DNA测序常见问题图谱

上海实验室：上海市徐汇区银都路218号 聚科生物楼2号楼 201室 邮编：200231 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqsh@invitrogen.com 北京实验室：北京亦庄经济技术开发区荣昌东街7号隆盛工业园203 邮编：100088 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqbj@invitrogen.com 广州实验室：广州市海珠区新港东路2429号 海珠科技大楼 213室 邮编：510320 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqgz@invitrogen.com 1. 酒精峰和染料峰 辨别要点：一般情况下这样的峰形出现在前 200bp 的某部分.大部分情况下是不影响测序 结果的. 解决 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ：重新安排反应 2. 由引物降解引起的双峰 辨别要点：每个峰下都有后一个碱基颜色的小峰，且显然是后面的碱基向前移了一个。这是 很轻微的移码现象，如果降解严重，将无法判读。 解决方案：更换引物测序 3. 由困难结构导致的信号中断 辨别要点：在某一碱基或一段区域后峰形突然变得杂乱，无可用信号，一般在 AG rich region/TG rich region/GC rich region/G or C rich region 等后易发生。 上海实验室：上海市徐汇区银都路218号 聚科生物楼2号楼 201室 邮编：200231 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqsh@invitrogen.com 北京实验室：北京亦庄经济技术开发区荣昌东街7号隆盛工业园203 邮编：100088 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqbj@invitrogen.com 广州实验室：广州市海珠区新港东路2429号 海珠科技大楼 213室 邮编：510320 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqgz@invitrogen.com 解决方案：我们目前针对此类困难模板使用新的反应体系，成功率大大提高，但并不能保证 100%出正常 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 。为了更快得到满意结果，如果您的样品序列含有二级结构的，请在订单 备注中注明。 4. POLY A/T/C/G 辨别要点:长串的连续 A/T/C/G 碱基，一般在这种结构后峰形会变乱，但也有可以测得过去 的 可能。遇到这种情况请反向测序，然后进行拼接，得到全序列。 重复序列的测定是目前荧光测序方法的一个局限。我们目前的 原则 组织架构调整原则组织架构设计原则组织架构设置原则财政预算编制原则问卷调查设计原则 是对于质粒 DNA(闭合 双 链)上当存在 polyT/A/G/C 结构时无论之后的信号质量如何，我们都会将报告发出，在 PCR 模 板上这个限制的长度为 15 个碱基。相对 A 和 T，G/C 的影响更大一些，无论在 何种模板上 只要出现连续 10 个的 G 或 C，不管之后的信号质量如何，我们都会将报告发 出。由于这是 样品的内在原因。这类问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 我们应该同正常测序一样，给客户报告，反应按 正常收费。由于 这样的重复序列对测序结果的影响是绝对的，所以还请测序客户在选择引 物时尽量避开有重 复序列的一端。 5. 重复序列 辨别要点：明显的长串类似碱基组成的结构重复，一般这种结构会导致信号的中断或者衰减。 解决方案：从反向测序 6. 混合克隆 上海实验室：上海市徐汇区银都路218号 聚科生物楼2号楼 201室 邮编：200231 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqsh@invitrogen.com 北京实验室：北京亦庄经济技术开发区荣昌东街7号隆盛工业园203 邮编：100088 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqbj@invitrogen.com 广州实验室：广州市海珠区新港东路2429号 海珠科技大楼 213室 邮编：510320 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqgz@invitrogen.com 辨别要点：明显的峰形是从插入位点或者扩增引物区之后开始可以看到由单一的峰形忽然变 成杂乱的双峰。但对于部分样品，也可能只是序列中一段峰形出现双峰，或者从某一点后出 现双峰，其他部分正常，也是混合克隆的特征之一。比如： 辨别要点：此类双峰主要是由于客户提供的质粒样品的插入片断缺失一段碱基导致，可能重 新挑取克隆会有改善。 解决方案：重新划平板挑取单克隆测序 7. 测序一开始就出现双峰 出现这种情况的原因： 一. 样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时， 如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能 有不止两个峰形。 解决方案：划平板挑取单克隆测序 二. 样品不是单一模板，这常常发生在样品为 PCR 产物的情况中。通常 PCR 样品含非 特 异性扩增，存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时容易发 生这 种情况。 解决方案：优化 PCR 反应体系或者克隆后测序 三. 样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物 恰好 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现双峰的情况。 解决方案： 选用特异性引物测序 8. 碱基缺失 上海实验室：上海市徐汇区银都路218号 聚科生物楼2号楼 201室 邮编：200231 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqsh@invitrogen.com 北京实验室：北京亦庄经济技术开发区荣昌东街7号隆盛工业园203 邮编：100088 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqbj@invitrogen.com 广州实验室：广州市海珠区新港东路2429号 海珠科技大楼 213室 邮编：510320 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqgz@invitrogen.com 在 PCR 产物中最容易出现这样的情况，这个峰图就是存在两条相差两个碱基的序列。对于 混合克隆，也可能发生。 解决方案： 克隆后测序 9. 信号衰减 辨别要点：开始峰形整齐随后逐渐变乱，背景峰逐渐提高（一般报告组在出报告时会将变乱 不可信的峰形压低后删除不可信序列），与信号中断的区别在于信号衰减是峰形逐渐变乱， 而信号中断是在某一点后突然变乱。造成信号衰减的原因很多也很复杂，常见的原因是样品 质量差，序列结构问题，如果质粒和 PCR 产物，我们建议客户优化模板后重新提供；对于菌 液，我们将重新培养菌，重新抽提再次测序，减少操作原因。但即使这样，仍然不能保证一 定正常出结果。 解决方案：优化模板或者调整反应体系 上海实验室：上海市徐汇区银都路218号 聚科生物楼2号楼 201室 邮编：200231 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqsh@invitrogen.com 北京实验室：北京亦庄经济技术开发区荣昌东街7号隆盛工业园203 邮编：100088 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqbj@invitrogen.com 广州实验室：广州市海珠区新港东路2429号 海珠科技大楼 213室 邮编：510320 电话：800-820-8982-1-1 Email：seqgz@invitrogen.com 10. 引物合成是否有问题 见图 A 及图 B 图 A 图 B 这是一批实验中的不同克隆，正常引物序列应该是在 GAATTC 位点后以 CGATGT 开头，但图 B 中显示的克隆明显在 5’端缺少了一个 C。 此例说明：在引物区同样存在错配的可能。当然出现这样的情况后关键是如何明确问题的所 在。比较简单的方法是再挑选一个同批次的克隆进行测序。因为如果是 PCR 错配引起的这种 错误，那么必然是一个小概率事件，其联系出现于两个克隆上的几率就更是微乎其微。而如 果是引物上的问题，那么同样问题联系出现的概率就大很多。所以，新的克隆如果测序后发 现问题依旧，那么引物合成错误的可能更大，反之则是 PCR 过程出现问题