每次运行回收的代码样品体积HiPrep™脱盐mlmlHiTrap™脱盐mlmlFast脱盐PCmlmlPD脱盐mlmlSephadexG凝胶过滤介质在实验室和规模化生产中被用于制备和净化蛋白质大于的样品。样品体积高达或者在一些情况下可以上样量达到的总柱体积。在单一的步骤中样品被脱盐转换到一个新的缓冲液中低分子量的物质被去除。具有较高的体积容量并且对样品浓度相对不敏感这一步的速度可以满足大体积的样品被快速和高效的处理。使用高样品体积装载可以产生使样品分离并且对样品的稀释最小化(大约:)的结果。在第章包含更进一步的对样品储存、提取和净化步骤的详细说明。SephadexG也被用于改变样品的条件。例如在两步纯化之间快速调节pH,缓冲液交换和脱盐。需要考虑的介质SephadexG凝胶过滤应用于高分子量和低分子量的快速组分分离。典型的流动速度是cmh(SephadexGSuperfine,SephadexGFine),cmh(SephadexGMedium)在单一步骤中样品的净化和捕获的组合如果需要处理大量体积的样品或者将来这个方法需要扩大纯化规模考虑使用STREAMLINE™扩张床吸附技术。这项技术适用于大规模的重组蛋白的纯化和单克隆抗体的纯化。含有颗粒的原始样品不需要过滤和离心就能够应用于扩张床。STREAMLINE吸附是针对使用STREAMLINE柱而经过特殊设计的。在液态化床的工业应用上它们可以达到在高流速下的高产率。这个技术不需要对样品进行纯化因此将样品的准备和捕获结合于单一步骤中。粗制样品被应用到STREAMLINE介质的扩张床中。在靶蛋白被捕获的同时细胞碎片、细胞、颗粒物质、全部细胞和污染物被除去。流动是可以反相的靶蛋白在洗脱缓冲液中被解吸附。需要考虑的介质:STREAMLINE(离子交换,亲和,疏水性相互作用)直接从粗制品中完成样品的净化和捕获按照类型和应用进行设计的STREAMLINE吸附剂可以直接用于处理从发酵匀浆和细胞培养发酵的粗制的原料以cmh的流速进样。注释:cmh:流速(线流率)=流量率柱的横断面积。第三章三步纯化策略原理随着样品的背景信息、分析方法和样品的制备和提取步骤的进展可以应用三步纯化策略对样品进行纯化。(图)这个策略被用来帮助发展制药工业中治疗性蛋白的纯化过程同时在帮助研究性实验室研制纯化方案时也是同样有效。StepPurityᄣ೗዆Ԣ!༵ൽ״ൣᄣ೗վइዐ܈كࣅ৛ဦكࣅܵ⻪��⊂㑘঻⽢჉ࡅำ⤵࣪䮓๖҂⼞⮳ᱱ䉗㣦अᰯ㏷⮳倇ⅣᎢ㏞Ꮥ图样品制备和三步纯化策略在纯化过程中分配一个特定目标物到每一步中。在三步纯化策略中一个特定目标物被分配到每一步中。纯化问题与特定的步骤相关联在很大程度上取决于起始物质的特性。因此一个纯化步骤的目标物将依据它在纯化过程的位置而不同即在开始阶段将产物从粗制样品中分离时在中间纯化阶段为了进一步纯化已经部分纯化的样品时或者在最后阶段将纯化好的样品进行净化处理。三步纯化策略保证更快的纯化方法进展和用更短的时间和更经济的方式纯化产品。在捕获阶段将目标物进行分离、浓缩并且对目标物进行稳定化处理。目标物被浓缩和转移到另外一个环境中可以保存它的活性或效价。最终其它关键污染物被大量的去除。在中度纯化阶段制品中的大量杂质已被去除例如其它的一些蛋白质和核酸、内毒素和病毒。在样品精细纯化阶段由于大量的杂质已经被去除仅剩下一些痕量的杂质或者是与目标物非常接近的相关物质。制品完成了最终的纯化。应该注意的是三步纯化策略并不意味着所有的纯化策略都必须经过三个纯化步骤。例如对靶蛋白的捕获和中度纯化可能在一个纯化步骤中就完成了或许中度纯化和最后的精致可能在一个纯化步骤中就完成了。类似的如果对纯度的要求很低时一个快速的捕获步骤就足够获得想要得到的结果或者制品开始的纯度就很高只要经过精细纯化阶段就可以达到需要的纯度的产品。对于治疗性蛋白的纯化或许需要四阶段纯化或者五阶段纯化步骤才能够完全达到对纯度和安全性的最高要求。对于一个有效的纯化过程捕获、中度纯化和精细纯化阶段的优化组合是非常关键的。纯化技术的选择和组合ܵ䓗⢶䕎Ꮥშ䛾఍ᩥ⢶每一种技术都在分辨率、容量、速度和回收率之间达到一种平衡样品处理最小化纯化步骤最少化在每一步骤中使用不同的技术目标:对于一个设定纯度的产品通过快速途径进行纯化对于色谱分离技术而言考虑到回收率、分辨率、速度和容量等因素每种不同的色谱技术将会得到不同的绩效表现。一种色谱技术可能对于上述参数的其中之一是最优的例如分辨率或者在两种参数间获得最佳的平衡例如速度和容量。对于按照这些参数其中之一进行优化的分离纯化方法所产生的结果与那些使用同样的技术但是聚焦于一个可选择参数所产生的结果有显著不同。如同第页所显示的结果那样离子交换技术既可以用于捕获阶段也可以用于样品的精细纯化阶段。选择一种技术满足纯化步骤所要求达到的目标捕获,用简单的模式表示参考在纯化过程中加载靶蛋白的总量。在一些情况下加载样品的总量或许会受到上样体积的限制(如在凝胶过滤色谱中)或者受到大量存在于样品中的污染物的限制而不是靶蛋白的总量的限制。速度在开始纯化阶段速度是一个最重要的环节需要尽可能快的将样品中的污染物如蛋白酶等必须去除的物质除去。回收率在整个纯化的进程中回收率的重要性会逐渐增加因为被纯化产品的价值在逐渐增加。回收率受到对样品破坏过程的影响和不适宜色谱柱条件的影响。分辨率高分辨率的获得是通过对色谱技术的选择和色谱介质的效率来形成一个很窄的色谱峰。一般情况下在样品纯化的最后阶段获得好的分辨率是非常困难的因为这时样品中的杂质和靶蛋白质的特性非常相似。每一种技术在分辨率、速度、容量和回收率等参数中都达到了一种平衡在样品纯化中我们可以选择这些技术来满足对每一个纯化步骤的要求。一般来说如果使上述个参数中的一个参数最优化那么将会以损失其它个纯化参数为代价并且纯化步骤也会受到影响。每一个纯化参数的重要性是变化的这主要取决于一个纯化步骤是否用于捕获、中度纯化或者精细纯化阶段。这将指导关键参数的最优化同样也指导在每一步纯化中选择最适宜的介质。应用色谱技术对蛋白质进行纯化这些色谱技术的分离作用是根据样品与杂质在某些特性方面的不同而进行分离的。表用在纯化过程中的蛋白的特性蛋白特性技术电荷离子交换(IEX)大小凝胶过滤(GF)疏水性疏水性相互作用(HIC)反相作用(RPC)生物识别(特异性配基)亲和性(AC)电荷特异性配基或者疏水性扩张床吸附(EBA)依据离子交换、亲和性或者疏水性依据每种纯化技术的主要优势和样品在开始纯化或者每一步骤结束时的条件来选择并且合理的组合纯化技术。通过对纯化技术的合理组合使在两个纯化步骤间的样品处理量最小化避免对样品使用条件的限制。表所示的是在三步纯化策略中对于每阶段每种纯化技术的适用性的一个指导。纯化技术主要特征捕获中度纯化精细纯化样品起始样品结束条件条件离子交换高分辨率低离子强度高离子强度高容量样品体积没有或者高速度限制pH改变浓缩疏水性相互作用好的分辨率高离子强度低离子强度好的容量样品体积浓缩高速度没有限制亲和色谱高分辨率特殊的结合特殊的高容量条件洗脱高速度样品体积条件没有限制浓缩凝胶过滤高分辨率限制样品交换缓冲液使用Superdex™体积(<总(如果需要的柱体积)话)和流速范围稀释反相色谱高分辨率需要有机在有机溶液中溶剂存在丢失生物活性的危险浓缩表在三步纯化策略中纯化技术的适用性避免额外的样品处理步骤产物从第一个色谱柱上被洗脱下来的条件应该适合于下一个色谱柱开始的条件。各种技术开始的条件和结束的条件在表中已经列出来了。例如如果样品是低离子强度可以使用离子交换柱。从离子交换柱将样品洗脱后样品通常会在高的离子强度的缓冲液中能够使用疏水层析柱(如果需要的话可以调整溶液的pH值和加入更多的盐)。相反如果样品从疏水层析柱上被洗脱下来样品可能处于很高的盐离子强度的环境需要对样品进行稀释或者进行缓冲液的交换步骤为了进一步降低盐离子强度使溶液的离子强度满足可以进行离子交换的需要。这样样品先经离子交换再用疏水层析比先用疏水层析再用离子交换要更加直接。硫酸铵沉淀法是在实验室规模应用的一个通用的样品净化和浓缩步骤。在这种情况下在捕获阶段使用疏水层析(需要高的盐离子浓度将样品结合到介质上)是一个理想方法。在从疏水层析柱上将样品洗脱后样品中盐离子浓度和总样品体积将会被显著减少。将部分样品稀释或者用SephadexG脱盐柱进行快速缓冲液交换为下一步的离子交换或者亲和层析步骤准备样品。凝胶色谱技术能够很好的适用于那些经过浓缩技术(离子交换、疏水层析、亲和层析)处理过的样品因为目标蛋白经过洗脱后体积缩小来自洗脱缓冲液中的复合组分不会对凝胶过滤分离产生影响。(凝胶过滤是一个限定体积容量和不受缓冲液条件影响的非结合技术)。最终纯化策略的选择总是取决于样品的特殊特性和需要达到的纯化程度。图所示的是各种纯化技术的合理组合。图色谱步骤的逻辑组合在捕获步骤中要求所选择的技术应该具有对目标蛋白质很强的结合作用和尽可能少的结合各种污染物即这个技术具有很高的选择性和或对感兴趣的蛋白具有很高的容量。粗制样品或者样品处于高盐浓度的溶液中净化或者充分稀释样品亲和层析离子交换离子交换沉淀作用疏水相互作用可溶解的凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤在高盐浓度的溶液中处理样品r或者或者反相色谱反相色谱凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤脱盐模式脱盐模式脱盐模式亲和色谱离子交换疏水相互作用离子交换可能需要稀释样品澄清捕获阶段中间产物纯化精细纯化样品捕获*另外可以选择样品通过过滤和如果需要的话,它们的离子强度可以通过稀释被降低。凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤离子交换疏水性相互作用使用一个组合的纯化技术和选择其中之一的纯化技术对样品进行纯化。对于样品而言在一个离子交换疏水层析凝胶过滤层析三步纯化策略中捕获阶段的选择根据电荷的差异(在离子交换中)、中度纯化阶段根据疏水性的差异和最后的精细纯化阶段根据蛋白质大小的差异进行纯化的。图所示的是一个标准的三步纯化策略。图一个标准的纯化步骤。如果对于目标蛋白一无所知使用离子交换疏水层析凝胶过滤层析。这种技术组合被认为是一个标准的纯化步骤。在相同的样品纯化策略中考虑使用阴离子和阳离子两种交换色谱给予不同的选择性。离子交换是一个使用阴离子交换剂或者阳离子交换剂的具有不同选择性的技术。分离的pH值能够被修饰来改变样品组分带电荷特性。因此在一个纯化策略中在目标蛋白捕获阶段、中度纯化阶段或者样品精细纯化阶段可以多次使用离子交换色谱。离子交换色谱可以在同样的纯化设计中应用于样品的捕获阶段在低分辨率模式下进行快速的分离和在高分辨率模式下进行产物的精细纯化。图所示的例子是对纤维素酶进行纯化其优点是采用了不同的选择性的阴离子和阳离子交换来研制一个简单的两步纯化过程。通过离子交换色谱进行样品捕获碱性蛋白STREAMLINESP或者SPSepharoseXL建议使用的结合缓冲液:mM磷酸钠,pH建议使用的洗脱缓冲液:结合缓冲液MNaCl酸性蛋白质STREAMLINEDEAE或者QSepharoseXL建议使用的结合缓冲液:mMTrisHCl,pH建议使用的洗脱缓冲液:结合缓冲液MNaCl通过疏水性相互作用进行中度纯化苯基SepharoseFastFlow(highsub)建议使用的结合缓冲液:mM磷酸钠,pHM硫酸铵建议使用的洗脱缓冲液:mM磷酸钠,pH通过凝胶过滤色谱精细纯化Superdexprepgrade或者Superdexprepgrade建议使用的结合缓冲液:与后续使用的相符合Anmᬥ䬣(min)()Anmᬥ䬣(min)()样品:µlofTrichodermareesei粗制纤维素酶在缓冲液A中,mg柱子:MonoQ™HR流速:mlmin缓冲液A:mMTrisHCl,pH缓冲液BAMNaCl梯度:B运行分钟,运行分钟,B运行分钟样品:峰来自步骤柱子:MonoS™HR流速:mlmin缓冲液A:mM醋酸盐,pH缓冲液BAMNaCl梯度:B运行分钟图对纤维素酶的两步纯化。假设目标蛋白可以耐受反相色谱的操作条件那么可以考虑应用反相色谱来对目标蛋白进行精细纯化。反相色谱技术对蛋白和多肽的分离是以样品的疏水性为理论依据的。反相色谱是一种高选择性(高分辨率)技术需要使用有机溶剂。当蛋白的活性恢复和三级结构不是必需的时候反相色谱分析技术广泛的被应用于纯度检验分析。由于许多蛋白在有机溶剂中变性因此这项技术并没有被广泛的推荐用于蛋白质的纯化因为所纯化的蛋白很难复性和恢复到原先的正确的三级结构。然而在样品的精细纯化阶段当主要的蛋白杂质已经被去除后使用反相色谱进行精细纯化是非常有效的特别是针对少量的在有机溶剂中不变性的目标蛋白。如果纯化的目的不是要扩大规模(即仅仅需要毫克级的产品数量)可以在所有步骤中都使用高效、预装的介质如SepharoseHighPerformance(离子交换,疏水性相互作用),SOURCE™(离子交换,疏水性相互作用),MonoBeads™(离子交换),或Superdex(凝胶过滤)。标准纯化步骤推荐的介质纯化步骤MediaQuantityCodeNo捕获STREAMLINESPml捕获STREAMLINEDEAEml捕获HiPrep™SPXL柱子捕获HiPrepQXL柱子中度纯化HiPrepPhenylFF(highsub)柱子精细纯化HiLoad™Superdexprepgrade柱子精细纯化HiLoadSuperdexprepgrade柱子样品澄清条件预装PD柱子柱子样品澄清条件HiTrap脱盐柱柱子样品澄清条件HiPrep脱盐柱柱子样品条件的改变尽管我们要尽量避免在两步纯化之间对样品进行额外的处理但是对一个已经洗脱样品的缓冲液进行调节(pH、离子强度和或缓冲离子对)或许是必要的这样可以保证样品液与随后所使用的纯化技术具有兼容性。SephadexG是一个用于在两步纯化之间通过缓冲液交换进行快速脱盐和调节pH值的理想介质。加载的样品体积可以高达总柱体积的或者在一些情况下达到总柱体积的。在一个单一的纯化步骤中样品被脱盐交换到一个新的缓冲液中并且低分子量的物质被去除。图所示的是一个典型的脱盐缓冲液交换分离。高体积容量和速度使得这一步能够快速和有效的处理非常大的样品体积。加载高样品体积可以使在分离过程中对样品的稀释最小化。SephadexG在实验室规模的制备中也被用于快速样品净化。(min)Anm

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