实验1-3 蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法）
一、实验原理
1921年，Folin 首创Folin-酚试剂法，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应；1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。Folin-酚试剂法主要包括两步：
第一步 双缩脲反应
在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。
第二步 Folin-酚显色反应
Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋白质的含量。
二、实验
材料
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（一）样品液的制取
10g样品加入100mL蒸馏水进行匀浆，离心后取上清液备用（或者振荡浸渍30min滤液备用）
（二）试剂
1．牛血清白蛋白标准液（1mg/mL）
准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到50mL。
2．碱性硫酸铜溶液(福林酚试剂A)
①碱溶液：Na2CO3 2g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。
②硫酸铜溶液：CuSO4∙5H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒石酸钾钠中。
使用前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液（福林酚试剂A）。使用时新鲜配制。
3．Folin-酚试剂
在2L磨口回流装置内加钨酸钠（Na2WO4∙2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4∙2H2O）25g，蒸馏水700ml，14.68mol/L（85%）磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后用小火回流10h。冷却后，再加硫酸锂（Li2SO4∙H2O）150g，水50ml，数滴（2~3滴）液体溴（也可用30%H2O2 6~8滴代替），然后开口沸腾15min，驱除过量的溴（因溴气甚毒，这一步应在通风橱中进行），冷却后加水至1000ml，过滤，溶液呈黄色（如带绿色则不能用），保存于棕色瓶中置冷暗处备用（如配制时间较长，试剂转呈绿色），可再加液体溴数滴，煮沸15min，若能恢复原有的黄色或金黄色仍可继续使用）。
（三）仪器及器材
1．V-1100分光光度计
2．恒温水浴箱
3．试管6支、试管架
4．加样枪、加样枪架
5．坐标纸
三、实验步骤
（一）操作步骤
取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质溶液浓度为横坐标作图，准确吸取样液0.5mL于干燥的试管中，同样按表试剂，测出光密度计后，对照标准曲线求出蛋白质浓度。
管号
1
2
3
4
5
6
7
样品
牛血清蛋液（1mg/mL）mL
0.0
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.5mL
蒸馏水mL
0.5
0.45
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
福林酚试剂A
4
4
4
4
4
4
4
4
摇匀，在室温下放置10min
福林酚试剂B
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
摇匀，在室温下放置30min后再500nm下比色
A500nm
浙公网安备 33021202002483