红茶菌混合菌种的分离与鉴定

55※基础研究 食品科学 2004, Vol. 25, No. 4 表3 不同金属离子对P-99细胞生长与产乳链菌肽的影响 金属离子 无金属离子 Mg2+ Ca2+ Cu2+ Mn2+ Zn2+ Fe2+ OD600 0.716 0.699 0.687 0.061 0.824 0.455 0.526 效价(IU/ml) 1889 1941 1808 32 2025 1541 1763 示，第8～18h 为菌体生长对数期，效价迅速增加；此 后菌体生长和产物形成进入稳定期。由此可见，P-99菌 株发酵呈现明显的初级代谢动力学特征，可用Logistic 方程和Luedeking-Piret模型分别对菌体细胞生长(ODx)和 产物(P)形成动力学进行模拟[6]，得菌体细胞生长动力学 方程为：㏑(ODx/(0.836－ODx))=0.464t－5.034，r=0.9499； 产物乳链菌肽形成动力学方程为：㏑((P+101.694)/(2107. 87－P))=0.464t－5.034，r=0.9964。 下发酵良好，通气量和Ca2+、Zn2+、Fe2+等对金属离 子对其细胞生长与乳链菌肽的产生无明显影响，但Mn2+对 乳链菌肽的产生有促进作用，而Cu2+则有较强的抑制作 用；在含1%蔗糖的M17培养基，该菌株产乳链菌肽表 现出初级代谢动力学特征，其菌体生长动力学方程为： ㏑(ODx/(0.836－ODx))=0.464t－5.034，r=0.9499； 产物生成动力学方程为： ㏑((P+101.694)/(2107.87－P))=0.464t－5.034, r=0.9964。 参考文献： [1]Delves-broughton J. Nisin and its uses as a food preservative [J]. Food Technol,1990,44:100-117. [2]中华人民共和国卫生部.中国食品添加剂[M].1994.36. [3]Terzaghi B E, Sandine W E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages[J]. Appl Microbiol, 1975,29:807-809. [4]彭沈军,李东,孙健.生物食品防腐剂乳酸链球菌素菌种筛 选与鉴定[J].中国食品添加剂,1995,(3):6-9. [5]吴琼.乳链菌肽效价测定方法的研究[J].食品科学,1996, (6):56-59. [6]熊宗贵.发酵工艺原理[M].北京:中国医药科技出版社, 2001.170-171. 3 小 结 本文从鲜奶中筛选到一株乳链菌肽产生菌——乳链 球菌P-99，该菌株在M17培养基、30℃、pH6.5条件 红茶菌混合菌种的分离与鉴定 吴 薇，盖宝川，籍保平* (中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083) 摘 要：本文对来自北京的某个红茶菌进行了菌种分离和鉴定，作者从该红茶菌中分离得到了五个菌种，经鉴定 分别为巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus Hansen)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Lindner)、醋化 醋杆菌木质亚种(Acetobacter xylinum)、甲醇酸单胞菌(Acidomonas methanolica)、乳杆菌科乳杆菌属(Lactobacillus)。 关键词：红茶菌；菌种分离；菌种鉴定 Study on the Isolation and Identifiation of Microbes of Kombucha WU Wei，GAI Bao-chuan，JI Bao-ping* (College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agriculture University, Beijing 100083, China) Abstract ：This paper introduced the isolation and identification of microorganisms from a kind of Kombucha. There were five 收稿日期：2003-10-15 *通讯联系人 作者简介：吴薇(1970-)，讲师，硕士，研究方向为农产品加工与贮藏工程。 2004, Vol. 25, No. 4 食品科学 ※基础研究56 strains been isolated and they separately were Saccharomyces pastonanus Hansen, Schizosaccharomyces pombe Lindner, Acetobacter xylinum, Acidomonas methanolica and Lactobacillus. Key words：Kombucha；strainlsolation；strain idenfication 中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2004)04-0055-04 红茶菌是有着悠久历史的一种民间传统酸性饮料。 它是以糖茶水为原料，经醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多 种微生物共同发酵而成的。用于发酵培养红茶菌的菌种 主要是醋酸菌和酵母菌，有的红茶菌有少量乳酸菌。根 据外国文献报道，到目前为止，人们从各种红茶菌中分 离到的醋酸菌有：木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、拟木 醋杆菌(Acetobacter xylinoides)、葡萄糖酸杆菌(Bacterium gluconicum)、产酮醋杆菌(Acetobacter ketogenum)、弱 氧化醋酸菌(Acetobacter suboxydans)、葡萄糖醋酸菌 (Gluconobacter liquefaciens)、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)和巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，其中最主 要的是木醋杆菌。酵母菌有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、不显酵母(Saccharomyces inconspicus)、路 德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、热带假丝酵母(Candida tropicans)，克鲁斯假丝酵母(Candida crusei)、汉逊德巴 利酵母(debaryomyces hansenii)、酒香酵母 (Brettanyomyces)、克勒克酵母(Kloeckera)、拜耳接合酵 母(Zygosaccharomyces bailii)等[1,2]。乳酸菌在某些红茶菌 中存在，但它不是培养红茶菌的必需菌种且含量很小， 主要有保加利亚乳杆菌(Lactobacterium bulagricum)等。 近十多年来，红茶菌在欧美一些国家和地区甚为流 行，对红茶菌各种保健功能的研究也是方兴未艾，特 别是它的解毒抗癌和增强机体免疫力等功能备受关注， 越来越多的资料表明红茶菌是一种很有利用价值的天然 微生物发酵产品[3～5]。但是，自古至今，红茶菌一直 是以家庭培养为主，由于受到家庭中接种条件及培养温 度等条件的影响，容易受到杂菌污染，很难控制产品 的质量，从而影响了对它的充分开发利用。而实现工 业化生产不仅可以避免杂菌污染，还可有效地控制产品 的质量。虽然红茶菌有多种保健作用，但古今中外， 它都是以混合菌种家庭培养的方式被应用和流传的，而 这样的方式存在种种不利因素，从而限制了它的应用和 发展。首先是受到接种条件的影响，容易造成杂菌污 染。其次还受到温度气候的影响，如室温过低不仅要 延长培养时间，也容易造成污染。混合菌种的保存也 存在问题，如保存时间短，菌种活力下降，杂菌污染 等等。另外，不同菌种其各种代谢产物的含量不同， 有不同需要的人如果都饮用同一种成分的红茶菌，往往 会造成有的人效果很好，而有的人则收效不明显的结 果。为避免以上不利因素的影响，应在深入研究的基 础上，实现工业化生产，生产出卫生优质，功能性成 分含量高，适合各种人群需要的系列产品，充分发挥 它的保健作用。 要研究开发功能性茶菌饮料，实现工业化生产， 首先要从现有的红茶菌中分离得到各个纯菌种并了解菌 种的分类地位，只有得到了纯菌种，才能解决菌种保 存时间、接种量控制、杂菌控制、保持菌种活力和控 制产品质量等多方面的问题，才有可能对每一个菌种以 及它们的各种组合的各种代谢特征、培养条件、培养 液成分和可能的功能效果等方面进行深入细致的研究。 这是进一步研究和应用的基础。而目前在国内尚未见到 对红茶菌混合菌种进行分离且详细鉴定的报道，本文针 对外购的红茶菌混合菌种进行分类鉴定，为进一步的研 究和应用奠定基础。 1 菌种的分离 1.1菌种分离用培养基 1.1.1菌种 红茶菌混合菌种，购自北京某食品研究所。 1.1.2分离用培养基 1.1.2.1酵母菌培养基 Y1号：12Brix麦芽汁1000ml，琼脂15～20g。 Y2号：麦芽膏20g，琼脂20g，自来水1000ml。 1.1.2.2醋酸菌培养基 A1号：匍萄糖100g，酵母浸出物10g，碳酸钙 20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH6.8。 A2号：3Brix麦芽汁100ml，酵母浸出物0.5g，葡萄 糖2g，K2HPO4 0.3g，琼脂2g，于113～115℃，20min灭 菌后加入95%的乙醇，使培养基中乙醇的浓度为2%～3%。 1.1.2.3乳酸菌培养基 L1号(番茄汁聚胨培养基，分离乳杆菌)：聚蛋白 胨5g，葡萄糖10g，酵母浸膏5g，罐头番茄汁150ml， 溴甲酚绿0.03g，山梨酸1.2g，CaCl2·2H2O 0.12g，NaCl 0.12g，KH2PO4 0.5g，KCl 0.12g，MgSO4·7H2O 0.12g，MnSO4·4H2O 0.12g，琼脂15g，蒸馏水850ml， pH 5.0。 L2号(GYP培养基，分离芽泡乳杆菌)：葡萄糖20g， 酵母提取物5g，蛋白胨5g，琼脂15g，蒸馏水1L。 L3号(HP培养基，分离明串珠菌)：植物蛋白胨 20.0g，酵母提取物6.0g，肉浸膏10.0g，FeSO4·7H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖10g，吐温80 0.5g， 57※基础研究 食品科学 2004, Vol. 25, No. 4 MnSO4·4H2O 0.05g，柠檬酸铵5.0g，蒸馏水1L。 L4号(MRS培养基，分离乳杆菌)：蛋白胨10.0g， 酵母提取物5.0g，肉浸膏10.0g，吐温80 1ml，葡萄糖 20.0g，K2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4· 4H2O 0.25g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，蒸馏水 1L，调pH6.2～6.4。 1.2试验方法 菌种分离方法：将已活化的红茶菌混合菌种振荡混 匀，吸10m1菌液并夹取一小块菌膜入带玻璃珠的90ml 无菌水中，充分振荡，使溶液混匀。后吸取5m1入45m1 无菌水中，依次稀释成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6， 之后分别吸后3个稀释度的菌液各0.1ml到不同的分离培 养基中，用刮刀涂匀。每个稀释度重复3次。醋酸菌 和乳酸菌培养基于30℃培养，酵母菌培养基于28℃培 养。观察生长情况，镜检初筛。 产膜醋酸菌的分离：将已活化的混合菌种适量接入 茶糖水(红茶3%+蔗糖20%)中，30℃静止培养，待其表 面长出菌膜后，在菌膜上放置一至两块无菌滤纸后继续 培养，2d后取出滤纸，接入醋酸菌培养基平板上，30 ℃培养。一周后，平板上出现菌膜。将菌膜挑入有玻 璃珠的无菌水中振荡破碎，并逐级稀释，后涂平板分 离。30℃培养6d后，将稀释平板上出现的透明区域(醋 酸菌产生的乙酸与碳酸钙反应生成可溶性的乙酸钙)上的几 种菌落分别挑单菌落入醋酸菌液体培养基中30℃培养， 3～4d后观察，表面出现白色菌膜的即为产膜醋酸菌。 1.3试验结果 从混合菌种中共分离得到5株菌种，它们分别是： 两株酵母菌，代号分别为Y11和Y13；一株产膜的醋酸 菌，代号为M；一株不产膜的醋酸菌，代号为A22； 一株乳酸菌，代号为L11。 2 菌种的鉴定 2.1菌种鉴定用培养基 2.1.1菌种培养基 Y1号培养基(Y11和Y13用)，A1 号培养基(M和A22用)，MRS培养基(L11用)。 2.1.2醋酸钠培养基 葡萄糖0.062g，膘0.25g，醋酸 钠(三结晶水)0.5g，琼脂2.0g，蒸馏水100ml。 2.1.3硝酸盐利用培养基 无氮合成培养基100ml(葡萄 糖2%，豆芽汁0.5ml，KH2PO4 0.l%，MgSO4·7H2O 0.07%，琼脂2%)，硝酸钾0.1%。 2.1.4糖类发酵培养基 酵母浸粉0.5%，葡萄糖，半 乳糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，棉子糖各1 0 %。 2.1.5乙醇氧化和乙酸氧化测定用培养基 酵母膏1%， 碳酸钙1%，自来水100ml，琼脂2%，乙醇2%。 2.1.6碳源利用基础培养基 MgSO4·7H2O 0.2g， (NH4)2SO4 2.0g，NaH2PO4·H2O 0.5g，K2HPO4 0.5g， CaCl2·2H2O 0.19，蒸馏水1000m1。 2.1.7硫化氢测定用培养基 胰蛋白东10g，NaCl 5g， 牛肉膏10g，酵母提取物5g，半胱氨酸0.4g，葡萄糖 2g，蒸馏水1000ml。 2.1.8乳酸测定用培养基 MRS培养基。 2.2试剂与试纸 氧化酶试纸(1%盐酸二甲基对苯撑二胺)；2.3%～ 10%的过氧化氢；硫化氢测定用乙酸铅试纸(50～100g/L 的乙酸铅)；乳酸测定用展开剂：水:苯甲醉:正丁醇以1: 5:5的量相混合，然后加1%的甲酸；乳酸测定用显色 剂：0.04%的溴酚蓝乙醇溶液，用0.1N的NaOH调pH 到6.7。 2.3测定与鉴定方法[6～8] 革兰氏鉴别染色法；酵母的子囊孢子观察方法； 硝酸盐利用情况的测定方法；糖类发酵情况的测定方 法；氧化酶测定；接触酶测定；乙醇氧化和乙酸氧化 测定；乙醇为唯一碳源的测定；从葡萄糖产乳酸测定 (纸层析法)；产H2S的测定。 2.4鉴定结果 Y11的形态及生理生化特征是：典型酵母状的细 胞，子囊孢子不呈针形，子囊含孢子1～4个。无性繁 殖出芽式，出芽多边发生，不常形成假菌丝。孢子圆 形或卵形，发酵力强，不能利用硝酸盐。发酵葡萄糖、 蔗糖、麦芽糖和2/3棉子糖。以上特征根据《真菌鉴 定 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 》[9]，将Y11鉴定为巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus Hansen)。 Y13的形态及生理生化特征是：圆柱状的营养细 胞，(6～16)×(3～5)μm。子囊孢子不呈针形，子囊含 孢子1～4个。子囊孢子圆形，光滑，直径2～2.5μm。 无性繁殖裂殖式。以上特征根据《真菌鉴定手册》[9]， 将Y13鉴定为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Lindner)。 M的形态及生理生化特征是：好氧革兰氏阴性杆 菌，从葡萄糖产酸，从乙醇产乙酸，能产生纤维素膜， 不能以乙醇作为唯一碳源生长，以上特征根据《伯杰 细菌鉴定手册》[10]，将M鉴定为醋化醋杆菌木质亚种 (Acetobacter xylinum)。 A22的形态及生理生化特征是：好氧革兰氏阴性杆 菌，从葡萄糖产酸，能氧化乙醇到乙酸，能氧化乙酸 到二氧化碳和水，氧化酶阳性，接触酶阳性，以上特 征根据《常用细菌系统鉴定手册》[11]，将A22鉴定为 甲醇酸单胞菌(Acidomonas mnethanolica)。 L11的形态及生理生化特征是：革兰氏阳性杆菌， 2004, Vol. 25, No. 4 食品科学 ※基础研究58 从葡萄糖产乳酸，细胞杆状，细胞内不形成内生芽孢， 兼性厌氧，接触酶阴性，不产生H2S，在pH4.5生长。 以上特征根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[8]，L11 属于乳杆菌科乳杆菌属(Lactobacillus)。 3 讨 论 木实验的结果与国外文献报道的内容相一致，红茶 菌菌种都是由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌三类组成，只 是在个别具体菌种上有所不同。 参考文献： [1]R L de Silva T V Saravanpavan.Tea Cider-A potential winner [J].Tea Quarterly,1968,39(3):37-41. [2] C H Liu,W H Hsu, et al.The isolation and identification of microbes from a fermented tea beverage,Haipao,and their interations during Haipao fermentation[J]. Food Microbiology, 1996,13:407-415. [3] Gunther W Frank.The Kombucha Journal,http://www. kombu.de/index.htm. [4]Michael R Roussin. Analyses of Kombucha ferments: re- port on growers, http://persweb.direct.ca/chaugen/kombucha- research-mroussin2toc.html. [5]Biljana Bauer-Petrovska, Lidija Petrushevska-Tozl. Mineral and water soluble vitamin content the Kombucha drink[J]. International Journal of Food Science and Technology,2000, 35:201-205. [6]陈思云,萧熙佩.酵线营长的生物化学[M].山东科学技术 出版社,1990. [7]葛健,王正祥.工业微生物实验技术手册[M].中国轻工业 出版社,1994. [8]凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].中国 轻工业出版社,1999. [9]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海科学技术出版社,1979. [10]王惠军.伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M].科学出版社, 1984. [11]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].科学出版社, 2001. 微射流均质机的流体动力学行为 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 刘成梅，刘 伟，高荫榆，Roger Ruan，林向阳，陈 钢 (南昌大学 食品科学教育部重点实验室，江西 南昌 330047) 摘 要：本文将射流均质机振荡头内部孔道分成六个部分：进料管区、分流管区、撞击管区、射流管区、扩流 管区和出料管区，对其流场的动力学行为进行了分析，这为讨论射流均质机的超微粉碎的作用机制提供理论基础。 关键词：射流均质机；振荡头；流体动力学；超微粉碎 Analysis on Fluid Dynamic Behavior in High Velcocity Jet Homogenizer LIU Cheng-mei，LIU Wei，GAO Yin-yu，Roger Ruan，LIN Xiang-yang，CHEN Gang (The Key Laboratory of Food Science of MOE, Nanchang University, Nanchang 330047, China) Abstract ：The microchannel of interaction chamber was divided into six areas: feeding zone, fluid separation zone, impinging zone, compel jet zone, outspreading zone and discharging zone. Fluid dynamics behaviour of high velcocity jet homogenizer was analysed. It was useful to discuss the reaction mechanisms of ultramicro-pulverization in jet homogenizer. Key words：jet homogenizer；interaction channel；fluid dynamics；ultramicro-pulverization 中图分类号：TS201.7 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2004)04-0058-05 收稿日期：2003-10-08 作者简介：刘成梅(1963-)，男，教授，研究方向为食品科学工程。