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制备型高效液相色谱.pdf

制备型高效液相色谱

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2013-10-12 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《制备型高效液相色谱pdf》,可适用于高等教育领域

第十二章制备型高效液相色谱UnRegistered在生物制药中的应用•基因工程药物:白细胞介素、胰岛素。•天然产物:蛋白质,多肽,多糖。UnRegistered第一节高效液相色谱法简介液相色谱的发展史•年色谱法问世俄国植物学家茨维特年月日大会报告“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”年在德国植物学杂志发表文章首次命名上述分离后色带为色谱图称此方法为色谱法•年库恩(Kuhn)分离胡萝卜素年Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B获得了年的诺贝尔化学奖。•年马丁(Martin)和辛格(Synge)提出液液分配色谱法年度的诺贝尔奖。•年代末年代初高效液相色谱仪的成功研制UnRegistered基本仪器装置•输液系统•进样系统•分离系统•检测系统•数据处理系统UnRegisteredUnRegistered高效液相色谱仪组成输液系统()高压输液泵作用:将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。高压输液泵在线脱气装置UnRegistered()高压输液泵UnRegistered()在线脱气装置作用:脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。在线脱气、超声脱气、真空脱气等脱气不好时有气泡导致流动相流速不稳定造成基线飘移噪音增加。PressureDampersO,N,CO…UnRegistered()梯度洗脱装置Isocraticelution恒定组成的单一溶剂体系Gradientelution以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗目的是分离多组容量因子相差较大的组分HighPressureMixingUnRegistered进样系统六通阀UnRegistered色谱柱Normalcolumnmm、mmNarrowborecolumnmmMicrocolumn<mm色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。UnRegistered色谱柱填料sphericalandirregularsilicaparticlesMacroporoussphericalsilicaparticleKKUnger,Poroussilica,Elsevier,基质:载体或担体。数mm~数十mm球形。硅胶或有机高分子聚合物UnRegisteredPellicularparticlePorousparticlemmmmmmUnRegistered色谱柱填料功能层:物理吸附或化学键合UnRegistered三、高效液相色谱法的特点•采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器,从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。•和经典液相相比有以下优点:快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高等。UnRegistered四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别•流速不同•检测池不同•上样量不同•色谱柱不同UnRegistered五、色谱的基本理论及有关参数两大理论:•塔板理论(theplatemodel):阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成相似于精馏过程色谱分离也是一个分配平衡过程N=(tRwb)N=(tRw)•速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。H=ACuUnRegistered有关参数•分离度:在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下,分离度大于时称分离完全只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。在色谱分析中要求:两组分的保留值差别要足够大。两色谱峰要足够窄。待测组分的分离度要足够大分离过程要尽可能短)()(WWttWWttRrrrr==UnRegistered•容量因子:溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。•选择因子:两组分容量因子的比值•容量因子、选择因子、理论塔板数对分离度的影响tttkR=¢kk¢¢=a))((NkkR¢¢=aaUnRegistered六、制备型高效液相色谱的重要参数Capacity:纯化过程中目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。Recovery:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。Resolution:在纯化的最后阶段此项很关键尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。UnRegistered七、分离机理和色谱类型分离蛋白质类物质时的分离依据:疏水性分子大小等电点结构特异性UnRegistered色谱介质按分离机理分为正相色谱反相色谱:常加入TFA离子交换色谱:阴离子交换色谱(DEAE二乙基氨基乙基Q季胺盐)阳离子交换色谱(CM羧甲基S磺酸基)凝胶过滤色谱疏水色谱:苯基辛基等。金属螯合色谱:镍、铜等亲合色谱UnRegistered第二节分离方案的设计•Whatistheintendeduseoftheproduct•Whatkindofstartingmaterialisavailableandhowshoulditbehandled•Whatarethepurityissuesinrelationtothesourcematerialandintendeduseofthefinalproduct•Whathastoberemoved•Whatmustberemovedcompletely•Whatwillbethefinalscaleofpuridication•WhataretheeconomicalconstraintsandwhatresourcesandequipmentareavailableUnRegistered一、分离方法之间的组合四步纯化法:Preparation:Capture:(Isolate,concentrateandstabilize)Intermediatepurification:(Removebulkimpurities)Polishing:(Achievefinalhighlevelpurity)UnRegistered•色谱之间的组合方案•AC、GF、IEX、HICUnRegistered二、分离条件的优化合适的溶剂强度:容量因子k’足够的柱效N:良好的分离选择性α:UnRegistered当柱过载时:N和k’都随样品负荷的增加而迅速地减小流速对于塔板数N的影响大大地降低通过增加柱长来有效地提高柱效不宜通过降低柱压(或流速)来达此目的UnRegisteredUnRegisteredUnRegistered制备分离的两种途径:第一种基本上同于分析型进样量不过载利用大内径的柱通过调整分离方程中的有关参数来达到分离的最佳化。在该法中往往利用小颗粒的填料(约μm)来制取少量价值高而难分离的物质。第二种使用大粒度填料(~μm)的大内径柱在过载情况下制备相对大量的纯物质。当α值相当大时(例如>)提高洗脱液的流速并不至于严重降低分离度从而大大缩短分离时间。UnRegistered三、制备型高效液相色谱常见问题及解决办法•待分离成分呈单一主峰•不易分开的两组分•目的组分含量少UnRegistered•待分离成分呈单一主峰UnRegistered•不易分开的两组分UnRegistered•目的组分含量少UnRegistered第三节实验条件的选择•色谱柱的选择与填装•柱填料•流动相选择•检测器的选择•仪器设备UnRegistered一、柱的选择和装填柱:•不锈钢柱:kg生物适应性差•玻璃柱:~kg•聚合物柱:装填:•当粒度小于µm用较大的匀浆罐湿法填装。粒度大于µm时利用轻敲柱外壁的干填法UnRegistered二、柱填料•硅胶:•葡聚糖和琼脂糖:•高分子聚合物:UnRegistered•颗粒大小UnRegistered•在α很小的分离制备中要求较高的N值宜用小粒度的填装柱。•当α很大时用大颗粒填装柱对过载进样是有好处。UnRegistered三、洗脱剂•可利用相同填料的分析柱选择最适合于分离目的和要求的流动相的组成(如溶剂的配比离子强度pH等)将其直接或略加修改后用于制备分离•一般不采用梯度洗脱•选择合适的溶剂溶解样品•采用色谱纯的试剂UnRegistered四、仪器设备•对泵的精密度和准确度要求不高(~mLmin)•对检测器的高灵敏要求不高•流路系统尽可能用惰性聚合材料•柱外效应试验结果影响较小UnRegistered第四节操作变量的确定一、样品的进样量•宜注射低浓度大体积的样品不宜注射高浓度小体积的样品。•样品进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和固定相的类型、样品的溶解性以及分离目的有关。UnRegistered柱内径mm困难的分离(α<)mg容易的分离(α>)mg~~~~~~UnRegistered二、制备产率•·产率随分离度的提高而增加。•·不过载的柱子k’值较小时产率较高。•·用全孔填料时产率高于用薄壳型的。•·对于α值小的分离宜利用小粒度(~μm)填料的柱子在α较大时使用较大颗粒、大内径的柱将获得较高的产率且价格便宜。•·柱的样品容量和产率随柱横截面积的增加而增大。•产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。UnRegistered三、回收率计算和纯度鉴定•除去组分中的溶剂:热的氮气流吹真空旋转蒸发冷冻干燥。•纯度:HPLCTCL。•回收率:重量活性。UnRegistered蛇毒中溶栓组分的分离UnRegisteredUnRegistered制备型高效液相色谱的应用•肽的分离•蛋白质的分离•多糖的分离•核酸的分离UnRegistered肽的分离:常用方法为反相色谱和离子交换色谱肽的保留时间可用氨基酸的保留常数之和预测。反相色谱分为:缓冲液反相色谱离子对反相色谱。肽的检测:UV~nm荧光检测。UnRegistered蛋白质的分离.填料:孔径~.流动相()pH低pH使蛋白质羧基解离受到抑制极性降低与反相键合相的作用强。对大多蛋白质而言使用pH~的流动相可以得到最好的分离。UnRegistered()离子强度和离子对试剂增加离子强度增加了蛋白质与键合相的疏水作用较高的离子强度(>)可使蛋白质有较好的分辨率和回收率。缓冲液中的盐还能通过形成离子对改变蛋白质分子表面极性。反离子是疏水的(如三氟乙酸根、七氟丁酸根)复合离子对保留时间增长。如果反离子是亲水的(如磷酸根、甲酸根)则复合离子对保留时间减少。UnRegistered•()有机溶剂•有机溶剂的选择是改变蛋白质保留性的重要手段之一。较常用的有乙腈和丙醇。•使用复合溶剂(如异丙醇乙醇、乙腈异丙醇等)可降低有机溶剂总浓度并改善分辨率及回收率。UnRegistered•()表面活性剂两性离子表面活性剂可以减少高分子量、疏水性较强的蛋白质的拖尾使分离得以改善。•()温度为了防止蛋白质的不可逆变性和失活分离一般在室温或低温下进行。UnRegistered三、多糖的分离分离:高效体积排阻色谱检测:常用示差折射仪(RI)UnRegistered示差折射检测器通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质的通用性质示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定其检测限可达(~)gmL。由于折射率对温度的变化非常灵敏大多数溶剂折射率的温度系数越为×因此检测器必须恒温才能获得精确的结果。折射检测器的灵敏度较低不能用于梯度洗脱。UnRegistered四、核酸与核苷酸的分离五、脂类的分离UnRegistered

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