感染性腹泻诊断标准(申报)

C59 WS 中华人民共和国卫生行业 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 WS ×××－2005 ------------------------------------------------------------------------------------------------- 感染性腹泻诊断标准 Diagnostic criteria for infectious diarrhea （报批稿） 2005－××－×× 发布 2005－××－××实施 中华人民共和国卫生部 发 布 WS ×××－2005 前　　　言 本标准是在GB17012-1997《感染性腹泻的诊断标准及处理原则》的基础上制定的, GB17012-1997作废.。 本标准的附录附录A是规范性附录，B是资料性附录。 本标准由全国传染病标准委员会提出。 本标准由中华人民共和国卫生部批准。 本标准起草单位：江苏省疾病预防控制中心及江苏省人民医院、南京市第二人民医院、中国疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：汪华、阚飙、方肇寅、冉陆、赵 伟、李 军、朱凤才、史智扬、顾 玲、郭喜玲、张雪峰。 WSXXX―2005 感染性腹泻诊断标准 １.范围 本标准规定了除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒以外的感染性腹泻的诊断标准。 2.术语和定义 2．1腹泻（diarrhea）：是指每日排便3次或以上，且粪便性状异常，如稀便、水样便，粘液便、脓血便或血便等。 2．2感染性腹泻（infectious diarrhea）：指由病原微生物及其产物或寄生虫所引起的、以腹泻为主要临床特征的一组肠道传染病。引起感染性腹泻的病原体繁多，其中主要的病原及其引起的感染性腹泻病的流行病学和临床特征参见附录B。 3.诊断依据 3.1 流行病学史 全年均可发病，但具有明显季节高峰，发病高峰季节常随地区和病原体的不同而异；细菌性腹泻一般夏秋季节多发，而病毒感染性腹泻、小肠结肠炎耶尔森菌腹泻等则秋冬季节发病较多。发病者常有不洁饮食（水）和/或与腹泻病人、病原携带者、腹泻动物、带菌动物接触史，或有流行地区居住或旅行史；需排除致泻性的过敏原、化学药品暴露史及症状性、器官功能失调等非感染性腹泻病史。食（水）源性感染常为集体发病并有共进可疑食物（水）史；某些沙门菌（如鼠伤寒沙门菌）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、A组轮状病毒和柯萨奇病毒感染可在婴儿群体中引起爆发流行。 3.2 临床表现 3.2.1 每日大便次数≥3次，粪便性状异常，可为稀便、水样便，粘液便、脓血便或血便，可伴有恶心、呕吐、腹痛、发热、食欲不振及全身不适。病情严重者，常并发脱水、酸中毒、电解质紊乱、休克等，甚至危及生命。 3.2.2 已排除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒。 3.3 实验室检查 3.3.1 粪便常规检查：粪便有性状改变，常为粘液便、脓血便或血便、稀便、水样便；镜检可有多量、少量或无红、白细胞。 粘液便、脓血便或血便，镜检可有多量红、白细胞，多见于沙门菌、侵袭性大肠杆菌、 肠出血性大肠杆菌、弯曲菌、耶尔森菌等细菌和某些病毒等所致的腹泻； 稀便、水样便，镜检可有少量或无红、白细胞，多见于肠产毒性大肠杆菌、轮状病毒、隐孢子虫、气单胞菌等所致的腹泻。 3.3.2 病原体检查：从粪便、呕吐物、血等标本中检出霍乱弧菌、志贺菌、伤寒副伤寒沙门菌以外的病原体或特异性抗原、特异性核酸片段 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 阳性。（详见附录A）。 注：应用分子生物学方法开展病原体检测时，应遵照相关规定执行。 4. 诊断原则 临床诊断应综合流行病学资料、临床表现和粪便常规检查等进行。病原确诊则应依据从粪便、呕吐物、血等标本中检出病原体，或特异性抗原、特异性核酸片段检测阳性。 5.诊断标准 5.1临床诊断病例：应同时符合3.2、3.3.1和/或3.1。 5.2 确诊病例：应同时符合临床诊断和3.3.2。 6.鉴别诊断 6.1霍乱 由霍乱弧菌感染所致。以剧烈腹泻起病，多数无腹痛，无里急后重；呕吐多为喷射状，不伴恶心；呕吐物及腹泻物呈米泔水样，量多，少数患者有洗肉水样便。脱水严重者常引起肌肉痛性痉挛，皮肤皱瘪，体表温度低于正常。粪便悬滴镜检可发现运动极活泼的弧菌，应进一步作细菌培养，进行鉴别诊断。 6.2 伤寒与副伤寒 伤寒与副伤寒甲、乙型临床表现以高热、全身毒血症状为主，可伴有腹痛，腹泻少见；副伤寒丙型可呈胃肠炎型发作，病程短，预后好，多在3～5天内恢复。血肥达氏反应阳性有助于伤寒诊断；血、骨髓、粪便或尿等标本中培养出伤寒或副伤寒杆菌即可确诊。 6.3 细菌性痢疾 由志贺菌属感染所致。腹泻以脓血便或粘液便较为常见，量少，常有里急后重，多伴有畏寒发热。粪便镜检可发现大量脓细胞、红细胞和巨噬细胞。粪便培养可检出志贺菌。婴幼儿中毒型菌痢或不典型菌痢应通过病原学诊断来鉴别。 6.4 阿米巴痢疾 由溶组织内阿米巴感染所致。潜伏期数周至数月，临床表现多无发热，腹痛轻，无里急后重；腹泻每日数次，量多，为暗红色果酱样血便，有腥臭味；镜检白细胞少，红细胞多，有夏科-雷登结晶，可找到溶组织内阿米巴滋养体。 6.5 非感染性腹泻 过敏性腹泻有接触过敏原史，既往有类似发作；药物性腹泻有服用致泻药物史；酶缺乏性腹泻有遗传病家族史。还有各种内外科疾病引起的症状性腹泻以及器官功能失调性腹泻等，通过详细询问病史，结合相应的检查结果进行鉴别。 附录A （规范性附录） 实验室诊断方法 A1.沙门菌检验 A1.1标本的收集 根椐腹泻患者的病程及临床表现等，采集相应的标本，发病第一周采血5ml，第二、三周取粪便2～5g或尿液10～15ml,粪便挑取有脓血、粘液部分，尿液留取中段尿或无菌导尿。所采集的标本尽快检验，运送时间超过2h者，标本应放入Cary-Blair运送培养基中，在冷藏条件下送检。 A1.2分离培养 A1.2.1直接分离培养 取新鲜粪便、呕吐物、尿液沉淀物（经3000/转离心沉淀10～15min，倾去上清液）标本接种于强选择性培养基(SS、BS、WS、HE琼脂等)和弱选择性培养基（Mac、EMB琼脂）平板各一块；血标本接种于血琼脂或营养琼脂平板，35℃～37℃培养18～24h，从平板上挑取可疑菌落（详见表A1.2.1）进行鉴定。 A1.2.2增菌培养 取新鲜粪便、呕吐物、尿液沉淀物0.5～1g接种于10ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液或亚硒酸盐增菌液等；血液5ml接种于50ml葡萄糖肉汤或胆汁葡萄糖肉汤中，35℃～37℃增菌6～8h，挑取增菌液分离培养，培养同A1.2.1。 表A1.2.2沙门菌属在选择性培养基琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 菌落特征 亚硫酸铋琼脂（BS） 还原亚硫酸铋菌落为黑色或墨绿色，菌落周围培养基可呈黑色有金属光泽；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基不变 EMB琼脂 无色半透明。 HE琼脂 WS琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色 SS琼脂 无色半透明，产硫化氢菌株有的菌落中心带黑色。 Mac琼脂 无色半透明。 A1.3鉴定 A1.3.1镜检 沙门菌革兰氏染色显微镜下可见革兰氏阴性小杆菌，大小1～3×0.4～0.9μ。 A1.3.2生化试验 挑取可疑菌落移种于三糖铁（或KIA）和MIU上，并作氧化酶、硝酸盐、KCN、赖氨酸试验；或移种于沙门菌生化鉴定板（条）；或上微生物自动鉴定系统（仪）进行鉴定。凡生化反应符合表A1.3.2.1、表A1.3.2.2者，以沙门菌属诊断血清作玻片凝集试验。 表A1.3.2.1沙门菌在三糖铁琼脂内的反应结果 类型 斜面 底层 产气 硫化氢 A1 A2 A3 A4 ﹣ ﹢ ﹣ ﹣ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢/﹣ ﹢/﹣ ﹢ ﹣ ﹢ ﹢ ﹣ ﹣ 注：﹢表示阳性；﹣表示阴性；﹢/﹣表示多数阳性少数阴性 表A1.3.2.2沙门菌生化反应结果 类型 靛基质 尿素 KCN 硝酸盐 赖氨酸 硫化氢 氧化酶 B1 B2 B3 ﹣ ﹢ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢ ﹢/﹣ ﹢ ﹢ ﹣ ﹣ ﹣ ﹣ 注：﹢表示阳性；﹣表示阴性；﹢/﹣表示多数阳性少数阴性 A1.3.3血清凝集试验 O抗原试验 用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、10；O7；O8；O9；O2和O11等因子血清做凝集试验。符合沙门氏菌属定义，A～F“O”多价血清不凝集，送有关部门进一步鉴定。 H抗原试验 先用多价H血清做凝集试验，如有一种或两种多价血清凝集，再用这种多价血清的各种H因子血清检查以确定第1相和第2相的H抗原。 Vi抗原试验 用Vi因子血清检查。 A1.4菌型的判定和结果 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 综合以上生化试验和血清学分型鉴定结果，判定菌型并报告结果。 A2　肠致泻性大肠杆菌检验 　　 A2.1　标本收集 采集病人急性期、用药前新鲜粪便、呕吐物标本（5克），尽快送检。运送时间超过2h者，标本应放入Cary－Blair运送培养基中，在冷藏条件下送检。 　　A2.2　分离培养 　　取新鲜粪便、呕吐物标本分别接种于对大肠杆菌抑制性较弱的选择性鉴别培养基或其它商品化的培养基。呕吐物标本亦可先经营养肉汤于37℃增菌培养，待有菌生长后，挑取1～2接种环转种至弱选择性培养基上，37℃培养24小时。 　　a）弱选择性鉴别培养基：麦康凯琼脂或伊红－美蓝琼脂等。大肠杆菌发酵乳糖，在麦康凯琼脂呈桃红色不透明菌落；在伊红－美蓝琼脂上为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。 　　b）肠出血性大肠杆菌需经mEC肉汤增菌液增菌6h，免疫磁珠捕获后，转种于 O157显色培养基和山梨醇麦康凯琼脂，肠出血性大肠杆菌O157：H7在这两种琼脂上分别为紫红色和无色菌落，部分菌株迟缓发酵山梨醇，在山梨醇麦康凯琼脂上为红色菌落。 　　A2.3　初步鉴定 　　挑取可疑菌落作生化反应及与大肠杆菌多价血清作玻片凝集试验，阳性者用单价血清作进一步鉴定。 　　A2.4　鉴定 　　A2.4.1　肠致病性大肠杆菌（EPEC） 　　a）标本：水样或蛋花汤样便、呕吐物； 　　b）生化反应符合大肠杆菌特征； c）血清学鉴定符合EPEC血清型（表A2.4）。 表A2.4　常见肠致泻性大肠杆菌的O血清群及血清型 　　 常见肠致泻性大肠杆菌的Ｏ血清群及血清型 　 婴幼儿腹泻　 　　　　　　　　成人和儿童腹泻 EPEC ETEC EIEC EHEC EAEC O20 O26 O44 O6:K15:H16 O8:K40:H9 O28ac O157:H7 O9:K99 O55 O86 O111 O8:K25:H9 O8:H47:H- O112 O26:K62:H11 O101:K99 O114 O119 O125 O11:H27 O15:H11 O124 O111 　 O126 O127 O128 O20:H- O25:K7:H42 O136 　 　 O142 O158 O25:K98:H- O27:H7 O143 　 　 　 O27:H20 O63:H12 O144 　 　 　 O73:H45 O78:H11 O152 　 　 　 O78:H12 O85:H7 O164 　 　 　 O114:H21 O115:[H51]1) 　 　 　 　 O127:H12 O128:H7 　 　 　 　 O128:H21 O139:H28 　 　 　 　 O148:H28 O149:H4 　 　 　 　 O159:H4 O159:H20 　 　 　 　 O159:H34 O166:H27 　 　 　 　 O169:H- 　 　 　 　 1)无动力的变异 　 　 　 d）PCR检测eae基因：引物对为SK1/SK2，扩增片段长度为881bp，序列如下： SK1：5′-CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3′， SK2：5′-CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG-3′ PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM　dNTP；5μlDNA模板；引物SK1和SK2各0.125μm；补足DH2O至50μl。同时设阴性和阳性对照。 PCR反应程序：95℃预变性10min；94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环,最后一个循环72℃延伸10min。 电泳及结果判断：PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为881bp判为阳性。 　　A2.4.2　肠产毒性大肠杆菌（ETEC） 　　a）标本：霍乱样水样便、呕吐物； 　　b）生化反应符合大肠杆菌特征； 　　c）血清学鉴定符合ETEC血清型（表A2.4）； d）检出大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）和／或耐热肠毒素（ST）。测定LT可用兔肠段结扎试验、皮肤试验、ELISA、Biken试验、平板免疫溶血试验、DNA探针杂交和聚合酶链反应（PCR）等方法；测定ST可用乳鼠灌胃试验、ELISA、PCR、DNA探针杂交等方法。 PCR同时检测elt和est基因：引物对分别为LTL／LTR和AL65／AL125，扩增片段长度分别为322和147bp，序列如下： LTL：5′-TCTCTATGTGCATACGGAGC-3′ LTR：5′-CCATACTGATTGCCGCAAT-3′ AL65：5′-TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG-3′ AL125：5′-CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC-3′ PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM　dNTP；5μlDNA模板；引物LTL和LTR各0.25μm；引物AL65和AL125各0.5μm；补足DH2O至50μl。 PCR反应程序：95℃预变性10min；94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环,最后一个循环72℃延伸10min。 电泳及结果判断：PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为322和（或）147bp判为elt和（或）est基因阳性。 B2.4.3　肠侵袭性大肠杆菌（EIEC） 　　a）标本：细菌性痢疾样便、呕吐物； 　　b）生化反应：不发酵或迟缓发酵乳糖，不产气，除O124外无动力，酒石酸盐阴性，赖氨酸脱羧酶阴性； 　　c）血清学鉴定符合EIEC血清型（表A2.4）； d）豚鼠角膜结膜试验（Sereny试验）、Hela细胞侵入试验阳性、PCR或DNA探针检测侵袭基因。 PCR检测ipaH基因：引物对为ipaIII／ipaIV，扩增片段长度分别为619bp序列如下： ipaIII：5′-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3′ ipaIV：5′-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′ PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM　dNTP；5μlDNA模板；引物ipaIII和ipaIV各0.125μm；补足DH2O至50μl。同时设阴性和阳性对照。 PCR反应程序：95℃预变性10min；94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环,最后一个循环72℃延伸10min。 电泳及结果判断：PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为619bp判为阳性。 　　A2.4.4　肠出血性大肠杆菌（EHEC） 　　a）标本：早期为水样便，后为血便、呕吐物； 　　b）生化反应：不发酵或迟缓发酵山梨醇，赖氨酸、鸟氨酸、鼠李糖、蔗糖、密二糖阳性，精氨酸、苦杏仁甙阴性； c）血清型鉴定：其血清型为O157：H7※（其中H7鞭毛抗原需用采用试管凝集试验法进行鉴定），O26：K62：H11、O111（表B1）；O157：H7的血清型亦可采用PCR检测O157和H7特异性基因的方法鉴定,引物序列见表A2.4.4。 表A2.4.4 O157:H7特异基因检测引物序列及扩增片段长度 引物名称 引物序列 目的基因 片段大小(bp) O157-F 5′-TTCAAACAGAGGACCATC-3′ rfbO157 636 O157-R 5′-CCCAGCCACTAAGTATTG-3′ flicH7-F 5′-GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC-3′ flicH7 625 flicH7-R 5′-CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC-3′ O157 O抗原特异基因检测: 反应总体积为25ul，在0.5ul离心管中依次加入: 10×Buffer2.5ul, 2mmol/L dNTPs 2.5ul，引物各0.5ul（10pmol/ul），Taq酶1U ，模板1ul，补足无DNA、RNA酶水至25ul，石蜡油封盖。反应程序：94℃5min，模板DNA预变性；然后94℃1min，63℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸5min。每次试验均设阴、阳性对照及空白对照。 鞭毛抗原H7特异基因检测: 反应总体积为50ul，在0.5ul离心管中依次加入: 10×Buffer 5ul, 2mmol/L dNTPs 5ul，引物各0.25ul（10pmol/ul），Taq酶1U ，补足无DNA、RNA酶水至50ul，模板1ul，石蜡油封盖。反应程序及试验对照均同O抗原特异基因检测。 d）Vero细胞培养法检测VT毒素，或送上一级有条件CDC进行PCR检测VT1、VT2、eaeA和Hly毒力基因。 A2.4.5 肠集聚性粘附大肠杆菌（EAggEC） a）标本：水样便、呕吐物； 　　b）生化反应：生化反应符合大肠杆菌特征；　　 c）Hep-2细胞粘附试验检测细菌对细胞的集聚性粘附或PCR、DNA探针技术检测特异性基因。 PCR检测aggR基因：引物对为aggRks1／aggRkas2，扩增片段长度分别为254bp序列如下： aggRks1：5′-GTATACACAAAAGAAGGAAGC-3′ aggRkas2：5′-ACAGAATCGTCAGCATCAGC-3′ PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM　dNTP；5μlDNA模板；引物aggRks1和aggRkas2各0.25μm；补足DH2O至50μl。同时设阴性和阳性对照。 PCR反应程序：95℃预变性10min；94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环,最后一个循环72℃延伸10min。 电泳及结果判断：PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为254bp判为阳性。 A2.4.6 肠致泻性大肠杆菌种间鉴别： 引物对SK1/SK2、VTcom-u／VTcom-d、LTL／LTR、AL65／AL125、ipaIII／ipaIV和aggRks1／aggRkas2分别检测eae、stx、elt、est、ipaH和aggR基因。详见表A2.4.6 表A2.4.6　多重PCR法鉴别肠致泻性大肠杆菌引物序列 引物名称 引物序列 目的基因 片段大小 (bp) SK1 5′- CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3′ eae 881 SK2 5′- CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG-3′ 　 VTcom-u 5′- GAGCGAAATAATTTATATGTG-3′ stx 518 VTcom-d 5′- TGATGATGGCAATTCAGTAT-3′ 　 AL65 5′- TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG-3′ est 147 AL125 5′- CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC-3′ 　 LTL 5′- TCTCTATGTGCATACGGAGC-3′ elt 322 LTR 5′- CCATACTGATTGCCGCAAT-3′ 　 ipaIII 5′- GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3′ ipaH 619 ipaIV 5′- GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3′ 　 aggRks1 5′- GTATACACAAAAGAAGGAAGC-3′ aggR 254 aggRkas2 5′- ACAGAATCGTCAGCATCAGC-3′ 　 　 PCR反应体积为50μl：10 mM Tris-HCl (pH 8.3)；50 mM KCl；0.1% Triton X-100；1.5 mM MgCl2；2.5 U of Taq 酶；0.2 mM　dNTP；5μlDNA模板；引物SK1、SK2、ipaIII和ipaIV各0.125μm；引物VTcom-u、VTcom-d、LTL、LTR、aggRks1和aggRkas2各0.25μm；引物AL65和AL125各0.5 μM；补足DH2O至50μl。同时设阴性和阳性对照。 PCR反应程序：95℃预变性10min；94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环,最后一个循环72℃延伸10min。 电泳及结果判断：PCR产物在2.5％琼脂糖上电泳，紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度分别如表中所述则判相应基因为阳性。 综合以上生化试验和血清学分型鉴定结果，判定菌型并报告结果。 A3.副溶血性弧菌检验 A3.1标本的收集 急性期、用药前采集病人新鲜粪便标本2～5g或2～5ml，所采集标本尽快检查。运送时间超过2h者，标本应放入Cary-Blair运送培养基中，室温条件下运送实验室。 A3.2分离培养 A3.2.1直接分离培养 取新鲜粪便接种于氯化钠蔗糖琼脂或35g/L氯化钠琼脂或TCBS琼脂等选择性培养基，35℃～37℃培养18～24h，从平板上挑取可疑菌落（详见表A3.2.2）做进一步鉴定。 A3.2.2增菌培养 取新鲜粪便0.5～1g或0.5～1ml接种于10ml氯化钠结晶紫增菌液（副溶血性弧菌增菌液）或碱性蛋白胨水等增菌液，35℃～37℃培养6～8h，挑取增菌液分离培养，培养同A3.2.1。副溶血弧在培养基上生长特性见表A3.2.2 表A3.2.2副溶血性弧菌在选择性培养基琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 菌落特征 氯化钠蔗糖琼脂 因不发酵蔗糖菌落近似培养基颜色，绿色或蓝绿色 35g/L氯化钠琼脂 菌落无色不透明 TCBS琼脂 因不发酵蔗糖菌落而呈绿色或蓝绿色 A3.3鉴定 A3.3.1镜检 挑取可疑菌落涂片镜检，副溶性弧菌革兰氏染色后显微镜下可见革兰氏阴性无芽胞杆菌,细菌形态多变,有杆状、弧状、丝状及球状。不同的培养基上生长的菌体差异很大：在高盐琼脂上呈球杆状；在血琼脂上主要呈卵圆形，少数球杆状也有丝状。悬滴标本运动活泼。 A3.3.2生化试验 挑取可疑菌落转种三糖铁培养基并作氧化酶、耐盐生长试验，并接种蔗糖、V-P、甲基红等生化反应培养基。具体 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 见表A2。 A4结果报告 综合镜检和生化反应结果判断菌型并报告结果。 表A2　致病性弧菌鉴定表 　　项目 霍乱 弧菌 拟态 弧菌 副溶血弧菌 创伤 弧菌 溶藻 弧菌 辛辛那提弧菌 河弧 菌 弗尼斯弧菌 雀周鱼弧菌（少女鱼弧菌） 霍利斯弧菌 麦氏 弧菌 气单胞菌 邻单胞菌 最适生长温度 37 37 37 37 37 25,35 37 37 25 25,36 37 28 37 氧化酶 + ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ 硝酸盐还原 + ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ 靛基质 + ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － ＋／－ ＋／－ ＋／－ ＋ ＶＰ +/- － － － ＋／－ ＋ － － ＋ － ＋／－ ＋／－ － 尿素酶 - － －／＋ － － － － － ＋ － － － － Ｌ－赖氨酸 + ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋／－ － －／＋ － ＋ Ｌ－鸟氨酸 + ＋ ＋ ＋／－ ＋／－ － － － － － － － ＋ Ｌ－精氨酸 - － － － － － ＋ ＋ ＋ － ＋／－ ＋ ＋ 葡萄糖产气 - － － － － － － ＋ －／＋ － － ＋／－ － 乳糖 -/+ ＋／－ － ＋ － － － － － － ＋／－ －／＋ － 麦芽糖 + ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋／－ Ｄ－甘露醇 + ＋ ＋ ＋／－ ＋ － ＋ ＋ － － ＋ ＋ － 蔗糖 + － － －／＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋／－ － Ｌ－阿拉伯糖 - － ＋ － － ＋ ＋ ＋ － ＋ － ＋／－ － 纤维二糖 - － － ＋ － ＋ －／＋ －／＋ － － － ＋／－ － 水杨素 - － － ＋ － ＋ － － － － － ＋／－ ＋／－ 明胶酶 + ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ － － － ＋ － 在不同盐量肉汤中生长试验 0%NaCl ＋ ＋ － － － － － － － － － ＋ ＋ 3%NaCl ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 6%NaCl ＋／－ ＋／－ ＋ ＋／－ ＋ ＋ ＋／－ ＋／－ ＋ ＋／－ ＋ － － 8%NaCl － － ＋ － ＋ － － － － － ＋／－ － － 10%NaCl － － － － ＋／－ － － － － － － － － O/129敏感性 10ug S S R S R R R R S R S R R/S 150ug S S S S S S S S S S S R S TCBS生长 Y G G G/Y Y Y Y Y G G/- Y － － A4弯曲菌检验方法 A4.1标本收集 于急性期、用药前采集病人新鲜粪便标本10g，立即送实验室进行培养，运送时间超过2h者，应放入Cary-Blair运送培养基，4℃冷藏送检；或将粪便标本直接接种增菌肉汤，并置于微需氧环境下，室温条件下运送。 A4.2粪便标本直接镜检 急性期患者的粪便可直接作涂片检查，革兰氏染色或用0.3％碱性复红单染色镜检，弯曲菌为细长、弯曲、呈S形或“海鸥展翅”状、无芽胞的革兰阴性菌。液体标本在暗视野显微镜下可见投标式或螺旋式动力，霍乱弧菌制动试验阴性，提示弯曲菌感染。 A4.3分离培养方法 A4.3．1培养条件 本菌为微需氧菌，在6% O2, 7% CO2, 7% H2 ,80% N2条件下生长最好。 可以使用①混合气体法；②烛缸培养法；③微需氧产气袋法。 A4.3．2直接培养 急性期、用药前采集的病人新鲜粪便标本可直接划线接种CCD琼脂平板（Charcoal, cefoperazone, desoxycholate agar）平板，37 oC微需氧培养24~72h。 A4.3．3增菌培养 病人新鲜粪便标本5g接种弯曲菌增菌肉汤（Preston肉汤），37 oC微需氧培养24~72h后划线接种CCD琼脂平板，37 oC微需氧培养24~72h。 B4.3．4可疑菌落在培养基上的形态特征（列表形式） 弯曲菌在CCD琼脂平板为灰色、湿润、沿划线生长，菌落常常不是规则圆形的。空肠弯曲菌通常为灰绿色的菌落，有金属光泽或无。结肠弯曲菌的菌落为奶油灰，湿润、突起。 A4.4鉴定 A4.4．1镜检 A4.4.1.1革兰氏染色镜检 弯曲菌为细长、弯曲、呈S形或“海鸥展翅”状、无芽胞的革兰阴性菌。 A4.4.1.2暗视野显微镜镜检 液体标本在暗视野显微镜下可见投标式或螺旋式动力，霍乱弧菌制动试验阴性。 A4.4．2生化鉴定 将可疑菌落划线接种到哥伦比亚血琼脂平板进行分纯，37℃微需氧培养48h。挑取菌落做生化反应进行确证。弯曲菌的生化鉴别见表A4.4.2。 表4.4.2 弯曲菌属种的生化鉴别表 空肠弯曲菌Campylobacter jejuni 结肠弯曲菌Campylobacter coli 红嘴鸥弯曲菌 Campylobacter lari 过氧化氢酶试验 + + + 氧化酶试验 + + + 马尿酸盐水解试验 + － － 吲哚乙酸酯水解试验 + + 马尿酸盐水解试验 用接种环自哥伦比亚血琼脂平板刮取菌苔，接种到0.4mL含1％的马尿酸钠溶液中，振摇试管以分散培养物，置37℃培养2h 。然后向试管中加入0.2ml茚三酮试剂，将试管于37℃放置10min，出现紫／蓝色者为阳性反应，无色或灰色为阴性反应。以阴性菌和阳性菌做对照。 吲哚乙酸酯水解试验 取50 uL含10％的吲哚乙酸酯溶液，将其浸入到直径为6mm的纸片上，将纸片在空气中晾干。挑取可疑菌落生长物，将其直接涂布在纸片上，同时滴加一滴无菌蒸馏水，观察5-10min。纸片显示蓝绿色为弯曲菌反应阳性。 A4.5 菌种保存 哥伦比亚血平板37℃ 微需氧培养48h，刮取菌苔，悬浮于含20％甘油的脑心肉汤， 置于－70℃冰箱保存。复苏时，将整菌种管取出化冻并摇动均匀后，整管转种不加抗菌素的弯曲菌增菌肉汤37℃ 培养48~72h。 A4.6结果报告 根据A4.1、A4.2结果，报告是否检出空肠弯曲菌或结肠弯曲菌。 腹泻病人同时感染空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的情况很常见。 A4.7培养基 A4.7.1 弯曲菌增菌肉汤： A4.7.1.1 成份 A组 布氏肉汤 Lab-Lemco 牛肉粉 10 g 蛋白胨 10 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000m L B组 弯曲菌生长促进剂 丙酮酸钠（Sodium pyruvate） 0.25 g 焦亚硫酸钠（Sodium metabisulphite） 0.25 g 硫酸亚铁（Ferrous sulphate） 0.25 g C组 抗生素 多粘菌素B（Polymyxin B） 5000i.u 甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim） 10mg 利福平（Rifampicin） 10mg 放线菌酮（Cycloheximide） 100mg D组 冻融的马血（或脱纤维兔血） 50mL A4.7.1.2 制法 A组各组成分混合，加热溶解，校正pH值到7.0±0.2。装瓶，每瓶100mL。121℃高压灭菌15min，备用。此为布氏肉汤基础培养基。 临用前，每100mL布氏肉汤基础培养基中加入冻融的马血（或脱纤维兔血）5mL、B组混合液0.5mL和C组抗生素混合液0.5mL，摇匀备用。 B组混合液的制备：丙酮酸钠、焦亚硫酸钠和硫酸亚铁均称取0.125 g，加入2mL无菌蒸馏水，摇匀备用。 C组抗生素混合液的制备：分别称取多粘菌素B 10mg、甲氧苄氨嘧啶10mg、利福平10mg和放线菌酮100mg，加入2mL的1：1丙酮和无菌蒸馏水溶液，摇匀备用。 在对抗生素进行操作时安全注意事项：①使用的抗生素中包含有放线菌酮，如接触到皮肤，应立即用大量肥皂水冲洗；②穿适当的保护性衣服，带手套。 A4.7.2 CCD琼脂 A4.7.2.1 成分 布氏肉汤 25 g Lab-Lemco 牛肉粉 10g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 微生物用碳粉 4 g 酪蛋白水解产物 3 g 脱氧胆酸钠 1 g 硫酸亚铁 丙酮酸钠 0.25 g 琼脂 12 g 蒸馏水 1000m L 头孢哌酮（Cefoperaone） 32 mg 两性霉素B（Amphotericin B） 10 mg A4.7.2.2制法 除抗生素外，各组成分混合，加热溶解，校正pH值到7.0±0.2。121℃高压灭菌15min，冷却至50℃，加入抗生素混合液0.5mL（以水为溶剂），摇匀，倾注平板。平板要密封避光保存，使用前置37℃过夜。 操作头孢哌酮和两性霉素B要注意安全保护，穿适当的保护性衣服，带手套。 　A5　小肠结肠炎耶尔森菌的检验 　　A5.1　标本的收集 于急性期使用抗生素前采集粪便标本和血液等标本，立即送实验室进行检测，运送时间超过2h者，应放入Cary-Blair运送培养基，4℃冷藏送检。血液标本应先进行增菌。 　　A5.2　分离方法 　　可直接接种于麦康凯培养基等选择性琼脂平皿上，26℃培养24～48h。同时取约1g标本接种于10mL改良磷酸盐缓冲液，于4℃分别增菌培养7天、14天和21天后取增菌培养物转种于麦康凯平板，26℃培养24～48h。 A5.3　挑选可疑菌落 挑取可疑菌落，分别接种改良克氏双糖琼脂，26℃培养24h。将改良克氏双糖琼脂上、下两层均产酸且不产硫化氢者转种Rustigian，s尿素培养基，尿素阳性者分别转种两支半固体培养基，分别置于26℃和37℃培养24 h。26℃有动力且37℃无动力者为小肠结肠炎耶尔森菌疑似菌株，分别进行生化鉴定和血清分型。 　　A5.4　生化鉴定 　　所有的生化反应均在26℃培养。本菌主要生化反应情况见表A5.4 　　表A5.4典型小肠结肠炎耶尔森菌主要的生化反应情况 项目 结果 项目 结果 项目 结果 动力25℃ +（—） 苯丙氨酸脱氨酶 — 蜜二糖 —（+） 37℃ — 氧化酶 — 鼠李糖 —（+） V-P 25℃ +（—） 葡萄糖产气 — 蔗糖 +（—） 37℃ — 尿素酶 + 棉子糖 —（+） 靛基质 V 乳糖酐（氧化） + 山梨糖 + 硝酸盐还原 + 鸟氨酸脱羧酶 + 蕈糖 V 卵磷脂 V 精氨酸脱羧酶 — 木胶糖 V ß-半乳糖苷没酶 + 赖氨酸脱羧酶 — 七叶灵 V 甲基红 + D-树胶醛糖 — 水杨苷 V 枸橼酸盐 V D-树胶醛糖 + 注：+（—）：多数菌阳性，少数菌阴性；—（+）：多数菌阴性，少数菌阳性；V：不同生物型结果不同 A5.5　血清学检查 　　本菌具有菌体O抗原和鞭毛H抗原。用现在国际常报告的80多个O抗原因子，可将本菌分成不同血清型。目前我国已报告的血清型有54个。 A5.6 毒力基因检测 PCR法检测小肠结肠炎耶尔森菌ail、ystA、ystB、yadA、virF毒力基因。 　　A6　轮状病毒检验 A6.1　标本收集 A6.1.1 粪便：收集患者早期腹泻粪便约10g或10mL，置无菌容器内，冷藏运送至实验室，4℃或－20℃保存备检。 A6.1.2 血液标本： 如做抗体测定，必须采集2份血清标本。第1份(急性期)在发病时尽早采集，第2份在发病后1个月左右采集。无菌条件下抽取5m1血液，置于消毒试管。室温放置2 h，待凝固后分离血清。 A6.2 实验室检查（可采用下列方法之一检验） A6.2.1 电镜检查 ：直接电镜或免疫电镜检查病毒颗粒。 A6.2.1.1 腹泻患者粪便上清液0.2～0.5ml。 A6.2.1.2 直径约为3mm的铜网,每网为200目,以0.25%Formvar制备铜网上的支持膜,干燥后备用。 A6.2.1.3 染色液：1%醋酸铀或2.5%磷钨酸。 A6.2.1.4 血清：(1) 病人恢复期血清(1：5或1：10稀释)；(2) 兔抗ADRV诊断血清,其效价1：64(对流免疫电泳)以上,用时以生理盐水作1：20～1：50稀释。 A6.2.1.5 直接电镜法：取腹泻患者粪便上清液约0.2～0.5ml,加等量氯仿,振摇3～5min,3000r/min离心15～25min,取其上相液,用微量吸液器滴入有支持膜的铜网上,1～2min后,用滤纸轻轻吸去铜网上的液体, 自然干燥待检。对标本负染。用染色液染1min,吸去多余染液,干燥后上电镜观察。电镜下观察标本中的病毒颗粒，见到特殊轮形的病毒即可确定。 A6.2.1.6 免疫电镜：取经3000r/min离心的粪便上清液50～100μl,加入病人恢复期血清或兔抗ADRV血清(稀释后)50～100μl混合,37℃作用1小时,4℃过夜。将铺于载玻片上1%琼脂糖(厚约3mm)用刀片切成1×1的方块,置于3层滤纸上,用毛细吸管将抗原-抗体作用液滴在小方形的琼脂糖块上,迅速将铜网放在液滴上,待铜网几乎贴在琼脂糖块上时,取下铜网, 用滤纸轻轻吸去铜网上的液体, 自然干燥后用染色液染1min,吸去多余染液,干燥后上电镜观察，见到特殊轮形的病毒即可确定。 A6.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):将粪便标本用PBS稀释成10%，加SDS（终浓度为1%）于56℃30min处理后用等量酚、氯仿简单抽提病毒RNA，用10%不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后用硝酸银染色，可见清晰、典型的11条dsRNA条带，根据电泳图型判定结果。 A6.2.2.1 A组轮状病毒是婴幼儿腹泻的主要病原，电泳图可见11条RNA区带分四组，其排列为4.2.3.2。依据第Ⅳ组10和11 RNA片段电泳距离不同，把轮状病毒分为两个亚群：亚群I为短型（S型），两片段距离短；亚群Ⅱ为长型（L型），两片段距离长。 A6.2.2.2 B组轮状病毒即成人腹泻轮状病毒，主要引起青壮年腹泻。11条RNA电泳图的分布模式为4.2.1.1.1.1.1（或描述为4.2.2.3），第7.8.9节段明显分开。 A6.2.2.3 C组轮状病毒，主要引起婴幼儿腹泻， 11条RNA电泳图的分布模式为4.3.2.2，易于与A组和B组轮状病毒区别。 A6.2.3 琼脂糖凝胶电泳：提取的病毒RNA直接用1%琼脂糖凝胶电泳1～1.5h, 溴化乙锭染色后紫外灯下或凝胶成像系统观察，依据电泳图型判定结果。电泳图型的分布模式从上到下为3.2.3 .2 的规律。此外,还可以根据第4 组2 个片段迁移率上的差别,把A 组轮状病毒分成长型和短型,此法比PAGE电泳 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 简单快速，但检测灵敏度较低。 A6.2.4 ELISA检测法：检测病毒颗粒和抗原。有商品试剂盒供应，试验按常规方法进行。 A6.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）:从粪便标本中可检测出浓度很低的轮状病毒。根据病毒VP7或VP4基因在不同型的轮状病毒株间有高度变异而在同型毒株之间这一变异区高度保守的特征，运用逆转录后巢式PCR可区分轮状病毒的不同基因型，并可检测到不同轮状病毒的混合感染。根据检测不同基因片段的需要有多种引物序列可以选择，详见表A6.3。PCR反应体系及反应条件按选择的试剂及扩增仪而有所不同。扩增产物按常规进行电泳及结果判断。 表A6.3用于轮状病毒核酸检测及基因分型的寡核苷酸引物 引物 名称 引 物 极 性 分 型 用 途 序 列（5‘-3’） 退 火 温 度 （℃） 片断 大小 （bp） Pr1 RV(+) A组轮状病毒通用引物 GGT TAGCTCCTTTTAATGTATGGT 58 362 Pr2 RV(-) ACTGATCCTGTTGGCCATCC Beg9 G(+) G血清分型 第一轮引物 GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG 42 1062 End9 G(-) GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG RVG9 G(-) G血清分型 第二轮共用引物 GGTCACATCATACAATTCT 42 aBT1 G1(+) CAAGTACTCAAATCAATGATGG 749 aCT2 G2(+) G2血清型特异引物 CAATGATATTAACACATTTTCTGTG 652 aET3 G3(+) G3血清型特异引物 CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG 374 aDT4 G4(+) G4血清型特异引物 CGTTTCTGGTGAGGAGTG 583 Con3 P(+) P血清分型 第一轮引物 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA 42 877 Con2 P(-) ATTTCGGACCATTTATAACC Con3 P(+) P血清分型 第二轮共用引物 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA 42 1T1 P1(-) P1血清型特异引物 TCTACTTGGATAACGTGC 346 2T1 P2(-) P2血清型特异引物 CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC 484 3T1 P3(-) P3血清型特异引物 TGTTGATTAGTTGGATTCAA 268 4T1 P4(-) P4血清型特异引物 TGAGACATGCAATTGGAC 392 5T1 P5(-) P5血清型特异引物 ATCATAGTTAGTAGTCGG 584 A6.4 病毒分离 A6.4.1 细胞系：原代非洲绿猴肾或传代非洲绿猴肾细胞（MA104）细胞等。 A6.4.2细胞培养基成分：EagLe's 培养液、3%谷氨酰胺、青/链霉素（10,000μ/ml、10,000μg/ml）、胎牛血清、7.5%碳酸氢钠,10μg/ml 结晶胰酶。 A6.4.3 生长液：100ml EagLe’s 生长液中包含EagLe’s液84ml、胎牛血清10ml、青∕链霉素2ml、3%谷氨酰胺1ml，7.5%碳酸氢钠调液体pH值至7.2～7.4。 B6.4.4 维持液：100ml EagLe’s 维持液中包含EagLe’s液92mL、胎牛血清2ml、青∕链霉素2ml、3%谷氨酰胺1ml，7.5%的碳酸氢钠调液体的pH值至7.2～7.4。 A6.4.5 实验步骤 粪便上清液0.2ml～0.5ml先加青/链霉素0.2ml 4℃过夜处理或用0.45um除菌滤器过滤，将标本用终浓度为10ug/ml 结晶胰酶在37℃作用30min，接种到生长至80%单层细胞管，37℃吸附1h，弃去标本液，换上细胞维持液（含胰酶0.5～1.0ug/ml），在37℃孵育至出现细胞病变，按照上述方法在细胞内连续传代三次。用特异免疫血清作中和试验进行鉴定。对于粪便标本中轮状病毒的初次分离，最好先在原代细胞上传几代适应后再传至MA104细胞大量增殖。 一般实验室限于条件，不宜做到病毒分离。 A7 诺瓦克病毒检验 A7.1 标本采集 A7.1.1粪便标本应在发病首日采集,至多不能超过发病急性期(48～72h)。每份标本量约10～50ml。25～48h采集的粪便标本，阳性检出率最高。 A7.1.2 病人呕吐物是粪便标本的最佳补充,有助于病原的诊断。 A7.1.3若是饮用水,需用大容量(5～100L) 浓集病毒后检测。从流行病学角度出发,在水、食物或其它外环境标本中检出诺瓦克病毒有重要意义。 A7.1.4 采集患者急性期(发病5 天内) 和恢复期(发病3～6 周)血清,－20℃长期保存。 A7.2 实验室检查　 A7.2.1 电镜检查：实验方法同轮状病毒电镜检查。 A7.2.2 ELISA 方法：通过纯化的重组杆状病毒高效表达的诺瓦克病毒衣壳蛋白作为抗原,直接检测病人血中特异性IgG抗体。因存在隐性感染情况,需确认患者急性期和恢复期双份血IgG抗体滴度出现≥4 倍增长。 A7.2.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） A7.2.3.1按常规提取病毒RNA作为模板。引物设计选择病毒RNA 聚合酶区域。可选择下列引物对之一进行逆转录聚合酶链反应。 用于诺瓦克病毒核酸检测寡核苷酸引物： 引 物 引 物 序 列 片段大小(bp) P289 5′-TGA CGA TTT CAT CAT CAC CAT A-3′ 319 P290 5′-GAT TAC TCC AGG TGG GAC TCC AC-3′ P3 5′-GCA CCA TCT GAG ATG GAT GT-3′ 206 P51 5′-GTT GAC ACA ATC TCA TCA TC-3′ A7.2.3.2反应体系及反应条件按选择的试剂及扩增仪有所不同。 扩增产物按常规进行电泳及结果判断。 A8 肠腺病毒检验 A8.1 标本采集：同A6.1 A8.2 实验室检测 A8.2.1 ELISA方法：有商品试剂盒供应，试验按常规方法进行。 A8.2.2 聚合酶链反应（ PCR方法） A8.2.2.1 常规方法提取标本中病毒DNA作为模板。 A8.2.2.2采用与Ad40 及Ad41 六邻体基因高度保守区互补引物扩增腺病毒DNA。引物hexAA1885的序列为: 5′-GCC