基于小分子的锌离子荧光分子探针研究进展

有机化学 Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW * E-mail: wbzeng@csu.edu.cn Received January 8, 2013; revised February 22, 2013; published online March 7, 2013. Project supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 30900377, 81271634), the National Science Foundation for Distinguished Young Scholars of Hunan Province (No. 12JJ1012), the Education for New Century Excellent Talents (No. NCET-10-0800) and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20120162110070). 国家自然科学基金(Nos. 30900377, 81271634)、湖南省自然科学杰出青年基金(No. 12JJ1012)、教育部新世纪优秀人才计划(No. NCET-10-0800)及教育 部高等学校博士学科点专项科研基金(No. 20120162110070)资助项目. Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS http://sioc-journal.cn/ 1655 DOI: 10.6023/cjoc201301015 综述与进展 基于小分子的锌离子荧光分子探针研究进展 刘 敏 a 谭慧龙 a 刘治国 a 王 维 b 曾文彬*,a (a中南大学药学院 长沙 410013) (b中南大学湘雅三医院放射科 长沙 410013) 摘要 锌离子在生物体的大脑活动、基因转录和免疫功能等生理、病理过程中扮演着重要角色, 选择性识别和检测锌 离子具有十分重要的生物学意义. 荧光检测法在选择性、灵敏度、实时原位监测等方面具有独特的优势, 应用荧光法 检测胞内 Zn2＋是近年来研究热点之一. 文中按照三种不同的荧光作用机制(光诱导电子转移、分子内电荷转移和荧光能 量共振转移)进行分类和 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf , 介绍了近 10 年来锌离子荧光分子探针的研究进展, 概述了各类型重要荧光探针的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 、 性能及其生物应用, 评述了探针的结构和检测性能之间的关系, 最后展望了锌离子荧光探针的发展趋势和应用前景. 关键词 锌离子; 荧光; 探针; 小分子 Advances in Fluorescent Probes Based on the Small Molecules for Zn2＋ Liu, Mina Tan, Huilonga Liu, Zhiguoa Wang, Weib Zeng, Wenbin*,a (a School of Pharmaceutical Sciences, Central South University, Changsha 410013) (b Department of Radiology, Third Xiangya Hosipital of Central South University, Changsha 410013) Abstract Zinc ion (Zn2＋) plays an essential role in many physiological processes of the organism, such as brain activities, gene transcription and immune function, as well as some pathological processes and so on, therefore selective recognition and detection of Zn2＋ are of important biological significance. Fluorescence technology has unique advantages such as high selec- tivity, sensitivity, low cost, real-time and in situ monitoring, thus it has become one of the most important sensing technologies for zinc ion and a hot topic area in recent years to imaging Zn2＋ in cells. Herein, the latest progresses in the last 10 years of fluorescent molecular probes based on the small molecules for Zn2＋ are reviewed. These important fluorescent probes are classified according to three different mechanisms action (PET, ICT and FRET). The designs of molecular structure, sensing mechanism and biological applications of these probes are introduced. In addition, the structure and property relationships are elucidated. Finally, the problems and the developing trends in this field are also discussed. Keywords zinc ions; fluorescence; molecular probe; small molecule 锌是人体中含量仅次于铁的一种重要微量元素, 广 泛分布于细胞和体液中. 它直接参与体内细胞的生长发 育、生殖、组织修复、基因转录、金属酶催化、神经传 递、免疫功能等生命代谢过程[1,2]. 研究报道 Zn2＋与阿尔 茨海默病(AD)、癫痫症、缺血性中风和婴儿腹泻症等疾 病有着密切关系 [3]. 锌是第 II 副族过渡金属 , 具有 3d104s2 结构, 常用的紫外光谱、圆二色谱、核磁共振、 电子顺磁共振、循环伏安法等分析 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 均不适用于高效 测定 Zn2＋. 荧光法具有操作简便、灵敏度高、选择性好 等优点, 与显微镜连用可实现对细胞内外金属离子高时 空分辨率的成像, 这是其它传统分析方法无法比拟的[4]. 快速、便捷地检测锌离子的荧光分子探针备受关注, 特 别是对于细胞、组织和活体中锌离子的定量分析和分子 显像, 近年来已成为生物学、化学、分子影像学、临床 医学等领域的一个研究热点. 本文将综述近年来小分子 锌离子荧光探针的研究进展, 按照三种荧光作用机制: 有机化学 综述与进展 1656 http://sioc-journal.cn/ © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 光诱导电子转移(PET)、分子内电荷转移(ICT)、荧光能 量共振转移(FRET)进行分类和总结, 着重介绍各类型 荧光探针的设计、性能及其生物应用, 探讨探针的结构 和检测性能之间的关系. 1 基于光诱导电子转移(Photoinduced Elec- tron Transfer, PET)机理 在荧光分子探针的设计中, PET 是最常见的机理之 一[5]. 典型的 PET 荧光分子探针是由含电子供体的识别 基团, 通过一间隔基团和荧光团相连而构成. 在未结合 客体前, 识别基团中的非键电子在光照后将向激发态荧 光团转移, 由于识别基团的 HOMO 轨道能级高于荧光 团的 HOMO 轨道能级, 致使荧光团被激发到 LUMO 轨 道的电子无法直接回到基态 , 而是通过识别基团 HOMO 轨道返回, 发生 PET 过程, 荧光淬灭; 一旦识别 基团与客体相结合, 则该识别基团的氧化电位升高, 使 其 HOMO 轨道能级降低, PET 过程受到抑制, 甚至被完 全阻断, 被激发的电子可以直接返回到基态, 荧光恢复 (图 1). 因此, 基于 PET 机理的 Zn2＋荧光分子探针一般 是通过荧光从无到有或从弱到强的信号变化来达到检 测 Zn2＋目的. hν e - hν e - weakly fluorescent strongly fluorescent E HOMO LUMO excited fluorophore free receptor HOMO E HOMO LUMO HOMO excited fluorophore bond receptor 图 1 基于 PET 作用机理的示意图 Figure 1 Schematic illustration of the mechanism based on PET 基于 PET 作用机制的锌离子荧光分子探针大致可 分为: 喹啉类、荧光素类、香豆素类、氟硼荧染料类、 萘酰亚胺类、苯并唑类、亚氨二乙酸类、近红外染料类 等. 1.1 喹啉类 1987 年 Frederickson 等[6]首次报道了基于喹啉的 TSQ (6-甲氧基-8-对甲苯磺酰胺喹啉, 6-methoxy-8-p- toluenesulfonamido-quinoline)分子探针, 其作为一种组 织荧光染色剂可用于神经细胞内的 Zn2＋成像. 此后, 不 断有文章报道了以喹啉为母核具有高选择性和灵敏性 的 Zn2＋荧光分子探针[7～10], 而其中以 8-羟基喹啉或 8- 氨基喹啉为母体设计合成的 Zn2＋荧光分子探针发展迅 速[11]. 2007年江华等[12]报道了一个以8-羟基喹啉为母核 的锌离子荧光探针 1, 它是以 DPA [N,N-二(2-吡啶甲基) 胺, N,N-di-2-picolylamine]作为 Zn2＋识别基团, 并且在 8 位羟基处引入一个羧基, 一方面增加了化合物的水溶 性, 另一方面提高了探针对 Zn2＋亲和力. 配位 Zn2＋后 1 的荧光增强 14 倍, 发射波长从 425 nm 红移至 438 nm, 研究结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明, 1 可作为检测细胞内极低浓度 Zn2＋的荧 光分子探针, Kd值达到(0.45±0.02) fmol/L(表 1). 2011年 郭子建等[13]以 8-磺酰胺喹啉为母核设计合成了一个能 准确定量 Zn2＋的荧光分子探针 2, 游离的探针 2 在 302 nm 波长处有强吸收, 向中性 HEPES 缓冲溶液加入 Zn2＋后, 该处吸收强度降低, 但在 360 nm处出现新的强 吸收峰, 其发射谱中心在532 nm波长处. 通过滴定和单 晶衍射证明 2与 Zn2＋ 1∶1比率螯合, 其中DPA 中的三 个 N 原子和喹啉环上的 N 原子都参与了金属离子的配 位. N O COONa N N H N S O O N N N 1 2 N N 2012 年 Chan 等[14]以四氨基安替吡啉为识别基团连 接在 8-氨基喹啉母核上合成了一个选择性好和灵敏度 高的 Zn2＋荧光分子探针 3. 螯合 Zn2＋后, 探针 3 荧光增 强 10.6 倍, 并在紫外灯下可看见明显的绿色荧光. 探针 配位 Zn2＋后破坏了喹啉 N 原子与酰胺 H 原子之间的分 子内氢键, 导致荧光加强; 3 与 Zn2＋螯合能形成一个刚 性的环状结构 3a, PET 过程发生受阻是 Zn2＋诱导荧光增 强的另一个原因. 该课题组利用探针 3 成功地进行了活 体细胞中 Zn2＋的荧光显像研究. N HN H N O N N O Ph Zn2+ N O N N N O Ph Zn H N 3 3a 2+ 1.2 荧光素类 荧光素类染料作为荧光团具有较大的摩尔消光系 数, 在水溶液中荧光量子产率也比较高, 目前以荧光素 为荧光团基于 PET 机理的锌离子荧光分子探针的报道 Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS http://sioc-journal.cn/ 1657 较多. 早在 2000 年 Nagano 等[15]报道了以荧光素为荧光 团, DPEA [N,N-二(2-吡啶甲基)乙二胺, N,N-di-(2- picolyl)ethylenediamine]为识别基团的 Zn2＋荧光分子探 针 4 和 5. 两者的最大吸收波长和发射波长分别为 492 和 514 nm, 加入 Zn2＋后荧光强度分别提高 17 倍和 51 倍. 两个探针分子在中性缓冲液中的 Zn2＋的 Kd 分别达 到了 0.78 和 2.7 nmol/L. 值得一提的是, 由于识别基团 在苯环上的 5 位或 6 位取代, 使探针 4 和 5 对金属离子 的选择性产生了较大差别: 加入 Zn2＋后探针 4 的荧光增 强倍数比探针 5 小很多, 而在 Cd2＋存在条件下其选择性 却优于探针 5. 这主要取决于苯环上的羧基是否参与了 金属离子的螯合: 探针 4 的识别基团在 5 号位, 其结构 中的羧基参与了离子的螯合, 与 DPEA 四个氮原子组成 的螯合部分空腔较大, 结合的 Zn2＋不是那么牢固, PET 并未完全阻断, 使其荧光增强较弱, Cd2＋的离子半径比 Zn2＋大, 能够比 Zn2＋结合空腔更紧, 但是 Cd2＋的参与并 不能改变识别基团的 HOMO 能量, 所以 PET 过程仍然 发挥作用; 而探针 5 结构中的羧基在 6 号位, 由于位阻 无法参与配位螯合, 只有 DPEA 四个氮原子与金属离子 配位, 所以加入 Zn2＋、Cd2＋都出现荧光加强现象. OO OH HOOC NH N N N OHO X O X COOH N N N N N N 5-Substituted: 4 6-Substituted: 5 6: X = Cl, 7: X = H 2001 年 Lippard 等[16]以荧光素为荧光团, DPA 为 Zn2＋识别基团设计合成了荧光分子探针 6 和 7. 在没有 Zn2＋存在的 PIPES 溶液中, 探针 6 和 7 的荧光量子产率 分别为 0.38 和 0.25, 加入 25 μmol/L Zn2＋后荧光量子产 率分别达到 0.87 和 0.92, 两者的最大激发波长都蓝移 8 nm, 蓝移的主要原因是因为荧光素分子中的羟基作为 电子给体参与了 Zn2＋配位. 碱土金属 Ca2＋和 Mg2＋对探 针 6 和 7 无响应, 但过渡态二价金属离子 Cu2＋, Mn2＋, Ni2＋, Co2＋, Fe2＋使两者发生荧光淬灭. 另外, 由于 DPA 含有两个吡啶氮原子, 使得其 pKa 值较大, 极易质子化, 对溶液 pH 较敏感, 且探针的背景荧光较强(6: pKa＝8.4, Φ＝0.38; 7: pKa＝9.4, Φ＝0.25). 为解决此类探针荧光 背景强、pH 敏感等问题, Lippard 课题组陆续报道了一 系列 Zn2＋荧光探针, 解决 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 主要是通过在荧光素母 核上取代极性基团或者对识别基团DPA进行修饰[17～20], 而这类荧光探针的一个共同点都是基于 PET 机理响应 Zn2＋. 在 2005 年 Lippard 等[21]以荧光素染料为荧光团, 分 别在呫吨环上引入一个和两个 8-氨基喹啉基团作为 Zn2＋识别基团, 合成了荧光分子探针 8 和 9. 其中探针 8 在加入过量的 Zn2＋后, 吸收光谱从 505 nm 蓝移至 498 nm, 荧光增强 42 倍, pH 7～12 范围内稳定性较好, pH 5.5 时荧光强度最大. 探针 9 比探针 8 多一个淬灭基团, 所以其荧光背景非常弱(Φ＝0.005, 比探针 8小 5倍), 结 合 Zn2＋后, 其吸收光谱蓝移 10 nm, 两个探针在结合 Zn2＋后都表现出吸收光谱蓝移, 说明了荧光素染料母核 中酚氧原子参与了 Zn2＋螯合, 改变了母核中 π 共轭系 统. 激光共聚焦和双光子荧光显微研究揭示探针 9 具有 良好细胞膜透性, 能够响应细胞中的 Zn2＋, 但是相比于 探针 6 和 7, 9 对 Zn2＋亲和力低, 所以探针 9 只能响应细 胞中较高浓度的 Zn2＋, 这进一步说明了探针对响应离 子的亲和性是细胞检测中的一个重要参数. O HN NH N OHO COOH N HN COOH Cl N OHO O 8 9 近期 Lippard 等[22,23]又报道了一类以吡啶/吡嗪为识 别基团, 荧光素为荧光团的 Zn2＋荧光分子探针 10. 相比 于探针6, 10具有pKa值更小(pKa＝6.24), 荧光背景更低, 锌离子选择性更高等优点. 另外运用探针 10 可实现运 用一种新策略定量检测水溶液中 Zn2＋含量, 因为该类 探针以一种特别的方式与 Zn2＋结合: 当游离或以 1∶1 比率结合 Zn2＋时, 探针 10 的荧光很弱, 但是当以 1∶2 比率结合 Zn2＋时, 其荧光显著增强; 而当向含有 Zn2＋的 水溶液逐滴加入探针 10时, 则在 10/Zn2＋为 1∶2时荧光 达到最强, 继续滴加则出现荧光强度下降. 荧光素母核 O OH Cl O Cl COOH R N N 10 N N N N N N 有机化学 综述与进展 1658 http://sioc-journal.cn/ © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 上苯环的 6 位可以用羧基或酯基修饰, 并不会显著改变 探针 10 结合 Zn2＋后的光学特性, 另外还可以提高探针 的水溶性和细胞膜透性, 从而实现选择性监测细胞内、 外 Zn2＋的目的. 1.3 香豆素类 香豆素作为荧光团具有荧光量子产率高, Stokes 位 移大, 光稳定性好等优点. 2003, 2004年Bruckner等[24,25] 选择 4-氨甲基-6,7-二甲氧基香豆素为荧光团, 设计合成 了螯合诱导荧光增强型 Zn2＋荧光探针 11 和 12. 向中性 HEPES 缓冲溶液中加入 Zn2＋后, 探针 11 荧光增强 4.4 倍, Zn2＋的结合比率为1∶1, Kd为1 μmol/L, 但是该探针 螯合锌离子的动力学性质不是很理想, 加入过量的锌离 子后, 需要 300 min 才能达到平衡, 这限制了其在生物 学上的应用. 探针 12 在 Zn2＋加入后荧光增强 22 倍, 荧 光量子产率则由游离时的 0.04 提高到 0.88. 探针 12 在 pH 4.0～11.0 范围内稳定性好, 可作为大鼠 GH3 和 H4IIE 肿瘤细胞中 Zn2＋的荧光显像剂. O O MeO MeO N N N N O EtO 11 O O MeO MeO N 12 EtO O OEt O N N 2010 年杨小峰等[26]在 7 羟基香豆素母核 8 位上引 入一个氨基脲基团构建了基于西弗碱类的 Zn2＋荧光探 针 13, 其氨基脲结构中的 C＝N 键配位 Zn2＋后, 香豆素 母核由于 PET 过程发生受到阻碍, 导致荧光恢复(13a, Eq. 1). 与 Zn2＋结合前, 探针 13 的最大吸收和发射波长 分别是 416 和 483 nm, 结合 Zn2＋后, 最大吸收谱和发射 谱相应地蓝移 9 和 26 nm, 而探针分子中的羟基参与 Zn2＋螯合配位, 使 13a 的荧光团共轭体系变短, 这是吸 收谱和荧光谱发生蓝移的主要原因. 该探针对 Zn2＋具 有较高的选择性. O O COOEt OH N NHH2N O Zn2+ O O COOEt O N NHHN O Zn 13 13a (1) 2+ 1.4 氟硼荧(BODIPY)类 BODIPY 染料是一类新兴的荧光染料, 具有高的荧 光量子产率、高的摩尔消光系数、良好的光稳定性、对 pH 不敏感等优点. 2004 年 Nagano 等[27]报道了以 BOD- IPY 为母体合成的 Zn2＋荧光分子探针 14, 结合 Zn2＋后, 探针 14 荧光增强 30 倍, 荧光量子产率增加近 20 倍, 在 生理条件下, 碱金属或碱土金属浓度达到 2.5 mmol/L对 探针 14 选择性识别 Zn2＋无影响, Mn2＋, Co2＋, Ni2＋, Cu2＋ 诱导 14 产生微弱的荧光增强. 2005 年彭孝军等[28]以 BODIPY 为荧光团, DPA 为识别基团设计合成了 Zn2＋荧 光分子探针 15, 其 509 nm 处的荧光强度在探针结合 Zn2＋后明显增强, 荧光量子产率则由未结合锌离子时的 0.077 增至 0.875, 该荧光探针有较低的 pKa 值和解离常 数(pKa＝2.1, Kd＝1.0 nm, 表 1). 1514 B F F B N F F N N NH N N N 1.5 萘酰亚胺类 萘酰亚胺荧光团具有光化学性质稳定、激发及发射 波长较长、Stokes 位移大、对 pH 不敏感等优点, 已被 广泛应用于设计各种金属离子分子探针. 2005 年钱旭红 等[29]报道了基于 4-氨基萘酰亚胺衍生物的 Zn2＋荧光探 针 16. 游离的探针 16 因为苯胺上氮原子的孤对电子到 4-氨基萘酰亚胺的 PET 作用使其本身的荧光很弱. 加入 Zn2＋后, 探针 16 的荧光增强 6 倍, 荧光量子产率提高到 0.19, 滴定实验表明16与Zn2＋的结合比率为 1∶1, 但是 Cd2＋也对其表现出荧光增强作用, 对锌离子的识别有一 定的干扰, 细胞实验表明探针 16 可以用于细胞内 Zn2＋ 的显像. N O O HNO OH NH N 16 N N 2010年Yoon等[30]以萘酰亚胺为荧光团, 酰胺-DPA 为识别基团设计合成了 Zn2＋荧光探针 17. 有趣的是, 研 究发现探针 17 与 Zn2＋的结合模式和其它二价金属离子 有很大区别: 17 在水相中以亚氨酸的形式与 Zn2＋结合, 却以酰胺的形式同其它二价金属离子结合, 且亲和力远 远小于与 Zn2＋的结合(Scheme 1). 探针 17 与 Zn2＋结合 后, 因为亚氨酸结构增长了萘酰亚胺荧光团的共轭链 Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS http://sioc-journal.cn/ 1659 (17b)使其最大发射波长从 483 nm 红移至 514 nm, 并且 荧光增强 22 倍(表 1). 另外值得一提的是, 17 在与 Cd2＋ 结合后荧光增强 21 倍, 但其荧光波长却从 483 nm 蓝移 到 446 nm, 因此可以利用探针 17 荧光光谱信号变化的 不同方便地区分和检测 Zn2＋和 Cd2＋, 生物利用价值大 大提高. N Bu-n HN N N N O O O M2+ Zn2+ N Bu-n N O O N N N O H M N Bu-n N N N N O O O Zn H 17 aqueous solution aqueous solution 17a 17b 2+ 2+ Scheme 1 1.6 苯并唑类 2008 年 Wang 等[31]报道了以 4-氨基-7-硝基苯并二 唑(NBD)为荧光团, DPEA 和 DPA 为识别基团的 Zn2＋荧 光探针 18 和 19. 未结合Zn2＋前, 探针 18荧光强度很弱, 而 19 却表现出较强的荧光信号, 加入 Zn2＋后探针 18 荧 光增强 25 倍, 与 Zn2＋的结合比率为 1∶1, 解离常数 Kd 为 4.6 μmol/L, 相同条件下, 探针 19 则几乎观察不到荧 光变化, 这表明探针 18 结构中 N1原子在 PET 作用过程 中可能发挥着至关重要的作用(18a, Eq. 2), 由此可见, 识别基团中微小的变化可引起探针性能很大的改变. 探 针 18 具有有较好的水溶性, 荧光强度变化与 Zn2＋浓度 N O N HN N1 N N NO2 N O N N N1 N N Zn NO2 Zn2+ 18 N O N N NO2 NN 19 weakly fluorescent strongly fluorescent 18a (2) 2+ H 成线性关系, 可用于定量检测 Zn2＋. 2011 年 Chuburu 等[32]报道了一个以苯并咪唑为荧 光团的 Zn2＋荧光探针 20. 探针 20 是以四氮杂环十四烷 为识别基团, 可选择性识别 Zn2＋, 由于其在水溶液中与 H＋结合存在多重平衡, 探针 20 在酸性介质中无荧光, 只有在 pH＞8 条件下才发射荧光, Cu2＋的存在可导致其 荧光完全淬灭. 近期 Fukuzumi 等[33]报道了一个在苯并 恶唑环上分别连接 DPA 和 2-羟基萘结构作为 Zn2＋识别 基团, 构建了探针 21. 该化合物结合 Zn2＋后, 水溶液由 无色转变成黄色, 荧光增强 44 倍, 探针 21 结构中羟基 的去质子化以及 DPA 氮原子的孤对电子参与金属离子 螯合从而抑制 PET 过程, 是 Zn2＋诱导其荧光增强的原 因. 探针 21 的锌离子选择性好, pH 适用范围广, pH 3～ 10 范围内探针 21 的 Zn2＋荧光检测能力不受影响(表 1), 它甚至可以对凋亡细胞释放 Zn2＋的过程进行可视化监 测. N N H N HNNH NH 2120 O N HO N N N 1.7 亚氨二乙酸类 亚氨二乙酸类锌离子荧光探针一般都具有一个相 类似的识别基团: BAPTA [bis(o-aminophenoxy)ethane- N,N,N',N'-tetraacetic acid, 二(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N, N',N'-四乙酸]. Gee 等[34～36]报道了通过对 BAPTA 结构修 饰得到系列 Zn2＋荧光分子探针(22～27), 主要是去除一 个或更多个 BAPTA 上的螯合基团, 使探针能够保持对 锌离子的良好亲和力, 同时降低对 Ca2＋的结合能力. 探 针 22 在未结合 Zn2＋前基本无荧光 , 一旦加入 100 μmol/L Zn2＋后, 其荧光强度增加 200 倍, 探针 23 和 25 在相同实验条件下荧光强度分别增加 100 和 150 倍, 而 探针 24 在 Zn2＋足量条件下, 荧光强度仅提高 12 倍. 具 有更高亲和力的探针 26 游离时不发荧光, 加入 100 nmol/L 左右 Zn2＋后, 荧光强度增加几百倍, 探针 27 与 Zn2＋结合后表现出 75 倍的荧光增强, 神经元细胞实验 显示, 探针 27 可有效定位和检测线粒体中游离的 Zn2＋. 2003 年 Gunnlaugsson 等[37]报道了一个以萘酰亚胺为荧 光团, 芳香亚氨二乙酸为识别基团, 具有良好 pH 稳定 性和水溶性的荧光探针 28, 在水溶液中加入 Zn2＋后, 其 荧光强度增加 53倍, 在金属离子竞争选择性方面, 探针 28 对 Zn2＋的亲和力和选择性远超 Ca2＋, Mg2＋等离子. 有机化学 综述与进展 1660 http://sioc-journal.cn/ © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 2008 年 Katerinopoulos 等[38]报道了一个红光发射、锌离 子亲和力在纳摩尔范围的比率型 Zn2＋荧光分子探针 29. 其与 Zn2＋螯合后发射光谱从 590 nm 蓝移至 564 nm, 激 发光谱则由 553 nm 蓝移至 543 nm, 结合 Zn2＋的解离常 数达到了 4.0 nmol/L. 1.8 近红外染料类 近红外荧光分子探针的发射波长一般在 650～900 nm 范围, 具有较小的辐射能, 可避免对细胞和生物活 体样本的损伤, 能渗透到更深的活体细胞中甚至实现在 动物及人体身上检测目标物, 而且在该波长范围内生物 分子自身荧光较弱, 可避免背景干扰而获得较高的分析 灵敏度, 近红外荧光分子探针的这些优点都是紫外可见 荧光分子探针无法具备的. 碳菁染料(Cyanine dyes)是近红外荧光染料的一种, 目前利用 Cyanine dyes 报道的 Zn2＋荧光探针较多, 是一 个研究热点. 2007 年, 吴朝阳等[39]报道了以碳菁染料 IR-780 (IR 是 Infrared 的缩写, 780 表示该染料的最大吸 收波长为 780 nm)为荧光团, TAEA [三-(2-氨乙基)胺]为 识别基团的近红外 Zn2＋荧光探针 30. 探针 30 的激发和 发射波长分别位于 683 和 750 nm, Kd达到 1 nmol/L. 然 OMe2N NMe2 NOOC COOK OMe O NOOC COOK OMe NN O F COOK HO O OMe NKOOC F O F KO O OMe C F COOK O NH OMe NKOOC COOK O F KO O O NHKOOC O OMe N COOK COOK F O N(Me)2(Me)2N NHOOC O O OMe COOK COOK NO O HN NaOOC COONa N N O HN CN OMe N KOOC COOK 22 23 25 24 26 27 28 29 N N N N N I 31 N N O3S SO3Na NH N N N I N N NH N H2N NH2 I N N HN N N N N 32 30 33 Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS http://sioc-journal.cn/ 1661 而, 由于脂肪链含氮基团 TAEA 的配位金属离子能力较 弱, 只有碱金属或碱土金属对探针检测 Zn2＋没有明显 的干扰, 二价的 Co2＋和 Ni2＋对探针 30 可产生荧光加强, Mn2＋, Fe3＋和 Cu2＋等离子的存在会引起探针荧光淬灭, 这在一定程度上限制了其在生物学上的应用. 2006 年 Tang[40]和 Nagano 等[41]分别报道了以碳菁 染料 IR-780、IR-783 为荧光团, DPA 和 DPEA 为识别基 团的近红外 Zn2＋荧光探针 31 和 32. 探针 31 的荧光波长 位于 780 nm, 与 Zn2＋以 1∶1 的比率结合, 稳定后荧光 增强 20 倍, 其可用于巨噬细胞内的 Zn2＋荧光成像. 探 针 32 是一个比率型 Zn2＋荧光探针, 在 HEPES 缓冲溶液 中, 结合 Zn2＋后, 吸收波长红移 44 nm, 最大发射波长 则红移到 780 nm, 探针 32 对 Zn2＋选择性较好, 但有意 思的是, 在溶液中加入 20 倍量的 Co2＋时, 探针的吸收 波长红移 39 nm, 荧光强度也增加, 另外, 加入 Cu2＋则 会导致探针 32 的分解. 2012 年 Yoon 等[42]报道以 IR-780 为荧光团的近红 外 Zn2＋荧光探针 33. 探针 33 以三吡啶氨衍生物作为识 别基团, 向溶液中加入 Zn2＋后, 可以观察到溶液由蓝色 转变成粉红色, 并伴随着最大发射波长从 730 nm 蓝移 至 590 nm. 该探针对 Zn2＋表现出良好的亲和性, 1∶1 比 率结合, 33/Zn2＋配合物的解离常数达到了 1.2 nmol/L, 亲和力远远比 DPA 系列探针好, 吸收光谱强度 I510 nm/ I670 nm的比值与 Zn2＋浓度成线性关系, 探针 33 已运用到 C2C12 和 NIH3T3 细胞甚至斑马鱼神经细胞中检测 Zn2＋, 选择性和灵敏度良好. 以吩噁嗪为母体的化合物, 构成了众多的染料, 并 且具有作为药物和功能材料的应用价值. 2011 年 Lu 等[43]以苯并吩噁嗪为荧光团, DPEA 作为识别基团, 成 功合成了一个具有良好水溶性和膜透性的近红外 Zn2＋ 荧光探针 34, 磷酸缓冲溶液中探针 34 在 582 nm 和 623 nm 处有最大吸收峰, 加入 Zn2＋后, 582 nm 吸收峰发生 微弱变化, 623 nm 吸收峰随着 Zn2＋浓度的增加逐渐降 低, 发射光谱在656 nm处有最大峰值, 且该峰强度几乎 与加入的 Zn2＋浓度成正相关, 生物应用研究表明探针 34 具有细胞膜透性, 且没有明显的细胞毒性, 是一个颇 有前途的可以应用在水溶液和活细胞中检测 Zn2＋的荧 光探针. 2012 年 Lu 等[44]利用吩噁嗪母核为荧光团, 甲基取 代的 DPEA 为识别基团, 报道了近红外 Zn2＋荧光探针 35, 与探针 34 相比, 35 吩噁嗪母核中缺少骈苯结构, 其 主要目的可能是使水溶液中不存在离子平衡, 能够相应 地提高探针的 pH 稳定性, 实验表明探针 35 在 pH 6.0～ 10.0 范围内荧光无明显变化(表 1), 稳定性优于探针 34. 游离的探针 35 最大吸收峰出现在 657 nm, 加入 Zn2＋后, 蓝移 10 nm, 同时发现用 650 nm 波长光照射未结合 Zn2＋时的探针 35, 发现其表现微弱的荧光, 结合 Zn2＋后 677 nm 处荧光强度逐渐增加, 4 倍量时该值达到稳定, 探针 35 已成功实现了 KB 细胞中 Zn2＋的检测. N H Et N N H N N O N Cl N Et Et N O N N N N ClO4 34 35 - - + + 表 1 基于 PET 作用机理的 Zn2＋荧光分子探针的光化学性质 Table 1 The spectroscopic properties of Zn2＋ fluorescent probes based on PET 化合物 λmax, abs/nm λmax, em/nm 荧光增强倍数 Kd pH 适用范围 1 240/270 a 425/438b 14.3 (0.45±0.02) fmol/L 7.4 (HEPES)c 2 302/360 532d 3.7 (1.8±0.1) pmol/L 6.0～10.0 (HEPES) 3 238/252, 350 500/500 10.6 (58.5±5.4) mmol/L 6.5～8.0 (HEPES) 4 492/492 514/514 17 0.78 nmol/L 7.5 (HEPES) 5 492/492 514/514 51 2.7 nmol/L 7.5 (HEPES) 6 515/507 525/525 2.3 (0.7±0.1) nmol/L 5.5～8.4 (PIPES) 7 498/490 515/515 3.7 (0.5±0.1) nmol/L 5.5～9.4 (PIPES) 8 505/498 524/524 32.5 (48±3) μmol/L 7.0 (PIPES) 9 499/489 520/518 140 (41±3) μmol/L 7.0 (PIPES) 10 517/503 532/523 13.5 0.38 nmol/L 7.0 (PIPES) 11 345/345 446/446 4.4 1 μmol/L 7.0 (HEPES) 有机化学 综述与进展 1662 http://sioc-journal.cn/ © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 续表 化合物 λmax, abs/nm λmax, em/nm 荧光增强倍数 Kd pH 适用范围 12 350/350 650/650 23 0.5 μmol/L (MeOH) 4.0～11.0 (MeOH) 13 416/407 483/457 Turn one (0.95±0.35) μmol/L 3.6～7.4 (乙醇/水) 14 499/499 509/509 19.3 0.24 μmol/L 5.0～7.0 (HEPES) 15 491/491 509/509 11.1 (1.0±0.1) nmol/L 3.0～10.0 (PBS) 16 449/449 550/550 6 (0.62±0.1) nmol/L 3.6～8.0 (乙醇/水) 17 360/360 483/514 22 5.7 nmol/L 6.3～12.8(乙腈/水) 18 470/470 550/550 25 4.6 μmol/L 7.3 (PBS) 20 207/207 304/304 12 15 nmol/L ＞8.0 (CAPS) 21 318/290 550/542 44 12 pmol/L 3.0～10.0 (PIPES) 22 491/491 520/520 200 7.8 μmol/L 6.0～9.0 (MOPS) 23 548/548 589/589 100 23.0 μmol/L 6.0～9.0 (MOPS) 24 575/575 604/604 12 11.0 μmol/L 6.0～9.0 (MOPS) 25 492/492 521/521 150 2.1 μmol/L 6.0～9.0 (MOPS) 26 491/491 520/520 几百倍 15.0 nmol/L 6.0～9.0 (MOPS) 27 488/488 515/515 75 (15.0±2.0) nmol/L 6.0～9.0 (MOPS) 28 442/442 550/550 52.5 80.0 nmol/L 5.0～12.0 (HEPES) 29 553/543 590/564 Turn on 4.0 nmol/L 7.0 (HEPES) 30 683/683 750/750 Turn on 1.0 nmol/L 7.4 (HEPES) 31 730/730 780/780 20 63 nmol/L 6.4～7.5 (HEPES) 32 627/671 758/765 Turn on (98±0.9) nmol/L 7.4 (HEPES) 33 670/510 730/590 Turn on 1.2 nmol/L 2.8～9.7 (HEPES) 34 582, 623/582 656/656 1.9 (73.5±9.0) mmol/L 7.4 (PBS) 35 657/647 /677 7.0 50 nmol/L 6.0～10.0 (PBS) a 前面数据为探针游离时最大吸收波长, 后面数据为探针结合 Zn2＋后的最大吸收波长. b 前面数据为探针游离时最大发射波长, 后面数据为探针结合 Zn2＋后 的最大发射波长). c 原文献中未给出探针的具体 pH 适用范围, pH 一般取为 7.0～7.5, 括号内为缓冲液体系. d 探针游离时基本不发射荧光, 因此无最大发射 波长. e 原文献中未给出具体的荧光增强倍数, “turn on”表示探针结合 Zn2＋后表现荧光增强. 2 基于分子内电荷转移 (Intramolecular Charge Transfer, ICT)机理 ICT 机理是荧光分子探针设计中经常被运用的另一 个机理[5]. 典型的 ICT 荧光分子探针是在荧光团上分别 连接强推电子基和吸电子基, 构成一个强推拉电子体 系, 推电子基和吸电子基、荧光团共轭相连, 在光激发 下会产生从电子给体向电子受体的电荷转移, 当识别基 团与客体结合时, 会对荧光团的推拉电子体系产生影 响, 减弱或强化分子内电荷转移, 从而导致荧光光谱的 变化: 如果识别基团是电子供体, 则结合客体后会发生 荧光光谱的蓝移, 反之, 荧光发射光谱将发生红移(图 2). 由此看来, 通常可利用基于 ICT 机理的荧光分子探 针发射波长的移动变化设计成比率型 Zn2＋荧光分子探 针. 在已报道的应用 ICT 机理的 Zn2＋荧光分子探针中 是大致可分为: 苯并呋喃类、香豆素类、亚氨二乙酸类、 氟硼荧染料类、萘酰亚胺类、喹啉类等. 2.1 苯并呋喃类 2002 年 Nagano 等[45]报道了两个以苯并呋喃为荧光 团的比率计量型 Zn2＋荧光探针 36 和 37. 实验表明探针 donor acceptor donor acceptor interaction with the donor group E blue shift donoracceptor donoracceptor interaction with the acceptor group E red shift 图 2 基于 ICT 机理作用示意图 Figure 2 Schematic illustration of the mechanism based on ICT 37 的水溶性及荧光性质好, 更适合生物体系中 Zn2＋检 测. 随着 Zn2＋的增加, 探针 37 的最大激发波长从 365 nm 蓝移到 335 nm, 荧光强度比值(I335 nm/I365 nm)不断增 大, 测定该比值可以实现对 Zn2＋浓度的定量检测. 探针 37 已成功运用到生物活体细胞内 Zn2＋的显像. Cd2＋对该 探针的检测有一定干扰, 另外 Cu2＋, Co2＋与探针 37 能形 成配合物并使其荧光淬灭. Chinese Journal of Organic Chemistry REVIEW Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655～1667 © 2013 Chinese Chemical Society & SIOC, CAS http://sioc-journal.cn/ 1663 O OCH3H N N N N COOH 36 37 O OCH3H N N N N N O COOH 2.2 香豆素类 2004 年 Bruckner 等[46]以 7-氨基香豆素为荧光团报 道了一个比率型 Zn2＋荧光探针 38, 在甲醇溶液中加入 Zn2＋后其最大发射波长从 400 nm 红移至 431 nm, 最大 吸收波长从 484 nm红移至 505 nm. 探针 38 结构中内酯 氧原子参与了 Zn2＋配位(38a), 使探针发生 ICT 过程, Cu2＋和 Ni2＋对其有荧光淬灭作用, Cd2＋的存在会对检测 Zn2＋产生一定干扰. 2007 年 Nagano 等[47]报道了一个以 7 氨基-2-亚氨基 香豆素衍生物为荧光团的比率型 Zn2＋荧光探针 39. 游 离的探针 39 激发波长和发射波长分别为 513 和 543 nm, 荧光量子产率 Φ 为 0.8, 发出很强的绿色荧光, 加入 Zn2＋后, 荧光颜色由开始的绿色变成黄色, 发射光谱峰 从 543 nm蓝移至 524, 513 nm波长光激发的荧光光谱中 心在 558 nm, I558 nm/I543 nm的比值与 Zn2＋浓度成线性关 系. 由于 2 号位亚胺结构的存在, 在碱性环境中其发生 荧光淬灭, 因此只能应用在酸性或中性条件下, 在生理 条件下, 探针 39 可以用来检测大鼠和海马细胞中 Zn2＋ 浓度的变化. 2.3 亚氨二乙酸类 另外, Gee等[34,35]通过对BAPTA的结构修饰还设计 合成了两个基于 ICT 作用机理的 Zn2＋荧光分子探针 40 和 41. 在探针 40 的 Zn2＋滴定过程中, 随着 Zn2＋浓度的 增加激发波长从 378 nm蓝移到 330 nm, 同样条件下, 41 的荧光波长从 480 nm 蓝移至 395 nm. 在细胞分析实验 中, 两者对 1～2 mmol/L 的 Ca2＋, Mg2＋无响应, 同时与 Zn2＋的结合常数达到 300～400 nmol/L. 总之, 亚氨乙酸 类 Zn2＋荧光探针具有温和的 Zn2＋亲和能力, 且表现出 对 Zn2＋的选择性超过 Ca2＋, Mg2＋等离子. O NN N S N N N Zn2+ O ON N N N N N Zn2+O ON N 39 38a 38 O N O COOK N OCH3 KOOC COOK KOOC COOK NH COOK OCH3 40 41 2.4 氟硼荧(BODIPY)类 2008年Akkaya等[48]以BODIPY为荧光团设计合成 了能高选择性检测 Zn2＋浓度的近红外“OFF-ON”型荧光 分子探针 42. 在 BO