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首页 中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介

中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介.ppt

中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证…

刚上路
2009-11-28 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介ppt》,可适用于自然科学领域

中国药典年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介中国药典年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介山东省药品检验所主要内容主要内容、无菌检查方法学验证关键点及常见问题、微生物限度检查方法学验证关键点及常见问题、细菌内毒素检查方法学验证关键点及常见问题无菌检查的方法学验证无菌检查的方法学验证相关规定无菌检查验证的关键点验证中常见的问题一、相关规定药品无菌和微生物限度检查方法验证作为中国药典年版增订的一项重要内容对促进我国药品微生物检验的标准化是十分重要和必要的执行近一年以来的情况表明方法验证是促使我国药品无菌和微生物限度检查方法更加合理、科学和严谨的重要途径。(年月全国会议纪要)中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、研讨存在的问题希望各级领导能给予高度重视从各方面支持这项工作长期持续发展。实际工作中药品生产、研发企业和各级药检所在工作中都存在很多困难和问题。关于执行《中国药典》年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明国药典发号关于执行《中国药典》年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明国药典发号各药品检验所:   根据国食监注号“关于颁布和执行《中国药典》年版有关事宜的通知”规定《中国药典》月日起开始执行各药品检验所在执行“微生物限度检查法”和“无菌检查法”过程中遇到了一些问题为保证《中国药典》年版的顺利实施现就有关问题说明如下: .“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安全性检查的重要项目。虽然近几版《中国药典》均收载有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”但在如何保证检验方法的科学性和检验结果的准确性方面与国外药典相比仍具有一定差距其关键是《中国药典》未强调对检验方法进行必要的方法验证。为此药典会设立专项科研课题对年版《中国药典》的“微生物限度检查法”和“无菌检查法”增加验证试验的必要性进行研讨。根据研究结果年版《中国药典》规定当进行药品的“微生物限度检查”或“无菌检查”时应进行方法验证。验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定方法及确定的检测系统是否适用于该供试品的检验即只有通过方法验证才能确定供试品的检验条件和方法保证“微生物限度检查”或“无菌检查”方法的科学性和检验结果的准确性。.不同企业生产的相同品种特别是中成药因原料来源、工艺、辅料的不同药品可能表现出不同的抑菌特性同一个企业生产的相同品种因原料来源不同、工艺改变或不同实验室等原因也可能导致检测结果的差异。因此不同企业生产的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌检查”时其具体试验方法如冲洗量等不能简单照搬需通过验证试验核实该试验方法和检测系统是否适宜。.目前各药检所涉及的检验工作可分为三类:注册检验(包括进口注册和新药注册)、监督抽验和进口检验。考虑到各检验性质的差异各口岸所在进行进口复核及进口检验时应请企业提供方法验证材料或详细的SOP资料进行审核各口岸所完成复核时应在修订的进口注册标准中明确“微生物限度检查”或“无菌检查”的关键操作点(如供试品的处理方法等)及试验方法(如平皿法、薄膜过滤法、直接接种法等)并在复核说明中概述验证实验结果以方便以后的进口检验。对国内新药的注册检验也应请企业提供方法验证资料如果企业提供不出方法学验证资料根据药品注册管理办法应在审核意见中明确指出“方法学未经验证无法检验”并建议企业重新建立“微生物限度检查”或“无菌检查”方法。监督抽验药品由于年版以前历版《中国药典》未强调进行方法学验证故各药检所目前在进行具体品种检验时难度较大故也应请企业提供方法验证资料并进行审核未经过方法学验证的“微生物限度检查”或“无菌检查”结果决不能给出“符合年版《中国药典》的规定”的结论。                                国家药典委员会                                中国药品生物制品检定所                                 二五年十月十一日●验证的目的:验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。●验证的意义:保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。二、无菌检查验证的关键点验证的类型●前验证:建立药品的微生物限度检查法和无菌检查法时(当建立药品的无菌或微生物限度检查法时应进行方法的验证以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查)。●再验证:修订的检验方法供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时定期的方法验证(若药品的组分或原检验条件发生改变时检查方法应重新验证)。无菌检查验证用菌株:无菌检查验证用菌株:金黄色葡萄萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC(B)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CMCC(B)**拟修订为大肠埃希菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CMCC(B)生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)CMCC(B)白色念珠菌(Candidaalbicans)CMCC(F)黑曲霉(Asperglllusniger)CMCC(F)菌种的要求:传代次数不得超过代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第代)并采用适宜的菌种保藏技术以保证试验菌株的生物学特性。加菌量:<cfu。验证时按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每试验菌应逐一进行验证。验证方法:直接接种法薄膜过滤法薄膜过滤法薄膜过滤法将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤冲洗在最后一次的冲洗液中加入小于cfu的试验菌过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器加入等量试验菌作为对照。按规定温度培养~天。各试验菌同法操作。直接接种法直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基管分别接入小于cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各管取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基管分别接入小于cfu的白色念珠茵、黑曲霉各管。其中管接人规定量的供试品另管作为对照按规定的温度培养~天。结果判断:结果判断:与对照管比较如含供试品各容器中的试验菌均生长良好则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。消除供试品抑菌的方法消除供试品抑菌的方法增加冲洗量增加培养基的用量使用中和剂或灭活剂:β内酰胺酶、对氨基苯甲酸更换滤膜品种注意:重新进行方法验证。方法学验证资料试验记录方法学验证资料试验记录总的要求:详细、严谨、可操作性供试品信息检验数量和检验量:按照无菌检查的量确定供试品处理、供试品溶液的制备检验方法(选择直接接种法说明理由)实验用菌代数、稀释级、计数检验条件:主要是冲洗条件(冲洗液、冲洗次数、量必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等条件)。需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明逐日记录各菌的生长情况方法学验证资料试验结论方法学验证资料试验结论采用的方法:薄膜过滤法直接接种法关键实验点:如冲洗条件、中和、酶处理等因素三、验证及资料中常见的问题薄膜过滤法加菌的时机三、验证及资料中常见的问题薄膜过滤法加菌的时机按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液而验证试验主要考虑滤膜滤器残留抗菌物质对阳性菌的生长的影响可以与对照滤器比较而作出判断所以验证试验中加菌时机与方式只要与对照一致即可(中检所讲义)。薄膜过滤法滤膜材质选择薄膜过滤法滤膜材质选择普通滤膜有机膜低吸附滤膜根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。应保证滤膜在过滤前后的完整性。采用全封闭过滤器注意观察膜的状态某些油性供试品或采用蓖麻油等作为溶媒的供试品可以损伤普通滤膜。验证试验与无菌检查验证试验与无菌检查培养观察时间验证试验:按规定的温度培养~天无菌检查:阳性对照培养~h应生长良好问题:生长缓慢的判断标准?敏感菌株与阳性对照菌阳性对照菌不是验证试验选定的敏感菌株问题:降低了阳性对照菌的意义实际工作中抑制枯草芽孢杆菌的样品很多(敏感菌株)但阳性对照只能选择金黄色葡萄球菌。关于大肠埃希菌的问题关于大肠埃希菌的问题供试品无菌检查中规定“抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌”但在方法学验证中所用菌株没有大肠埃希菌。解决措施:抗革兰阴性菌的抗菌药物进行方法学验证时增加大肠埃希菌。即将修订将铜绿假单胞菌修订为大肠埃希菌。修订后按新方法执行。问题:方法选择错误问题:方法选择错误薄膜过滤法和直接接种法如:一般供试品(无特殊说明)采用直接接种法某厂家胸腺五肽注射液为普通注射剂完全可以采用薄膜过滤法生产单位进行的无菌检查验证法为直接接种法。也有的厂家把两种方法的验证都写上结论中也没有说明采用那种方法。CP:无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法只要供试品性状允许应采用薄膜过滤法。修订:改为薄膜过滤法重新进行验证。检验数量和检验量检验数量和检验量进行供试品无菌检查时所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。结合无菌检查检验数量和检验量确定验证时取样量。如同时进行无菌检查一定要按照规定的检验数量和检验量取样。生产单位进行方法学验证时检验数量要按照表批出厂产品最少检验数量。检验量(每只样品接入每种培养基的最少样品量)同上市抽验品种。无菌检查法中规定:只要供试品特性允许应将所有容器内的全部内容物过滤。因此验证试验中检验量就多不就少如ml注射液虽然每个滤膜每容器取ml也符合药典规定支分配至个或更多滤筒也可但建议取支分个滤筒(贵重药品和抗生素品种可灵活掌握但不能低于最少量)。对检验数量和检验量的把握应考虑便于实际操作比如处理ml袋的样品取袋样品一次分配到一组三联滤器检验数量大于药典规定的个但检验量似乎不符合药典规定的每袋样品取半量检验的规定仅为但根据药典检验量即为一次试验所用供试品总量(g或ml)的解释这与先将袋分配两个滤筒再将剩下袋抽入一个滤筒作为样定对照的方法一样却更节省时间。(中检所讲义)问题:冲洗条件、冲洗量的选择问题:冲洗条件、冲洗量的选择有些厂家提供的验证资料中对非抑菌性供试品也采用大量的冲洗ml次*次膜增加了出现误差的机会。对膜的损伤检验方法繁琐大大增加检验人员的工作量(检验要按照已经验证的方法进行)验证试验方法选择总的原则是由易到难冲洗不一定为ml次可少量多次如ml次注意充分振摇。对于抑菌性较强的供试品可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤以减少膜的吸附,减少冲洗量。如:抗生素品种取规定量混合至含适量稀释液(如ml等)的无菌容器中然后再过滤。对于抑菌性较强的注射用无菌粉末或固体原料一定要充分溶解、混合均匀。抗菌药可以根据其抗菌谱选择敏感菌先进行预试验找到合适的条件再进行其他菌的实验。采用开放式薄膜过滤器:滤膜分成几份与取样量、冲洗条件的选择有关建议尽量与无菌检查法一致(最常见为等分)。问题:方法描述不够详细没有可操作性问题:方法描述不够详细没有可操作性如:某产品验证资料内容“将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤冲洗在最后一次冲洗液中加入小于CFU的试验菌过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养集中或将培养基加至滤筒中”。验证的目的是为了“照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查”方法确立后以后该产品就可以采用该方法进行检验。修订:应记录取样量、(稀释方法)、冲洗液、冲洗量(冲洗条件)等。无菌检查方法学验证实例无菌检查方法学验证实例吡拉西坦氯化钠注射液吡拉西坦氯化钠注射液规格:ml:吡g与氯g方法选择:薄膜过滤法确定检品取样量(讲义中按上市抽验品种的检验数量为例)规定:每支样品接入每管培养基的最少样品量:半量最少检验数量:确定:每菌(*)瓶联过滤器瓶、联过滤器瓶实验条件选择冲洗:无菌名代数稀释级计数结果铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉菌结论结论说明本品在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计。本品可以采用薄膜过滤法(不冲洗)进行无菌检查。阳性对照菌选用金黄色葡萄球菌。维生素C注射液维生素C注射液规格:ml:g确定样品量:根据供试品的规格和检验目的每支样品接入每管培养基的最少样品量:ml最少检验数量:每菌(*ml)(建议全部内容物滤过)联过滤器支、联过滤器支方法选择:薄膜过滤法冲洗:无(或稍加冲洗)结论结论说明本品在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计。本品可以采用薄膜过滤法(不冲洗)进行无菌检查。阳性对照菌选用金黄色葡萄球菌。我们进行的其他厂家的维生素C注射液(ml:g)存在抑菌作用。注射用XXXX注射用XXXX规格:mg取样量:每菌瓶联过滤器瓶联过滤器瓶冲洗:无结论结论说明本品在该检验条件下对枯草芽孢杆菌有抑制作用。需采用进一步处理(加大冲洗量)以消除抑菌性单独进行枯草芽孢杆菌单独进行枯草芽孢杆菌其他菌可以不做:冲洗:ml膜(ml*)结果:结论结论说明本品在该检验条件下抑菌作用可以消除。本品可以采用薄膜过滤法(细菌冲洗ml膜)进行无菌检查。敏感菌株为枯草芽孢杆菌。特殊情况特殊情况眼用液体制剂:制剂通则中规定眼用液体制剂微生物限度检查法为“除另有规定外按薄膜过滤法或直接接种法检查至少从支供试品抽取规定量(每种培养基各接种支每支ml)直接或处理后接种于硫乙醇流体培养基及改良马丁培养基中。培养天不得有菌生长。若有菌生长应重新取倍量供试品分别依法复试各管均不得有菌生长。”眼用液体制剂微生物限度检查的方法验证同无菌检查方法学验证。无菌检查法拟增修订内容(征求意见稿)(仅供参考!!!)无菌检查法拟增修订内容(征求意见稿)(仅供参考!!!)二部增补本附录拟增修订内容二部增补本附录拟增修订内容一、附录页无菌检查法中的“铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC(B)〕”修订为“大肠埃希菌(Escherichiacoli)〔CMCC(B)〕”“铜绿假单胞菌”修订为“大肠埃希菌”二、附录页灵敏度检查菌液制备第行“…(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细管)…”订正为“…(用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细管)…”三、附录页方法验证试验.第~行“当建立药品的无菌检查法时应进行方法的验证以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若该药品的组分或原检验条件发生改变时检查方法应重新验证。验证时按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作对每一试验菌应逐一进行验证。”增修订为供试品的无菌检查应采用验证的方法无菌检查方法的验证是确认供试品在所采用的无菌检查方法和检验条件下无抑菌作用,以保证所污染的微生物能充分检出。若药品的组分或原检验条件发生改变时检查方法应重新验证。验证时按“供试品无菌检查”的规定及下列要求进行。方法验证试验的试验菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。上市产品监督检验进行方法验证时试验菌至少应选用金黄色葡萄球菌(抗革兰阴性菌为主的供试品选用大肠埃希菌)、生孢梭菌和白色念珠菌。对每一试验菌应逐一进行验证。.薄膜过滤法第行“将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤…”订正为“取每种培养基规定的供试品接种量按薄膜过滤法过滤…”.直接接种法第行“…。其中管接入规定量的供试品…”订正为“…。其中管接入每支培养基规定的供试品…”四、附录页供试品的无菌检查阳性对照第行删除“(大肠埃希菌的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌)”五、附录页薄膜过滤法水溶液供试品第行“…取出滤膜将其剪成等份…”订正为“…取出滤膜将其分成等份…”六、附录页表第行“≤V<”订正为“≤V≤”第行“V≥”订正为“V>”一部附录增补本拟修订内容一部附录增补本拟修订内容附录页无菌检查法中的“铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC(B)〕”修订为“大肠埃希菌(Escherichiacoli)〔CMCC(B)〕”“铜绿假单胞菌”修订为“大肠埃希菌”附录页灵敏度检查菌液制备第行“…(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细管)…”订正为“…(用管口塞有适度疏松的无菌棉花或管口外包扎无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细管)…”附录页方法验证试验、第~行当建立药品的无菌检查法时应进行方法的验证以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时检查方法应重新验证。验证时按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作对每一试验菌应逐一进行验证。”增修订为“供试品的无菌检查应采用验证的方法无菌检查方法的验证是确认供试品在所采用的无菌检查方法和检验条件下无抑菌作用,以保证所污染的微生物能充分检出。若药品的组分或原检验条件发生改变时检查方法应重新验证。验证时按“供试品无菌检查”的规定及下列要求进行。方法验证试验的试验菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。上市产品监督检验进行方法验证时的试验菌至少应选用金黄色葡萄球菌、生孢梭菌和白色念珠菌。对每一试验菌应逐一进行验证。”、薄膜过滤法第行“将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤…”订正为“取每种培养基规定的供试品接种量按薄膜过滤法过滤…”、直接接种法第行“…。其中管接入规定量的供试品…”订正为“…。其中管接入每支培养基规定的供试品…”附录页薄膜过滤法水溶液供试品第行“…取出滤膜将其剪成等份…”订正为“…取出滤膜将其分成等份…”附录页直接接种法删除“一次性使用含药产品供试品取规定量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。” 附录页表第行“≤V<”订正为“≤V≤”第行“V≥”订正为“V>”附录页表删除第行“一次性使用含药产品…”第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要(微生物检验部分)第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要(微生物检验部分)为了进一步理顺方法验证和目前监督抽验工作的关系讨论认为应对以建立科学合理的检验方法为目的的方法验证试验和对监督抽验工作中所采用抽验方法的有效性的确认实验加以区分具体有如下三点:对于注册检验如果没有合理的检验方法应严格按照药典要求通过完整的验证试验建立标准检验方法及SOP所建立的标准检验方法中应确定具体的实验方法如无菌检查中的薄膜过滤法和直接接种法微生物限度检查中的平皿法和薄膜过滤法。标准检验方法中应有关键的实验要点如无菌检查薄膜过滤法的冲洗条件微生物限度检查平皿法的供试品稀释程度(ml皿、ml皿应注明)。对有抗菌作用的样品应通过验证试验确定一株敏感菌株以供采纳该检验方法时进行方法的确认使用。对注册检验中已有验证资料的方法进行复核时应根据企业提供材料的情况结合药检所掌握的情况通过分析判断、适当的实验验证等保证验证资料中检验方法的合理、可靠和科学。对于目前比较突出的已上市品种的监督抽验问题原则上应向被抽验品种的生产单位索取方法验证资料如资料中已确定有敏感菌株可以该菌株为阳性对照确认或调整检验方法。如果没有及时获得验证资料或者验证资料中没有确定敏感菌株抗生素及抗菌品种可根据其抗菌谱确立一株敏感菌株进行方法确认试验其他品种可从药典验证菌株中选取一到两株菌快速确立检验方法一般细菌选择枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌真菌选择白色念珠菌或其他有可靠依据的敏感菌株方法确认实验可和检验同步进行。微生物限度检查的方法学验证微生物限度检查的方法学验证概述微生物检查验证的关键点验证中常见的问题内容内容概述样品前处理方法及验证菌落计数方法及验证控制菌检查方法验证总结并举例一、概述一、概述微生物限度检查法验证的目的:确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查。验证的内容:包括准确性(回收率)、专属性。验证的类型:前验证(建立微生物限度检查法时的验证)和再验证(修订检验方法后、供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时、定期的方法验证)。根据检查方法的不同分为:细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证。验证的意义:保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。总体思路与程序总体思路与程序某些供试品含有抗微生物物质使供试品中的活微生物的生长被抑制不能按常规方法检验必须以适当的方法消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性后活微生物才能生长得以检出。通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性来检测微生物的方法应通过验证以确定所用检测方法测定结果的可信度。需要验证的环节需要验证的环节验证实际上伴随着整个实验过程实验过程中的每一个环节均应有合理的证明(验证)保证其对结果判断没有影响。前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性应在验证的范围内。已有标准规程(SOP)和充足实验证明的前处理方法可以直接采用但出现疑问应进一步研究提高。供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点供试品中抗菌活性的去除供试品中抗菌活性的去除稀释法降低供试品的相对浓度薄膜法利用体积差异分离中和法利用化学(生物)专属性灭活离心法利用沉降系数差异分离各方法组合运用会达到更好效果!验证实验验证实验样品:首先应是合格的样品。本底微生物太多可以先灭活但不应因此影响药效。注意针对抽验品种本底微生物太高情况如我们没条件进行灭活处理可对检品适当稀释后再进行验证。(经请示专业委员会认可)检验量检验量指供试品一次检验的用量。一般为g或ml化学药膜剂为cm。贵重或微量包装的药品可酌减(不得少于g)。检查沙门菌的供试品其检验量改为g或ml。验证实验按检验量执行。微生物限度检查样品前处理微生物限度检查样品前处理制剂形式多样决定前处理各异液体供试品固体、半固体或粘稠液体供试品非水溶性供试品其他液体供试品液体供试品取供试品ml加pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml混匀作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯使供试品分散均匀然后再加pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。固体、半固体或粘稠液体供试品固体、半固体或粘稠液体供试品取供试品g加pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml用匀浆仪或其它有效方法混匀作为供试液。(常规方法)必要时加适量的无菌聚山梨酯并置水浴适当加温使供试品分散均匀。非水溶性供试品非水溶性供试品方法一版已有方法(乳化法)方法二版新增方法(萃取法)软膏、乳膏剂先将已备妥灭菌的含司盘g、单硬脂酸甘油酯g、聚山梨酯g的混合物融化待冷至℃时加入供试品g(或ml)立即用玻璃棒搅拌均匀分次少量慢慢加入℃的pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液ml边加边搅拌使供试品充分乳化作为:供试液。油剂取供试品ml加入无菌聚山梨酯~ml摇匀再加入pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml。栓剂称取供试品g加适量pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液置℃水浴保温min使溶加入无菌聚山梨酯~ml振摇使之乳化再加pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml摇匀。眼膏剂取供试品g加至ml无菌十四烷酸异丙酯必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量充分振摇使供试品溶解。然后加入pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液ml振摇~min静置待油水明显分层取其水层作为供试液。非水溶性膜剂化学药膜剂一般取样量为cm置灭菌锥形瓶中加入适量的pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液于℃水浴保温浸泡振摇以供试品浸液作为供试液。中药膜剂取cm剪碎加入适量的pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液(通常cm加ml或ml)浸泡振摇以供试品浸液作为供试液。肠溶及结肠溶制剂供试品肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品g肠溶制剂加pH无菌磷酸盐缓冲液至ml结肠溶制剂加pH无菌磷酸盐缓冲液至ml置℃水浴中振摇使溶解作为供试液。气雾剂、喷雾剂供试品气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品置冰箱冰冻室内约h取出速消毒供试品容器的开启部位周围用无菌钢锥在容器上消毒部位钻一小孔在室温轻轻转动容器使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液加至适量的pH无菌氯化钠蛋白胨缓冲液(若含非水溶性成分加适量的无菌聚山梨酯)中混匀取相当于g或ml的供试品再稀释成:的供试液。茶剂茶剂取供试品g置灭菌锥形瓶中加入稀释剂ml振摇~min以灭菌纱布过滤(如为袋泡茶可直接取袋以称样结果按:加稀释剂浸泡min)。注意:注意:以上供试品如吸水膨胀或黏度过高可增加稀释级的量制成:~:供试液制备供试液所用的乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应验证在该检验条件无抗菌作用。目标是使不便于取样的供试品分散均匀!细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证定量回收率测定实验细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证定量回收率测定实验在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。验证用菌株验证用菌株细菌计数方法验证用菌株:大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌霉菌及酵母菌计数方法验证白色念珠菌、黑曲霉取培养物用无菌氯化钠溶液稀释成含~cfuml的菌液。要求要求验证实验应独立平行进行次分别计算各次试验菌的回收率。具体方法具体方法)试验组)菌液组)稀释剂对照组)供试品对照组试验组试验组平皿法计数时取试验可能用的最低稀释级供试液ml和~cfu试验菌分别注入平皿中立即倾注琼脂培养基每株试验菌平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时取规定量试验可能用的最低稀释级供试液过滤冲洗应在最后一次的冲洗液中加入~cfu试验菌过滤按薄膜过滤法测定其菌数。菌液组菌液组测定所加的试验菌数稀释剂对照组稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时应增加稀释剂对照组以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时可用相应的稀释液替代供试品加入试验菌使最终菌浓度为每ml供试液含~cfu按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。供试品对照组供试品对照组取规定量供试液按菌落计数方法测定供试品本底菌数。回收率的计算回收率的计算试验组的菌回收率稀释剂对照组的菌回收率结果判断指标结果判断指标在次独立的平行试验中稀释剂对照组的菌回收率应均不低于。若试验组的菌回收率均不低于按此该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌回收率低于应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性并重新验证。常规法常规法供试液的常规制备方法:g(ml)样品加pH氯化钠蛋白胨缓冲液至ml,制成:供试液常规菌落计数方法的验证过程常规菌落计数方法的验证过程试验组:取:供试液ml和菌液ml(~cfu试验菌)分别注入平皿中立即倾注琼脂培养基每株试验菌平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。菌液组:取菌液ml注入平皿中倾注琼脂培养基每株试验菌平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。供试品对照组:取:供试液ml注入平皿中倾注琼脂培养基平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。结果判断结果判断计算试验组的菌回收率若三次平行试验各个试验菌的回收率均不低于按常规法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌回收率低于应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性并重新验证。培养基稀释法培养基稀释法取规定量的供试液加至较大量的培养基中使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。ml供试液可等量分注多个平皿。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。在采用培养基稀释法时应注意避免在注皿前菌液和供试液直接接触实验组(ml皿ml皿)每一平皿均应加ml菌液。以ml供试液平均分注个平皿的方法为例说明培养基稀释法方法验证的过程以ml供试液平均分注个平皿的方法为例说明培养基稀释法方法验证的过程g(ml)样品加pH氯化钠蛋白胨缓冲液至ml,制成:供试液供试液制备方法为常规法无需进行稀释剂对照组的实验试验组:ml:的供试液等量分注皿平行ml共皿每皿各加ml菌液。计算每皿平均菌数(A)供试品组(本底组):ml:的供试液等量分注皿平行ml共皿。计算每皿平均菌数(B)菌液组:每皿加入ml菌液平行皿。计算每皿平均菌数(C)回收率:(AB)C*% 结果判断: 结果判断:计算试验组的菌回收率若三次平行试验各个试验菌的回收率均不低于按培养基稀释法测定供试品的细菌数(或霉菌及酵母菌数)。若任一次试验中试验组的菌回收率低于应采用其他方法如薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性并重新验证。离心沉淀集菌法离心沉淀集菌法:供试液的制备:g样品加pH氯化钠蛋白胨缓冲液至ml混匀低速离心(rpm离分钟)去渣取上清ml高速离心(rpm离分钟)离心后不要震摇离心管(一般用ml带有刻度的离心管)用注射器或吸管(注意不要插到ml刻度以下)吸取上面的ml弃去再加  ml稀释液补充到ml混匀。试验组:取:供试液ml和菌液ml(~cfu试验菌)分别注入平皿中立即倾注琼脂培养基每株试验菌平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。菌液组:取菌液ml注入平皿中倾注琼脂培养基每株试验菌平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。供试品对照组:取:供试液ml注入平皿中倾注琼脂培养基平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。稀释剂对照组:稀释剂对照组:取含菌稀释液(含菌浓度为~cfuml)代替供试品经过低速离心后转移含菌稀释液至另一离心管中高速离心后用与制备供试液相同的方法吸取离心管上层ml液体再加  ml稀释液补充到ml混匀。取此液体ml注入平皿中倾注琼脂培养基每株试验菌平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。要保证稀释剂对照组的操作过程与实验组完全相同!不建议使用离心沉淀集菌法不建议使用离心沉淀集菌法操作过程不小心极易造成菌体损失使回收率降低。某些沉降系数低的细菌可能被漏检而验证试验无法对其验证。对某些抑菌性不强的样品建议采用培养基稀释法。薄膜过滤法薄膜过滤法供试品对照组:取规定量供试品相当于供试品g或ml如:供试液取ml,过滤冲洗(确定冲洗量)取出滤膜菌液面朝上贴在对应培养基上按薄膜过滤法测定其菌数。试验组:过滤量冲洗量同供试品对照组在最后一次的冲洗液中加入~cfu试验菌过滤按薄膜过滤法测定其菌数。菌液组:取菌液ml注入平皿中倾注琼脂培养基每株试验菌平行制备个平皿按平皿法测定其菌数。稀释剂对照组:稀释液ml菌液混匀过滤冲洗(冲洗量及冲洗方法同试验组)取出滤膜按薄膜过滤法测定其菌数。注意:注意:如回收率仍达不到首先考虑增加冲洗量少量多次冲洗不局限于药典所说的每次冲洗ml。可将待过滤的样品稀释至大量稀释液中(如:ml,多少量需在验证资料中注明)再进行过滤这样可以减少膜对样品抑菌成分的吸附。冲洗速度不易过快冲洗量不易过大。可与离心沉淀集菌法中和法等方法联用。其他消除抑菌效果的方法其他消除抑菌效果的方法β内酰胺类抗生素β内酰胺酶奎诺酮类抗生素molLMnSO当最低稀释级的供试液含有抑菌活性且采用上述消除抑菌活性的方法后试验菌的回收率还无法达到计数方法验证的要求时根据供试品的微生物限度标准和菌数报告规则在不影响检验结果判断的前提下可采用高一稀释级的供试液重新进行回收率的测定。若试验菌的回收率符合计数方法验证的要求那么进行供试品细菌计数或霉菌及酵母菌计数时应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液(中国药典增补本拟增订内容)控制菌检查方法验证定性能否生长、专属性实验控制菌检查方法验证定性能否生长、专属性实验样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证一般口服制剂验证大肠埃希菌外用制剂验证金葡和铜绿含药材原粉含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证试验菌株试验菌株按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。大肠菌群检查用大肠埃希菌梭菌检查用生孢梭菌。菌种的要求:不得超过代。菌液制备为~cfuml。试验组试验组取规定量供试液及~cfu试验菌加入增菌培养基中依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时取规定量供试液过滤冲洗试验菌应加在最后一次冲洗液中过滤后注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。阴性菌对照组阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性方法同试验组。阴性对照菌不得检出。结果判断结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。试验组未检出试验菌应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行例.大肠菌群检查法的验证例.大肠菌群检查法的验证试验组:取:供试液ml及~cfu大肠埃希菌加入乳糖胆盐发酵管±℃培养~h。阴性菌对照组:取:供试液ml及~cfu金黄色葡萄球菌加入乳糖胆盐发酵管±℃培养~h。结果判断:结果判断:大肠菌群在乳糖胆盐发酵管中生长表现为产酸产气。产酸使培养基颜色发生改变一般由紫色变为黄色产气可在倒管中出现气泡。如果阴性菌对照组发酵管未见产酸产气试验组发酵管产酸产气按此法进行供试品的大肠菌群检查。说明说明进行大肠菌群检查时应取乳糖胆盐发酵管支分别加入:供试液ml:供试液ml:供试液ml。而在进行大肠菌群检查法的验证时无需对此管的检查一一验证只验证加最低稀释级供试液的发酵管的检查即可。检查实验过程中的阳性对照也只需加在加:供试液的发酵管中。大肠菌群检查为半定量试验一般不建议使用离心沉淀集菌法。例.梭菌检查法的验证例.梭菌检查法的验证常规法实验组:取:供试液ml及~cfu生孢梭菌加入ml庖肉培养基厌氧条件培养。当实验管出现浑浊、产气等现象后取ml培养物涂布含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板上厌氧条件培养。阴性菌对照组:取:供试液ml及~cfu大肠埃希菌加入ml庖肉培养基厌氧条件培养。当实验管出现浑浊、产气等现象后取ml培养物涂布含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板上厌氧条件培养。薄膜过滤法薄膜过滤法实验组:取:供试液ml薄膜过滤冲洗在最后一次冲洗液中加入~cfu生孢梭菌取出滤膜加入ml庖肉培养基中厌氧条件培养。当实验管出现浑浊、产气等现象后取ml培养物涂布含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板上厌氧条件培养。阴性菌对照组:取:供试液ml薄膜过滤冲洗在最后一次冲洗液中加入~cfu大肠埃希菌取出滤膜加入ml庖肉培养基中厌氧条件培养。当实验管出现浑浊、产气等现象后取ml培养物涂布含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板上厌氧条件培养。如阴性菌对照组培养管未出现浑浊、产气等现象同时试验组培养管产生浑浊可不进行选择性琼脂培养直接判断可用此供试液制备及梭菌检查方法进行本供试品的梭菌检查当阴性对照组选择性平板上无菌落生长实验组选择性平板上有菌落生长时可判断可用此供试液制备及梭菌检查方法进行本供试品的梭菌检查。说明:说明:在进行梭菌检查实验时应取供试液ml份其中份置℃保温分钟后迅速冷却。阳性对照实验方法同方法验证试验组只做一份即可。如果份供试液培养管在培养h内均无浑浊、产气等现象判供试品未检出梭菌。总结一般的验证过程:总结一般的验证过程:第一步:常规法第二步:培养基稀释法第三步:薄膜过滤法在计数方法验证时先用常规法对种实验菌进行预实验如果某个或某些菌的回收率达不到继续用它验证下一步的实验方法。直到它的回收率达到以上。这时再用种菌进行平行试验。菌种保藏方法菌种保藏方法各种微生物由于遗传特性不同因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法首先应能保持原菌种的优良性状长期不变同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。斜面低温保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法(一)斜面低温保藏法-常用保藏法(一)斜面低温保藏法-常用保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上待菌种生长完全后置于℃左右的冰箱中保藏每隔一定时间(保藏期)再转接至新的斜面培养基上生长后继续保藏如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法的主要保藏措施是低温。一般可保存~个月左右。优点是简便易行容易推广存活率高缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力保藏期短传代次数多菌种较容易发生变异和被污染。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法的主要保藏措施是低温。一般可保存~个月左右。优点是简便易行容易推广存活率高缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力保藏期短传代次数多菌种较容易发生变异和被污染。(二)石蜡油封藏法(二)石蜡油封藏法此法是在无菌条件下将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面(或半固体穿刺培养物)上石蜡油层高出斜面顶端cm使培养物与空气隔绝加硅胶塞并用固体石蜡封口后垂直放在室温或℃冰箱内保藏。此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存~年左右。(三)冷冻真空干燥保藏法(三)冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中再在低温下快速将含菌样冻结并减压抽真空使水升华将样品脱水干燥形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封造成无氧真空环境最后置于低温下使微生物处于休眠状态而得以长期保藏。此法适用于各大类微生物。此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂保藏期一般长达~年存活率高变异率低是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。该法操作比较烦琐技术要求较高且需要冻干机等设备。(四)液氮超低温保藏法(四)液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂在液氮超低温(-℃)下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温并在降到低温之前使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂保藏期一般可达到年以上是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。此法的优点是操作简便、高效且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备且液氮消耗较多操作费用较高。菌种的保藏条件及时间菌种的保藏条件及时间版《中国药典》细菌内毒素检验及方法建立版《中国药典》细菌内毒素检验及方法建立细菌内毒素检验的方法学验证细菌内毒素检验的方法学验证概述方法的建立与验证关键点验证中常见的问题附:中外药典细菌内毒素检查方法收载及修订情况细菌内毒素概述前言细菌内毒素细菌内毒素概述前言细菌内毒素一、前言一、前言自世纪年代鲎血凝集机制的发现和鲎实验方法的建立以来引起了各国药政管理部门的极大兴趣并使细菌内毒素检查法在药品的热原限量控制中得到了广泛的应用和发展。尤其是与家兔热原法相比细菌内毒素检查法具有劳动强度低实验成本小等特点还可以通过对原料、活性成分、灭菌水、容器、赋形剂和终产品的细菌内毒素检测对生产过程进行质控更明显的特点是可以定量检测药品生产过程中可能污染的痕量内毒素并且为区分干扰作用与内毒素污染提供了极为重要的技术手段。二、细菌内毒素二、细菌内毒素细菌内毒素与热原的关系注射给药过程中偶尔会出现发热、寒战、头痛、恶心、呕吐等症状严重的甚至昏迷、死亡将这种药物的不良反应称之为热原反应能引起上述热原反应的物质被称之为热原(Pyrogen)。热原与内毒素的关系在学术上仍有争论但目前认为在GMP的条件下内毒素是主要的热原物质可以说无内毒素就无热原控制细菌内毒素就控制热原物质。这也正是鲎试剂用于药物生产过程或药物成品热原检测的基础。过去一直认为细菌内毒素来源于革兰阴性细菌但最近发现存在革兰阴性菌来源的不具有内毒素毒性的革兰阴性细菌脂多糖(LPS)结构。因此目前认为所有内毒素均为脂多糖但非所有的脂多糖均为内毒素。鲎试剂反应机制鲎试剂反应机制参与鲎血细胞凝集的成分是细菌内毒素的C因子、B因子、G因子、凝固酶原和凝固蛋白原。G因子激活的鲎试剂激活旁路鲎试剂中的G因子可以被真菌、酵母和藻类细胞壁中另一类细菌多糖()βD葡聚糖激活因此鲎试剂同内毒素的反应不是特异的。LPS不能激活G因子旁路。但是鲎试剂同葡聚糖的反应与鲎试剂同内毒素的反应敏感性是不一致的。有实验表明不同的鲎试剂在检测葡聚糖和内毒素上存在很大的差异鲎试剂与内毒素的反应更灵敏。尽管与鲎试剂反应的物质不完全是内毒素但目前作为鲎实验基础的两个原则仍是:、内毒素活性与热原性相关家兔和鲎实验作为人类发热和炎症反应的预测方法是相关的。、在注射剂GMP生产环境下不存在内毒素也就意味着不存在主要的热原物质。尽管存在少数例外但依然可以使用。凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理复杂的酶促反应过程细菌内毒素标准品细菌内毒素标准品IU=EU我国内毒素参考标准品无论是在赋形剂的选择还是标定标准和方法的使用上均与国际参考标准品取得了一致。鲎试剂凝胶反应的特征鲎试剂凝胶反应的特征⑴

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中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介

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