含硫氨基葡萄糖金属配合物的合成及与DNA和蛋白作用研究

第28卷，第2期 2008年2月 光谱学与光谱 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 SpectroscopyandSpectralAnalysis V01．28，No．2，pp374—379 February，2008 含硫氨基葡萄糖金属配合物的合成及与DNA和蛋白作用研究 吴姗姗1，张寅峰2，杜金风1，张岐¨，袁文兵1，顾海波1 1．海南大学海南省精细化工重点实验室，海南海口 570228 2．中国科学技术大学生命科学院，安徽合肥230027 摘要合成了四种含硫氨基葡萄糖金属配合物(M-GLUS，M=Co，Cu，Ni和Zn)，利用元素分析，摩尔 电导，核磁共振氢谱进行了结构 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 征。结果表明含硫配体与这四种二价金属离子均形成了2：1型非电解质 配合物。在pH7．08Tris缓冲液中，采用紫外吸收光谱和荧光光谱研究了金属配合物与小牛胸腺DNA的作 用机制，发现随着金属配合物量的逐渐增加，DNA电子吸收光谱的最大吸收峰呈增色效应，对配合物 DNA-EB体系也能产生荧光猝灭作用， 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 四种金属配合物均可与DNA发生相互作用，结合方式为部分插 入；在近似生理酸度条件下，利用荧光光谱对金属配合物与HSA／BSA的结合特性进行了初步分析，发现配 合物均能猝灭HSA／BSA的荧光强度，利用Scatchard方程计算了四种金属配合物与HSA／BSA的结合常数 和结合位点数，表明金属配合物与血清白蛋白有较强的结合且只有1类键合位，其中CoGLUS与蛋白的结 合力最强。 关键词D(+)一氨基葡萄糖；金属配合物；溴化乙锭；小牛胸腺DNA；血清白蛋白 中图分类号：0665文献标识码：A 文章编号：1000-0593(2008)02—0374—06 引 言 D(+)一氨基葡萄糖(D(+)-glucosamine，简称GLU)是 甲壳素天然多糖经脱乙酰化后壳聚糖的最终水解产物，糖类 化合物及其衍生物无论在生物医学和功能保健品领域都有着 极为重要的作用[1’2]。核酸是生命过程中的重要物质，它包 含了遗传信息，并参与这些信息在细胞内的表达，从而促成 代谢过程并控制这一过程。因此，研究小分子物质对DNA 结构和功能的影响，将有助于从分子水平上了解生命现象的 本质。同时，能够从基因的水平上解释某些疾病的发病机 理，并通过分子设计来寻找有效的治疗药物。金属配合物可 作为DNA结构和构象的探针，研究金属配合物与DNA的 键合与识别机理成为近10年来国际上比较活跃的研究领域 之一[3．‘]。血清白蛋白(serumalbumin，SA)是血浆中含量最 丰富的载体蛋白，也是目前研究最为广泛的一种蛋白质，它 能与许多内源及外源性化合物结合，起到储存和转运作用。 对血清白蛋白与药物分子相互作用的研究机制，对全面阐述 小分子化合物与蛋白质的结合规律和机理有重要意义L5’6j。 两分子二硫代氨基甲酸盐与二价过渡金属形成的配合物 在配位结构上通常为平面四方形[7]，作为生物探针分子有着 特殊的性质，同时考虑糖类化合物的生物生理特性，合成了 四种新型含硫氨基葡萄糖金属配合物并进行了结构表征，进 而探索了配体、配合物与DNA的作用机制，并在近似生理 酸度下与人血白蛋白(HSA)、牛血白蛋白(BsA)的结合特 性。 1实验部分 1．1仪器与试剂 Av400核磁共振仪(瑞士Bruker)}VafioEL111元素分 析仪(德国Elementar)，UV2450紫外一可见分光光度计(日本 岛津)，RF-540荧光分光光度计(日本岛津)，320-SpH计 (I-海梅特勒一托利多仪器有限公司)，DDS-307精密型电导 率仪(贵阳学通仪器仪表有限公司)。 氨基葡萄糖盐酸盐(Calbiochem-NovabiochemCo．)，三 (羟甲基)氨基甲烷(Tris)(生化试剂)和小牛胸腺DNA (帆一7．75×10-3tool·L-1)均购自上海华美生物工程公 司，溴化乙锭(恤=1．0×10一‘tool·L～，上海国药集团化 学试剂有限公司)，人血清白蛋白(中国生物技术集团公司)， 牛血清白蛋白(BioBasiche)。其他试剂均为分析纯，用前未 作进一步处理。实验用水为二次蒸馏水。 收稿日期：2007-02-28．修订日期：2007-05—29 基金项目：国家自然科学基金项目(20762003)和国家“863”引导项目(2005AA001240)资助 作者简介：吴姗姗，女，1982年生，海南大学应用化学专业硕士研究生 *通讯联系人 e-mailzhnfinechem@163．conl 万方数据 第2期 光谱学与光谱分析 375 1．2含硫氨基葡萄糖金属配合物的制备及表征 在N2的氛围中，500mg氨基葡萄糖盐酸盐溶于35mL 甲醇，加入适量KOH的甲醇溶液，搅拌20min，室温下(25 ℃)加入Cs2176nag，搅拌1h，得到淡黄色配体GLUS (GH，zNs2K，针状晶体，重结晶分离纯化，熔点135～137 ℃)。H1NMR：(D20，400MHz)艿：2．0(S，5H，一0H， 一NH)，2．89(t，2H，—CH—N)，3．40～3．76(m，3H， —CH—_o)，3．79(t，2H，—CH2一)，5．56(m，1H， C卜．CH一0)。制得的配体分别加入金属醋酸盐(M=CC+， Cd+，Ni2+，Zn2+)，室温搅拌反应3h。过滤浓缩，加入丙 酮析出沉淀至完全，用无水甲醇洗涤三次，真空干燥后得到 产物，产率达60％～70％。 元素分析结果和摩尔电导数据列于表1。通过分析电导 值并和文献[8]对比表明，配体在DMSO溶液中为1：1电解 质，配合物为非电解质。 Table1 Elementalanalysisandmolarconductancedataofthecomplexes 1．3配合物对DNA紫外光谱光谱滴定 在10mL比色管中加入一定量的T—S_HCl缓冲液、 DNA储备液、氨基葡萄糖金属配合物溶液，用二次蒸馏水稀 释至刻度，以不含DNA的TriS_HCl缓冲液为试剂空白，用 1Cln石英比色皿于300～230rlIn波长范围内测定DNA与氨 基葡萄糖金属配合物相互作用的紫外吸收光谱。 1．4配合物对DNA-EB荧光光谱的影响 荧光染料溴化乙锭(髓)是核酸与其键合常用探针，本 身的荧光很弱，但能平行地插入DNA内部地碱基对之间， 导致EB(DNA．EB)荧光显著增强[¨”。 用缓冲溶液配置DNA-EB(CmA=9．45×10_‘mol·L-1， CEB=4．24×10_5tool·L-1)溶液，分别向其中加入不同体积 的氨基葡萄糖金属配合物，反应30min后测定其荧光发射 光谱(狭缝Ex=Em=5nm)。 1．5配合物对DNA-EB荧光猝灭方式的判断 在DNA-EB(cmA=9．45×10_4tool·L～，clm=4．24× 10．5tool·L叫)的Tris-HCl缓冲液中，分别加入一系列不同 摩尔比(R=钿台物／cDNA)的配合物溶液，反应30m_in后测定 其荧光强度。以荧光强度Fo／F(不存在金属配合物／存在金 属配合物)对氨基葡萄糖金属配合物的浓度作图。 1．6配合物与人(牛)血清白蛋白的相互作用研究 荧光滴定实验：移取0．3mL1．0mol·L-1的NaCl溶液 和一定体积蛋白储备液(3．0×10_5tool·L-1)、TriS．HCl缓 冲溶液(pH7．08)于1crfl石英池(三者体积总和为3．0mL)， 以微量注射器逐次加入不同体积的金属配合物储备液(累计 体积<100vL)，反应时间为30m_in。对不同的金属配合物一 蛋白质体系选择不同的激发波长／发射波长(k／A。)，测定 荧光强度，所得数据用于结合常数等的计算。 2结果与讨论 2．1紫外一分光光度计法研究氨基葡萄糖金属配合物与 DNA的相互作用 DNA是由五种5L脱氧核苷酸通过磷酸二脂键聚合成的 多核苷酸长链，碱基处于螺旋的内部。在生理条件下，主链 外侧磷酸根带负电荷是亲水性，而碱基则是疏水的。碱基的 堆积力、氢键以及磷酸根与钠、钾等阳离子的静电作用共同 维持了DNA双螺旋结构的稳定性。DNA分子在波长260 m处有典型的吸收峰，这是由于核酸中嘌呤和嘧啶碱基的 共轭双键产生的。如果DNA的双螺旋结构被破坏，DNA分 子在260Bin的紫外吸收就会增强，这个现象被称为“增色效 应”。 由谱图1可知，随加入配合物浓度的增加，对应260nill 左右的吸光度值呈现增加的趋势，并且DNA最大吸收峰发 生蓝移。这是因为当配合物加入DNA中，配合物可能嵌入 到DNA双螺旋腺嘌呤碱基对之间，引起构成碱基堆积力的 疏水作用和范德华力的相应改变，影响了DNA构象与结构 的稳定，可以认为是配合物与DNA的碱基作用而破坏DNA 的双螺旋结构，从而产生增色效应。根据文献[12，133，单 独Coz+，Cuz+，Znz+，Ni2+离子在同样浓度比例下仅表现为 减色效应，单独配体对DNA的吸收无影响。从测得的摩尔 电导率中也可以看出，金属配合物为非电解质，说明四种金 属配合物均作为一个整体插入了DNA的螺旋结构中，对其 产生破坏作用。 2．2配合物对DNA-EB体系荧光强度的影响 为了明确配合物与DNA的结合模式，我们对金属配合 物与EB进行了竞争结合性实验。图2记录的是配合物对 DNA-EB复合体系荧光发射光谱的影响。从图中可以看出， 在不同量的金属配合物存在下，荧光强度却随着R(R= c配合韵／c功蛆)的增大而减小，而DNA-EB体系的最大荧光发射 波长基本没有发生移动，说明随着金属配合物的加入，取代 了DNA-EB体系中相当数量的EB分子，使EB从DNA中游 离出来，导致了DNA-EB体系的荧光强度减小，由此推测， 配合物与DNA作用的方式同EB与DNA作用的方式相似， 即为插入方式u钉。 万方数据 376 光谱学与光谱分析 第28卷 1．5 1．2 8 h。 品 皇 0．6 0 259．OO290．oo Wavelength]nllrt 259．00290．00 Wavelength／rim 8 l·。 {|o．8 盆0．6 0．4 0．2 O 259．00290．oo Wavelength／rim 8 l-2 旨 10．o O．6 0．3 0 259．00290．00 Wavelength／nm F唔1UV曲sorban∞spectra0ftheinteractionbetweenmetalcomplexesandI)NA C0-GLUS，1～7：c(mo卜L一1=O，1．25X10～，2．50X10一，5．01×10～，1．OOXl0一，2．01×10～，4．01×10—6， Cu—GI，US，1～7：c(mol·L一1)=0，6．93×lO一7，1．39×lO一6，2．77×10—6，5．54×10—6，1．11×10—5，2．22×10—5’ Ni-GLUS，l～7；c(mol·L一1)=O，7．33xlO一6，1．47×10一s，2．93X10—5，5．86×10—5，1．17X10一I，2．35XlO一5； Zn-GLUS，1～7：c(mol·L一1)=O，4．31×10—7，8．62×10—7，1．73×10—6，3．44X10—6，6．88×10—6，1．38×10—5 600 700 Wavelengtl_I，nm 扫400 篁 量300 》 鼍 至200 100 O 600 700 Wavelength／rim 扫400 重 量300 》 篙 蛊200 100 0 600 700 Wavelength／nm 置400 虫 量300 》 智 蚕200 100 0 600 700 Wavelength／nm №2Effectsotthemetaleomplex西Otllthefluoreseeneespectra01'DNA-EBsystem CoGLL璐，1～7：c(mol·L一1=O，1．25X10—7，2．50×lO一7，5．01×10—7，1．OOXl0—6，2．01×10—6，4．01×10—6I Cu-GLUS，1～7：c(mol·L一1)=O，6．93xlO一7，1．39×lO一6，2．77×lO一8，5．54×lO一8，1．11×lO一5，2．22×lO一5I Ni-GLUS，1～7：c(mol·L一1)=O，7．33×10—6，1．47×10—5，2．93XlO一5，5．86X10—5，1．17×lo—l。2．35×10—5， Zn-GLUS，1～7：c(mol·L一1)=O，4．31×10—7，8．62X10—7，1．73×10—6，3．44×10—6，6．88X10—6，1．38×10—5 2．3荧光猝灭方式的判断 根据经典Stern-Volmer方程[15]，Fo／F=l+Kq[翻， F0／F为(不存在猝灭剂)／(存在猝灭剂)时的荧光强度，K。 为与温度有关的猝灭常数，[翻表示猝灭剂浓度。无论是动 态猝灭或是静态猝灭，由Fo／F对[Q]作图均应得到一条直 线。图3中得到的均为曲线，说明金属配合物对DNA-EB体 系的猝灭并非单纯的静态或动态猝灭，而可能是两种猝灭方 式共同作用的结果。这两种可能性：(1)药物分子与DNA的 非嵌插作用使得DNA的骨架靠拢，EB从DNA双螺旋中被 挤出；(2)药物分子与DNA发生嵌插作用，将EB分子从 DNA-EB体系中置换出来[¨]。 2．4配合物与人／牛血清白蛋白的荧光相互作用 蛋白质能够产生荧光，是由于蛋白质中存在三种氨基 酸：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)，它们的荧 光强度比通常为100t9；0．5。因此大多数情况下以Trp残 基的荧光猝灭常用来表征药物与SA的结合关系。 图4和图5分别为H&VBSA及不同浓度的金属配合物 与H&VBSA反应后的荧光光谱。可以看出，对配合物一HSA 或配合物一BSA体系，当未加入配合物，激发波长(J：I。)为280 nnl时，HsA的最大发射波长(A。)均为337m，BSA的最 大发射波长均为342啪，此时蛋白的荧光主要来自色氨酸 残基。固定蛋白质的浓度(3．0×10_6mol·L1)，其荧光强 4 2 O 8 6 4 2 O “ 也 加 吣 ：耋 ¨ 毗 o 8蜀鲁os^_《 咖 咖 枷 蚕暑 咖 瑚 。 一 茸昌3IIl∞七葛_【3_ 万方数据 第2期 光谱学与光谱分析 377 0 80 160 240 Concentration／(10一tool·L一1) №3Fluorescencequenchingcqlrveof themetalcomplexestoDNA-EB 1：C伊GI．I7；2：Cu-GLU，3：Ni-GLU}4：Zn-GLU 700 600 鲁500 C ．旨400 害 要300 出 200 100 0 300 400 500 300 400 500 度随金属配合物的浓度增大而有规律地降低，表明其与蛋白 质发生了相互作用，猝灭了蛋白内色氨酸残基的荧光[1”。滴 定过程中，最后加入配合物的累加体积(ZmGLUS>Ni七LUS>Cu- GLUS。 参 考 文 献 SUNSheng-ling，WANGAi-qin，GAOYi-ci(孙胜玲，王爱勤，高忆葱)． 25(3)：374． GUOZhen-ehu，HANLiang，HUBo，etal(郭震楚，韩亮，胡博， 2002，22(6)l963． SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)，2005， 等)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)， YEYong，HUJi-ming，ZENGYume(叶勇，胡继明，曾云鹗)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)，2001，21 (5)t623． CHENHui—li，YANGPin(陈绘丽，杨频)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)，2002，22(6)l983． WANGJing-zheng，HEJi—xiang，JIANGChong-qiu(=F敬政，贺吉香，江崇球)．ChineseJournalofAnalyticalChemistry(分析化学)· 2001，29(7)；782． 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DUJin-feng，LIYing，ZHANGQi，etal(杜金风，李颖，张蚊，等)．ChineseScienceBulletin(科学通报)t2006，51(24)：2847． 万方数据 第2期 光谱学与光谱分析 379 SynthesisofSulfur’ContainedD(+)-GlucosamineMetalComplexesand InteractionwithDNAandSerumAlbumin WUSharrshanl，ZHANGYin-fenga，DUJin-fengI，ZHANGQih，YUANWen-bin91，GUHai-b01 1．HainanProvincialKeyLabofFineChem．，HainanUniversity，Haikou570228，China 2．SchoolofLifeSciences，UniversityofScienceandTechnologyofChina，Hefei230027，China AbstractFoursulfur-containedD(+)一glucosaminemetalcomplexesweresynthesized(M—GLUS，M—Co，Cu，NiandZn)and characterizedbyelementaryanalysis，molarconductance，andprotonnuclearmagneticresonaxlce．TheyieldofthecomplexWas about70％，anditdissolvedeasilyinwater．TheligandcOOrdinateswithmetalionsmainlybetweensulphurandmetalions．the coordinationmolarratiooftheligandtOmetalionwas2：1。andthemolarconductivityindicatedthatal】thecomplexesarenone- lectrolyte．Themechanismoftheinteractionbetweenmetalcomplexesandcalfthymus(ct)DNAinTrisbuffer(pH=7．08)， wasstudiedbyultravioletabsorptionandfluorescencespectroscopy．Theresultsfromvariedexperimentsshowedthattheinten— sityofthemaximalabsorptionpeaksincreasedwithgradualadditionofmetalcomplexes。butthemetalionscandecreasethenlax— imalabsorptionandtheligandhasnoeffectonit．Meanwhile，metalcomplexescouldremarkablyquenchtheemissionintensity oftheDNA-EBsystem，andthemetalcomplexescouldbeboundtoCtDNAThequenchingmechanismwasdiscussedbyStern- Volmer’Sequation，thefigureshowedthatitisinfluencedbystaticquenchinganddynamicquenching，sothepartialinteraction ofthecomplexesandctDNAwasthemajormode．UnderphysiologicalpHcondition．thisstudywasdesignedtoexaminethe effectofcomplexesonhumanserurfialbuminandbovineserumalbuminbyfluorescence．Thebindingconstantsandsitesofthe interactionwithSAwereanalyzedbytheScatchard’Sequation。theresultsindicatedthattherewasastronginteractionbetween thefoUgmetalcomplexesandserl／rnalbuminandthebindingforcewasCo-G】LUS>Zr卜(H．IIS>C巾GLUS>Cu-GLUS，andthe bindingsiteisonlyone． KeywordsD(+)-Glucosamine；Metalcomplexes；EthidiumbromideCalfthymusDNA；Serumalbumin *Correspondingauthor (ReceivedFeb．28，2007；acceptedMay29，2007) 万方数据 含硫氨基葡萄糖金属配合物的合成及与DNA和蛋白作用研究 作者： 吴姗姗， 张寅峰， 杜金风， 张岐， 袁文兵， 顾海波， WU Shan-shan， ZHANG Yin- feng， DU Jin-feng， ZHANG Qi， YUAN Wen-bing， GU Hai-bo 作者单位： 吴姗姗,杜金风,张岐,袁文兵,顾海波,WU Shan-shan,DU Jin-feng,ZHANG Qi,YUAN Wen- bing,GU Hai-bo(海南大学海南省精细化工重点实验室,海南,海口,570228)， 张寅峰,ZHANG Yin-feng(中国科学技术大学生命科学院,安徽,合肥,230027) 刊名： 光谱学与光谱分析 英文刊名： SPECTROSCOPY AND SPECTRAL ANALYSIS 年，卷(期)： 2008,28(2) 参考文献(18条) 1.孙胜玲;王爱勤;高忆慈 D-氨基葡萄糖与锌盐配位的红外光谱研究[期刊论文]-光谱学与光谱分析 2005(03) 2.郭震楚;韩亮;胡博 氨基葡萄糖及羧甲基氨基葡萄糖与铁(Ⅱ)、锌(Ⅱ)、钴(Ⅱ)、铜(Ⅱ)配合物的光谱特征[期刊 论文]-光谱学与光谱分析 2002(06) 3.叶勇;胡继明;曾云鹗 D-氨基葡萄糖金属配合物对DNA作用的谱学研究[期刊论文]-光谱学与光谱分析 2001(05) 4.陈绘丽;杨频 钴(Ⅲ)的联吡啶类混配配合物的合成,表征及其与DNA键合的光谱研究[期刊论文]-光谱学与光谱分 析 2002(06) 5.王敬政;贺吉香;江崇球 芦荟大黄素与血清白蛋白的相互作用[期刊论文]-分析化学 2001(07) 6.Cater D C;Ho J X 查看详情[外文期刊] 1994 7.Karlin Kenneth D 查看详情 2005 8.Geary W J 查看详情 1971 9.Marmur J 查看详情 1961 10.Reichmann M E;Rice S A;Thomas C A 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