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一．细胞培养技术
细胞周期的测定
一、原理
细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细
胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法
测群体周期。
测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用 BrdU 渗入测定细
胞周期的方法。
BrdU（5溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞 DNA 复制的原料，经过两个细胞周期后，
细胞中两条单链均含 BrdU 的 DNA 将占 l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个
周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两
条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。
二、仪器、用品与试剂
1、仪器、用品：同常规细胞培养
2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa 染液，秋水仙素，2×SSC 液
三、操作步骤
1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入 BrdU，使最终浓度为 10μg/ml。
2、44 小时加秋水仙素，使每ml 中含 0.1μg。
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3、48 小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。
5、染色体玻片置 56℃水浴锅盖上，铺上 2×SSC 液，距紫外灯管 6cm 处紫外照射 30 分钟。
6、弃去 2×SSC 液，流水冲洗。
7、Giemsa 液染色 10 分钟，流水冲洗，晾干。
8、镜检 100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。
9、计算： 细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）
附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg 十双蒸水 10ml 4℃下避光保存。
（2）2×SSC 配制: NaCl 1.75克，柠檬酸三钠·2H2O 0.88 克，加水至 100ml，4℃保存。
细胞的冻存和复苏
一、原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机
械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加
入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130
℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿
透细胞。
二、操作步骤
（一）冻存
1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。
2、1000rpm离心 10 分钟，弃上清液。3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至 5×10 6 /ml 左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管 1 ml。
5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7、按下列顺序降温：室温→4℃（20 分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1 小时）
→气态氮（30 分钟）→液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般 30 立升
的液氮能用 1～1.5 月。
（二）复苏
1、准备一个茶缸或 1000ml 的烧坏，内装 2/3杯 37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在 1分钟之内融化。
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心 10 分钟，弃去上清液。
5、沉淀加 10ml 培养液，吹打均匀，再离心 10 分钟，弃上清液。
6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
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三、试剂和器材
器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等
试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）
附：冻存液配制：
培养基加入甘油或 DSMO，使其终浓度达 5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后
4℃下保存。
细胞系或细胞株的建立
一、概念
1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的
细胞世系（Lineage of Cells）所组成。
2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质
或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或
传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous
cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株
或系。
二、建立细胞系（或株）的要求
什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培
养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的
细胞，常需做如下说明：
1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；
个体性别、年龄；取材的器官或组织。
如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。
2、细胞生物学检测：
了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍
增时间，接种率等。
如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常
组织侵润力等实验。
3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、
用量以及适宜 PH 值。
三、若干细胞建株的要点及基本过程
（一）肿瘤细胞培养技术要点
1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和
活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养
者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。
2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常
压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。
排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。
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3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率
根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成
或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特
殊
措施
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。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用
不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。
（二）人类淋巴母细胞建株方法
l、4ml 肝素抗凝血于离心管中，加入 2ml RPMI 1640。
2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有 4ml 淋巴细胞分离液的液面上静置 30min。
3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。
4、加 RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。
5、将白细胞接种至 1ml RPMI 1640培养基中，加入 10μl 环胞霉素和 100μl 的 EBV（EB 病毒）
液，混匀。
6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。
7、1500rpm，15min。将细胞接种至 1ml 培养基中（内含谷氨酰胺 1mM／ml）加入 10μl 环胞霉
素，轻轻混匀，37℃培养。
8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液 l—2次，并维持环胞霉素
的浓度。
9、 待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后， 可转入 25ml细胞培养瓶中，加 1—2ml 培养基，
37℃培养 10—15 天，一般每隔 3—4 天观察一次，决定是否换液，传代。
10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
和存档。
个别组织细胞的培养
体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育
阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞
培养的要点如下:
一、上皮细胞培养
上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上
皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细
胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。
体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠
表皮细胞培养在以 3T3 细胞为饲养层 （用射线照射后） 时， 细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。
降低 PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。
以表皮细胞为例， 用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞， 其法如下 （黑木凳志夫 1981）
1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成 0.5－1平方
厘米小块。
2、置 0.02%EDTA 中，室温，5 分钟。
3、换入 0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。
4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。
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5、取出表皮，剪成更小的块后，置 0.25%胰酶中，37℃，30—60 分钟。
6、反复吹打，制成悬液。
7、培养：用 80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。
8、直接加入培养基（Eagle 加 20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2 温箱培养。
二、内皮细胞培养
内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）
等有很大价值。
研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：
1、产后新鲜脐带，无菌剪取 10—15 厘米长一段，如不能立即培养，可于 12 小时内保存于 4℃。
2、用三通注射器吸取温 PBS 液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。
3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为 0.1%的粗制胶原酶，充满血管，
消化 3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温 PBS 轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此
步骤可重复）。5、离心去上清，加入 RPMI1640 培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱
培养。两至三天可见细胞长成单层。
三、神经胶质细胞培养
神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子
和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是
神经
组织中比较容易培养的成分。
人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍
体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏
感性，可用 ROUS病毒和 SV4 等诱发转化。
养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置 Hanks 液中漂洗一、二
次。
2、置于 30—50 倍体积的 Hanks 液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立 5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可
吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。
4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。
5、接入培养瓶或皿中，置 5%CO2 温箱中培养。
该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长
后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以 0.25%胰酶消化处理。
四、肌组织培养
各种肌组织均可用于培养，以心肌和骨骼肌较实用。
（－）骨骼肌细胞培养
1、出生 1 一 2 天的乳鼠，引颈处死。
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2、无菌取大腿肌组织，切成 0.3一 0.5cm 2 小块后，用不含钙镁离子的 Hanks 液配的 0.25%胰蛋白
酶消化，无菌纱网或纱布滤过。
3、计数调整细胞密度。
4、快接种量 2×10 6 /皿入培养基培养。
5、培养基内含 10%小牛血清，可加 1%的胎汁以促进分化。
接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，明胶配置：用 Hanks 液配成 0.01%明胶。
该细胞接种率约 50%， 细胞生长开始呈纺锤形， 培养 50－52 小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。
数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。
（二）心肌细胞培养
心肌细胞是最早的培养材料，Carrel 曾长期培养过心肌组织，至今心肌仍不失为好的培养物，最常
用的是鸡胚心肌。
心肌比较容易培养和生长，可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法，均可获良好的效果。取心室
肌培养较好，原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，培养成功时，一周后可见节律性收缩现象。
五、巨噬细胞培养
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨
噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活 2－3
周，多用做原代培养，难以长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如 P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶
性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：
1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬
细胞。
2、引颈处死小鼠。
3、手提鼠尾将其全浸入 70%乙醇中 3－5 秒。
4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，
暴露出腹膜壁。
5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，
使液体在腹腔内流动。
6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。
7、小心拔出针头，把液体注入离心管。
8、4℃下 250g离心 10 分钟后，去上清，加 10ml Eagle 培养基。
9、计数细胞。每只鼠可产生 20 一 30×10 6 细胞，其中 90%为巨噬细胞。
10、以 3×10 5 个贴附细胞/平方厘米接种。
11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用 Eagle 液冲洗 1 一 2 次，再
加新 Eagle 培养液置 CO2 温箱中。
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六、肾小球分离、移植培养
SD 大鼠颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡 1～2 分钟，2 次，置超净台内，打开腹腔取出肾脏
剪碎，置含 Hank’s 液的无菌培养皿洗涤，置 80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微
小组织透过筛网，滤过组织 Hank’s液混合物用吸管吸至 120 目不锈钢筛网，滤过，去小组织块，
滤过物吸至 200 目不锈钢筛网，轻轻滤过，Hank’s液洗涤 1 次，收集网上肾小球，镜下观察为分离
良好的肾小球。肾小球用 0.2%胰酶、0.1%胶原酶，37℃消化 20分钟，加血清终止胰酶反应，离心
除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至 24孔培养板或 25ml培养瓶，使肾小球大于 60个/cm 2 ，
加培养基 5～10ml（培养基组成：F12—3T3 上清 1：1；5%马血清；2.5%胎牛血清；胰岛素 5μg/ml；
25ng/ml氢化可的松；5μg/ml 转铁蛋白；25ng/ml前列腺素 E1；甲状腺素 0.02ng/ml；D缬氨酸
150ng/ml）肾小球培养 8～10天，去除肾小球未生长组分，细胞继续培养 24小时，形态学观察：细
胞生长成单层多角型细胞，直径约 100μm。
七、裸小鼠移植瘤单细胞分离培养
无菌条件下取出小鼠移植瘤组织，剪成 1mm 3 小块，用 0.5%胶原酶室温消化 30 分钟到 1 小时，
再加等体积 0.2%胰酶消化 5～8分钟， 在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置（分别作为加样
和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成，滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞）
来回推动注射器吹打组织以分离单细胞，终止酶消化方法同上。常规方法接种培养收获细胞。
二．细胞培养的基本内容
常用设备
准备室的设备：
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放
置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：
扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液 PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌
溶液）。
培养室的设备：
液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（80℃）、空调、二
氧化碳缸瓶、边台（
书
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写实验
记录
混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载
）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、
倒置显微镜、CO2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置 serum 和培养用液）。
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无菌操作
无菌室的灭菌：
1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3‰来苏尔或
者新洁尔灭或者 0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用 3‰新洁尔灭擦拭，然后用 75％酒精擦拭或者 0.5％过氧乙酸，再用
紫外灯照射
3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 2030 分钟
4.实验后灭菌：用 75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：
1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
3.用 75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75％酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒
玻璃器械洗消：
一、新的玻璃器皿的洗消：
1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5％稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾 120g：浓硫酸 200ml：蒸馏水 1000ml）浸泡 12小时，然后从酸
缸内捞出器皿用自来水冲洗 15次，最后蒸馏水冲洗 35 次和用双蒸水过 3 次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
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6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭
安全阀，当指针指向 15 磅时，维持 2030 分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消：
1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）
的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋
白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗 3 次。
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和
再次被污染。
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒
出蒸气，当蒸气成直线冒出 35 分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向 15磅时，
调节电开关维持 2030 分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消：
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75％酒精擦拭，再用
自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅高压（30
分钟）消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料：
橡胶和制品通常处理方法是： 先用洗涤剂洗刷干净， 再分别用自来水和蒸馏水冲干净， 再用烤箱烘干，
然后根据不同品质进行如下的处理程序：
1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用 NaOH 泡 6-12 小时,或者煮沸 20 分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安
装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内 15 磅 30分钟消
毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2. 胶塞烘干后用 2％氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟），自来水洗
净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内
高压消毒，烘干备用。
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在 2％氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时（切记时间不能过长），自来水
洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒
内高压消毒，烘干备用。
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4. 胶头可用 75％酒精浸泡 5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70％酒精浸泡消毒。塑料培养
皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后
需要用 2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000—100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果最好。
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔
或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而
可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12·6H2o)2g，30％盐酸 10m1，蒸馏水 88m1。
注意事项：
1.严格执行高压锅的
操作规程
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：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过
多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内
捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸
不彻底。
细胞培养用液的配制与消毒
器材与试剂：
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH 计、磁力搅拌器。
具体步骤：
一. 水的制备：
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
二.PBS的制备与消毒(也可用于其它 BSS，如：Hanks，DHanks 液的配制)：
1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的
烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml，摇匀即成新配制的
PBS 溶液。
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2.移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内
8 磅消毒 20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。 不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应
不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH为 8.0、温度为 37℃时，胰
酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因
Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+、Mg2+的 BSS，
如：D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若
用双蒸水需要调 PH到 7.2 左右）或 PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于 4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
四.青、链霉素溶液的配制于消毒
1. 所用纯净水（双蒸水）需要 15磅高压 20 分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位/瓶，用注射器加 4ml灭菌双蒸水。链霉素是 100
万单位/瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位/ml。1 单位＝1 微克？
五.RPMI1640的制备与消毒：
1.溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋
2-3 次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后
用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位/ml。
然后用一个当量的盐酸和 NaOH调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml，摇匀。
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸
下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4℃冰箱内待用。
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5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
六．血清的灭火：
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56℃水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培
养基中使用。
七.HEPES 溶液：
HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic
acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓度
为 10-50mmol/L，一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下：
准确称取 HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至 1L。过滤除菌，分装后 4℃保存。
注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液
内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可
完全（20ml）加入 1L培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。
八.谷氨酰胺：
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷
氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于
谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置 1 周可分解 50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，
用前加入培养液。 加有谷氨酰胺的培养液在 4℃冰箱中储存 2 周以上时， 应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1～4mmol/L。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养
液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解
后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。
九.肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml。因为现在市
售的多为肝素钠，包装为约为 0.56 克/瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后
过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 ℃ 。使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml（精确可加入 0.9ml）
即可。
十. Ⅰ型胶原酶：
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0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，
不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶-20℃保存。
十一.明胶溶液：
因为明胶难于过滤，所以配制 0.1％明胶溶液必须用无菌的 PBS配制。所以制备过程中必须要注意无
菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量 0.1 克（配成 100ml 溶液）—即解决无菌分装药品的问题。
其次要注意即使是 01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入 50ml 小
瓶中，4℃保存。
其他培养用液的配制：
20ug/ml 内皮生长因子，
注意事项：
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22
微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终
为 7.2，可在配制时调 PH 至 7.4。
细胞传代培养（消化法）
具体操作：
一. 传代前准备：
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入 37℃水浴锅内预热。
2.用 75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察
细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
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二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用 PBS 清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意
消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是 37℃。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明
此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
三.吹打分散细胞：
1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10ml 离心管中。
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1000 转/分钟离心 68 分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
四.分装稀释细胞：
1.分装：将细胞悬液吸出分装至 23个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，
传代细胞的密度应该不低于 5×10 5 /ml。最后要做好标记。
五.继续培养：
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2小时后开始贴附
在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25％时为一个＋，占 50％为＋＋，占 75％时为＋＋
＋。
传代细胞培养注意事项：
1.严格的无菌操作
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过
程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止
消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚红 4ml，加入蒸馏水
定容至 1000ml。10 磅 20min高压灭菌，使用时调节 PH 值到 7.4。注意 EDTA不能被血清中和，使用
后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。
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细胞的复苏
细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在196℃液氮中的细胞快速融化至 37℃，使细胞外冻存时的
冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作
一. 实验前准备：
1.将水浴锅预热至 37℃
2.用 75％酒精擦拭紫外线照射 30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
二．取出冻存管：
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
三．迅速解冻：
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2.约 12min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
四.平衡离心：
用架盘天平平衡后，放入离心机中 3000r/min 离心 3min
五.制备细胞悬液：
1.吸弃上清液。
2.向离心管内加入 10ml 培养液，吹打制成细胞悬液。
六.细胞计数：
细胞浓度以 5×10 5 /ml 为宜。
七.培养细胞
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入 37℃和 5％CO2 的培养箱内 24小
时（或者 2448 小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
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初学者易犯错误：
1 水浴锅未预热或者未预热到 37℃。
2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出
每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被
使用。
二.细胞悬液制备：
细胞悬液的制备方法是用 0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS 液洗涤后，加入培养液（或 Hanks 液或 PBS
等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸 5 滴细胞悬液到一离心管中，加入 5 滴台盼蓝染液（0.4％）或苯
胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证
盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出
现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有 16 个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（ 四个大格子细胞数/4)×2×10 4
说明：公式中除以 4因为计数了 4 个大格的细胞数。
公式中乘以 2 因为细胞悬液于染液是 1：1 稀释。
公式中乘以 10 4 因为计数板中每一个大格的体积为：
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm 3 而 1ml＝1000mm 3
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四.细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 10 4 个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少
量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数
准确；
4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线
上时，则只计上线，不计下线，只计
浙公网安备 33021202002483