基因探针和PCR方法在菌痢流行病学研究中的应用

文章编号: 1002- 2694(2004) 12- 1062- 03 基因探针和 PCR方法在菌痢流行病学研究中的应用* 夏桂枝1,叶礼燕1,王 � 红2, 白石山3,俞守义2 摘 � 要:目的 � 探讨基因探针和 PCR 方法在 F2a志贺氏菌痢暴发的流行病学研究中的意义。方法 � 对 43 株自患者粪便 和食物中分离到的 F2a志贺氏菌进行 16srRNA、ip aH 基因 Southern 杂交, 随机 PCR 和 set1/ set 2毒力基因 PCR 分析。结果 � 随机 PCR、ip aH 基因 Sout hern 杂交将 43 株 F2a志贺氏菌分为两个不同的基因型, set1/ set2 毒力基因 PCR分为三个不同的基 因型, 16srRNA基因 Southern 杂交均为同一基因型。结论 � 基因分型方法能更准确、深入地揭示菌痢暴发过程中各分离株之 间的流行病学联系。其中 set1/ set2 毒力基因 PCR 方法具有较高的分辨率,在 F2a 志贺氏菌的分子流行病学研究中具有重要 的作用。 关键词:志贺氏菌; 基因探针;随机 PCR; 志贺氏肠毒素 � � 中图分类号: R181. 2 � 文献标识码: A Application of gene probe and PCR in the epidemiological studies of Shigellosis XIA Gui�zhi, YE Li�yan, WANG Hong , BAI Shi�shan, YU Shou�yi ( Depar tment of Pediatr ics , Fuzhou General H osp ital, Fuzhou 350025, China) ABSTRACT:To investigate the significance o f gene probe and PCR methods in the epidemiological studies of Shigellosis, 16srRNA and ip aH gene Sout hern hybridization, RAPD�PCR and Set1/ set2�PCR were performed in 43 strains of Shigella F2a iso� lated from stools of patients and from foods. It was found t hat t hese 43 isolates were subtyped into tw o genotypes by means of RAPD� PCR and ip aH gene Southern hybridization, but they were subtyped to three genotypes wit h Set1 / set2�PCR; on the other hand, t hey could not be subtyped by 16srRNA gene Southern hybr idization. It concludes that these genotypic methods of investigation can explor e the epidemiological relationship of isolates in a Shig ella F2a outbr eak accurately and profoundly , in w hich Set1 / set2�PCR has higher r esolving pow er , and is important in the molecular epidemio logy of Shigellosis outbreak, w hereas 16srRNA gene Southern hy� bridization has no resolving power, and is not suitable for the proper genotyping of Shigella F2a. KEY WORDS: Shig ella; Gene probe, RAPD�PCR ; Shigella enterotox in � � 痢疾杆菌是引起肠道传染病的主要病原之一, 每年均有不同程度的菌痢流行。在我国 B群福氏 2a菌型在志贺氏菌流行株中占绝对优势�1 。本文 应用 16srRNA、ip aH 基因 Southern杂交,随机 PCR 和 set1/ set2毒力基因 PCR方法对内蒙古呼和浩特 市发生的一起 F2a志贺氏菌痢暴发进行了分子流行 病学分析。 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下。 1 � 材料和方法 1. 1 � 材料 � 菌株: 43株 F2a 志贺氏菌系 1997年在 内蒙呼和浩特市某学校发生的一起菌痢暴发期间自 患者粪便和食堂残余食物中分离到的。 S . f lexneri 2a T 32、E . col i DH 5�为第一军医大学流行 病学教研室保存菌种,细菌按常规用 LB培养基培 养。试剂: T ris、SDS、限制性内切酶 Hind !、Dig 标 记试剂盒、PCR扩增系统、小分子量 DNA参照 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 购自宝灵曼公司, Taq酶、琼脂糖凝胶为上海复华公 司产品, dNTP、0. 45 �m 硝酸纤维素滤膜分别为 Serva公司、北京化工学校产品, 其余试剂均为国产 分析纯。 1. 2 � 方法 1. 2. 1 � 16srRNA基因 Southern杂交 � 参照文献�2 介绍的快速提取染色体 DNA 的方法提取染色体, 经 Hind !酶切, 琼脂糖凝胶电泳。采用 PCR方法 制备和标记探针。其中 16srRNA 基因扩增引物由 第一军医大学流行病学教研室提供, 预计扩增片段 为 554bp。S . f lexner i 2a T 32 DNA 粗制 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 的制 备采用文献�3 介绍的方法。取粗制模板 2 �l, 2 mmol/ L Dig�dNTP 5�l,引物 2�l, 10 ∀ PCR缓冲液 * 军队#九五∃指令性课题( 96L032) 作者单位: 1� 南京军区福州总医院儿科,福州 � 350025; 2� 广州第一军医大学流行病学教研室; 3� 呼和浩特市解放军第 253医院 1062 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 Chinese Journal of Zoonoses 2004, 20 ( 12) ( 4 mmol/ L Mg2+ ) 5 �l, Taq酶 2 �l, 去离子水 34�l。 采用 Biometra PCR仪, 94 % 1min、55 % 1 min、72 % 1. 5 m in, 循环 30 次后 72 % 延伸 5 m in。按照文 献�4 介绍的方法进行 Southern 转移和核酸分子杂 交。 1.2. 2 � ip aH 基因 Southern 杂交 � 按照文献�5 介 绍的碱变性法快速抽提质粒 DNA,经 Hind !酶切, 琼脂糖凝胶电泳。探针的制备和标记、Southern 转 移和核酸分子杂交方法同 16srRNA Southern杂交。 其中 ip aH 基因扩增引物由第一军医大学流行病学 教研室提供,预计扩增片段为 510bp。 1. 2. 3 � 随机 PCR方法 � 参照文献�6 推荐的引物序 列合成。粗制模板的制备采用文献�3 介绍的方法。 PCR扩增反应条件经反复优化, 最终反应条件为: 反应总体积 50�l,其中 10 ∀ PCR缓冲液( 4 mmol/ L M g2+ ) 5 �l, 4 mmol/ L dNTP10 �l,粗制模板DNA 10 �l,随机引物 3�l, Taq酶 2 �l,去离子水 20�l。采用 Biometra PCR 仪, 94 % 1 min、36 % 1 min、72 % 2 min,循环 30次后 72 % 延伸 7m in。 1. 2. 4 � set1/ set2毒力基因 PCR 分析 � 针对 set 1、 set2基因序列保守区设计合成, 预计扩增片段为 306 bp、530 bp。挑取单个菌落接种于 LB培养基, 37 % 振荡 3~ 4 h,取 5 �l菌液, 36 �l菌裂解液( 1 ∀ PCR 缓冲液、0. 5% NP- 40、0. 5% Tow een20) , 2 mmol/ L dNTP5 �l, 引物各 1�l,去离子水 3 �l,反应 总体积 50�l。采用 Biometra PCR仪, 94 % 1min、55 % 1 min、72 % 1 min,循环 30次后 72 % 延伸 5 min。 2 � 结 � � 果 2. 1 � 43株 F2a志贺氏菌经 16srRNA 基因 Southern 杂交分析均为一个基因型(图 1)。 2. 2 � 43株 F2a 志贺氏菌分离株的 ip aH 基因 Southern杂交分析结果为: M 9729 具有独特的谱 型,其余菌株图谱特征相同(图 2)。 2. 3 � 随机 PCR分析 � 将43株F2a志贺氏菌分离株分 为2型: M9738为1型,其余菌株为另1型(图 3)。 2. 4 � set1/ set2毒力基因 � PCR将所有菌株分为 3 种不同的基因型: M9705 set1 ( - ) / set2 ( + ) ; M 9704、M9723、M9729 set1( + ) / set 2( - ) ; 其余菌 株均为 set1( + ) / set2( + ) (图 4)。 2. 5 � 四种方法对43株 F2a 志贺氏菌进行分型的结 果( 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1)。 3 � 讨 � � 论 20世纪 80 年代以来, 随着分子生物学理论和 技术的迅速发展,多种分子生物学方法如质粒分析、 核酸分子杂交、PCR、多位点酶电泳等被应用于志贺 图 1 � 内蒙古分离株 16srRNA基因 Southern杂交分析 Figure� 1� 16srRNA gene Southern blot analysis of S. f lexneri 2a isolates A M9703 � B M9710 � C M9712 � D M9727 � E M9728 F M9729 � G M9736 � H F2a T32 图 2 � 内蒙古分离株 ipaH 基因 Southern杂交分析 Figure� 2� ipaH gene Southern blot analysis of S. f lexneri 2a isolates A M9703 � B M9710 � C M9712 � D M9727 � E M9728 � F M9729� G F2a T32 图 3 � 内蒙古分离株随机 PCR分析 Figure� 3� RAPD�PCR analysis of S. f lexneri 2a isolates A F2a T32 � B M9703 � C M9704 � D M9728 � E M9729 � F M9712 � G M9738 � H M9746 � I 100bp marker 10632004, 20 ( 12) 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 Chinese Journal of Zoonoses 图 4� 内蒙古分离株 set1/ set 2 毒力基因 PCR分析 Figure� 4 � set1/ set 2�PCR analysis of S. f lexneri 2a isolates A 100bp marker � B E . coli DH5a � C M9703 � D M9710 � E M9705 � F M9729 � G M9723 � H M9704� I F2a T32 表 1� 43 株 F2a 志贺氏菌的分型结果 Table 1 � The genetype result of 43 S. f lexneri 2a isolates 分型方法 各型代表株 株数 16srRNA基因 Southern 杂交 ip aH 基因 Southern 杂交 随机 PCR分析 set1/ set 2毒力基因 PCR 分析 M9703 M9703 M9729 M9703 M9738 M9703 ( set1+ / set2+ ) M9704 ( set1+ / set2- ) M9705 ( set1- / set2+ ) 43 42 1 42 1 39 3 1 氏菌痢的流行病学研究�7- 8 。为菌痢流行株的同 源性鉴定提供了重要依据, 解决了部分传统流行病 学鉴定方法所不能解决的问题。 核酸分子杂交是利用 DNA 碱基配对的原理特 异地鉴定已知片段的核酸序列组成,可更为精确、直 接地鉴定各菌株间的同源关系。本文选用 F2a志贺 氏菌的 16srRNA基因和 ip aH 基因(编码侵袭质粒 抗原 H)作为探针进行 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 。其中 16srRNA基因存 在于志贺氏菌的染色体内, 在细菌的进化和分化过 程中高度稳定, 其变异率较低。ip aH 基因存在于志 贺氏菌毒力大质粒中, 为染色体外的 DNA, 具有基 因片段的多态性。 随机 PCR方法是利用随机引物扩增未知序列 的染色体 DNA, 通过比较扩增产物的多态性鉴定染 色体 DNA 的差异,它弥补了标准 PCR 方法只能应 用于已知 DNA 序列的不足。但它扩增的是染色体 的 DNA,忽略了染色体外的遗传信息即质粒 DNA。 志贺氏肠毒素1( Shigella enterotox in 1, ShET1) 和志贺氏肠毒素 2( Shigella enterotox in 2, ShET 2)是 两种新发现的毒素。ShET1 是一个由染色体编码 的分子量为 55 kDa的蛋白质,其编码基因 set1主要 存在于 F2a志贺氏菌中; ShET2是一个由毒力大质 粒编码的分子量为 62. 8kDa的蛋白质, 其编码基因 set 2在 EIEC及 80%以上各血清型的志贺氏菌中普 遍存在�9- 10 。因此,不同来源的志贺氏菌可能存在 set 1/ set 2毒力基因分布的多样性。 四种分型方法的鉴定结果: 43 株 F2a 志贺氏菌 分离株中基因型完全相同的菌株 38株,占所有菌株 的 88. 37% ,提示其为本次菌痢暴发的流行株。其 中从残余食物中分离的菌株 M9707基因型与流行 株相同, 说明本次暴发由污染的食物引起。基因型 不同的菌株中 M9729的 ip aH 基因 Southern 杂交 图谱, M 9738 的随机 PCR 图谱, M 9704、M9705、 M9723、M9729 的 set1/ set2 毒力基因 PCR 图谱与 流行株存在明显差异, 为本次暴发同时出现的散发 株。由此可见基因探针和 PCR分型方法提供了较 血清学分型更特异和敏感的检测手段, 能更准确地 揭示菌痢暴发过程中各菌株之间的内在联系。 四种分型方法相比较, ip aH 基因 Southern 杂 交、随机 PCR方法将所有菌株分为 2个基因型, 各 鉴定出 1株散发株, set 1/ set 2毒力基因 PCR方法将 所有菌株分为 3个基因型, 鉴定出 4株散发株。而 16srRNA基因 Southern 杂交分析不能区分不同基 因型。可以看出在 F2a 志贺氏菌的基因分型中 set 1/ set 2毒力基因 PCR方法具有更高的分辨率,应 作为 F2a志贺氏菌基因分型不可缺少的分析方法。 16srRNA基因 Southern杂交分析不具有分辨效率, 可能不适合 F2a志贺氏菌的基因分型。同时我们看 到,三种方法鉴别出的散发株有交叉现象,但不完全 重合,说明不同的基因分型方法从不同的角度揭示 不同来源菌株间的遗传学差异, 具有局限性和片面 性,只有多种方法、多种分子生物学标志结合,才能 更准确和全面。 参考文献: �1 陈秀英.志贺氏菌的检测报告�J . 疾病监测杂志, 2002, 17 ( 3 ) : 115- 116� �2 Preston MA, Borezyk AA. 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DNA f ingerprint ing of crude bacterial lysates using degenerate RAPD primers PCR�J , Methods and Applicat ions, 1995, 5( 4) : 265- 268� (下转第 1067页) 1064 中 国 人 兽 共 患 病 杂 志 Chinese Journal of Zoonoses 2004, 20 ( 12) 表 3� 重组主要外膜蛋白疫苗的攻毒保护 Table. 3 � The pathological index and protestion rate after challenged with vivid Cps 项目 数量 病变指数肺脏 气囊 保护比例 试验组 10 0. 4 & 0. 2* * 0. 2 & 0. 1* 8/ 10 对照组 10 3. 9 & 1. 2 1. 3 & 0. 7 1/ 10 3 � 讨 � � 论 研究表明 r�MOMP 是鹦鹉热衣原体的重要保 护性抗原,并且不同来源的 Cp s 的 r�MOMP 基因有 同源性, 因此使用 r�MOMP 预防 Cps 感染, 研制高 效基因工程疫苗已成为预防衣原体感染的最佳途 径。Coveninir 等通过免疫免疫印记和免疫荧光实 验证明, r�MOMP 氨基端参与体液免疫应答�7 。朱 虹等观察 r�MOMP 免疫小鼠效果证实小鼠获得了 较高的体液免疫应答和细胞免疫应答�8 。本实验 结果也证实免疫肉鸡后抗体效价可达 4. 2~ 5. 0 ( lg2) ,可以持续到肉鸡出栏。 由于活化的 T 细胞增殖反应的检测可反映 T 淋巴细胞群体的反应能力及免疫功能, 通过测定细 胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖的方法 ( MTT 法)。本试验以丝裂原 ConA 为阳性对照, 发 现 r�MOMP 能够诱导肉鸡全血淋巴细胞免疫反应, 且在免疫期内增殖指数呈时间依赖性, 免疫后 30d 均达到较高水平。本试验结果与使用 r�MOMP 免 疫小鼠可激发小鼠的细胞免疫应答的结论相一 致�8 。 虽然 r�MOMP 免疫后肉鸡出现较好的免疫应 答水平,并不能完全代表疫苗的保护水平,因此使用 外源强毒株的攻击是考察疫苗保护水平的一个重要 指标。本试验显示使用野外分离株攻击后,免疫组 无论从临床症状, 病变指数,还是保护方面都优于对 照组,充分显示 r�MOMP 具有良好的免疫保护效 果。由于目前肉鸡感染 Cp s 后造成肉鸡呼吸困难、 采食量下降、死亡率升高,给肉鸡产业带来巨大的经 济损失�9 。因此本研究结果表明 r�MOMP 免疫肉 鸡后较好的细胞免疫和体液免疫效果, 无疑为保护 肉鸡免受 Cp s 的侵害提供了一个新的防治途径。 参考文献: �1 Herring AJ. 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