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高效液相色谱讲义.ppt

高效液相色谱讲义

蓝冰雨诺
2009-11-23 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《高效液相色谱讲义ppt》,可适用于工程科技领域

第七章高效液相色谱法第一节概述一、史程、专用术语二、色谱分离过程和类型液固吸附色谱液液分配色谱离子交换色谱离子对色谱空间排阻色谱三、色谱流程和仪器四、HPLC的特点速度快分辨率高灵敏度高、柱子可反复使用第二节基本理论一、色谱分离过程(一)液固吸附色谱流动相为液体固定相为固体吸附剂根据物质吸附作用的不同来分离物质。流动相和固定相都是液体的色谱法即为液液色谱是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相另一种是涂渍于载体上的固定相。(二)液液分配色谱流动相极性小于固定相极性的液液色谱法称为正相分配色谱法流动相极性大于固定相极性的液液色谱法称为反相分配色谱法(三)离子交换色谱(四)离子对色谱法(五)分子排阻色谱法二、色谱流出曲线和保留值(一)色谱流出曲线及相关术语(二)保留值三、分离度第三节定性和定量分析一、定性分析(一)利用已知物对照法定性、利用保留特性、利用不同柱比较(二)色谱法和其他方法结合定性、利用化学反应定性、利用二极管陈列检测器、收集峰的流出物、HPLCMS二、定量分析(一)峰面积或峰高的测量方法、手测峰高、峰高乘半峰宽、剪纸称重、积分仪测定、微处理机测定(二)定量方法、峰面积归一法、外标法、内标法、内加法(或追加法)第四节高效液相色谱的分离模式一、基本原理二、分类、吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱、亲和色谱三、HPLC在生物大分子中的应用在生物大分子中的HPLC中体积排阻色谱离子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离模式。第五节液固色谱法液固色谱法通常称为吸附色谱、载体:硅胶、吸附剂吸附试样的能力、原理第六节键合相色谱法一、正相色谱法、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团。、分离机制属于分配色谱、主要用于分离极性不同的化合物特别是用来分离不同类型的化合物。二、反相色谱、分离机理、固定相、流动相第七节离子交换色谱离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。按结合的基团不同离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。种类阳离子交换树脂强酸性弱酸性阴离子交换树脂强碱性弱碱性离子交换层析适用性能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。使用离子交换剂使物质分离表样品强酸型(磺酸型)稀NHOH洗脱通过液酸性、中性化合物解离型、两性化合物稀NaOH洗脱强碱型(季铵型)强碱型稀HCl洗脱通过液通过液酸性化合物中性化合物解离型物质两性化合物(盐、生物碱)一、离子交换色谱的分离机理、不足之处:忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。、P:流动相中溶质的浓度Pb:填料表面上被吸附的溶质浓度D:流动相中洗脱剂的浓度Db:填料表面上洗脱剂的浓度Z:是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目。①Z可以小到忽略不计反应常数变为分配系数②在Z值不能忽略时在等度洗脱蛋白质的过程中容量因子K’与保留体积成比例同时洗脱过程中KdDb是常数用Kz表示。结论二、离子交换色谱的固定相、高分子类型填料①优点a填料的使用寿命长b具有较高的色谱容量c很少有非特异性吸附对于保持样品生物活性有利。②结构以交联共聚的苯乙烯二乙烯苯为基质同时也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。③类型MonoBeadsTSKgelDEAEPWSPPWCMPW、无机基质型三、离子交换色谱的流动相、流动相的PH值①离子交换容量受流动相的PH值影响②改变流动相PH值也会影响弱电离的酸性或碱性组分的电离情况因而改变组分的保留值。③流动相PH值的变化也能改变分离的选择性④对流动相PH值的控制通常采用缓冲溶液来实现。、流动相的离子强度四、离子交换色谱的影响因素、填料孔径的影响、柱长的影响、流速的影响、PH值的影响无论在强的还是弱的阴离子交换柱上蛋白质均显示不同PH值影响结果因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。、离子强度的影响第八节体积排阻色谱法一、分离机理、体积排阻色谱法(SEC)或空间排阻色谱法(SEC)或凝胶色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)Sephadex葡聚糖凝胶、凝胶渗透色谱法(GPC)、空间排斥理论①②V死体积相当于凝胶的粒间体积Vs色谱柱中凝胶的孔穴总体积二、体积排阻色谱法的特点三、体积排阻色谱法的固定相(一)固定相的分类、按固定相基质分类、按固定相机械强度分类(二)凝胶固定相的特性参数、渗透极限、分离范围、固流相比在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为固定相而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为流动相而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积的比值称作固流相比。、柱效(三)凝胶色谱柱的制备及谱图的特点(三)凝胶色谱柱的制备及谱图的特点①物理因素影响凝胶色谱柱的性能②扩大分离范围使用两根以上的串联色谱柱。③更换流动相谱图的特点:在凝胶渗透色谱中对不同分子量聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。①在低效排租色谱法样品分子大小随V的增加而急剧减小而柱效却随样品分子量的增加而增大因此在色谱图上不同分子量组分的谱带宽度保持不变。②在高效排租色谱法峰宽却是个变量。四、体积排租色谱法的流动相在体积排租色谱法中流动相的性质对保留值和分离选择性无影响。①溶解样品的良溶剂②低黏度溶剂③柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀④控制流动相的PH值和离子强度⑤凝胶渗透色谱示差折光检测器流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。凝胶过滤色谱紫外吸收检测器使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。(一)凝胶渗透色谱的流动相凝胶渗透色谱常采用甲苯四氢呋喃和氯仿等有机溶剂作流动相。在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中四氢呋喃是最常用的流动相它对样品有良好的溶解性能和低的黏度并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀因此被优先推荐使用。(二)凝胶过滤色谱的流动相在凝胶过滤色谱中使用以水作基体具有不同PH值的多种缓冲溶液作流动相。五、体积排租色谱的影响因素、填料①化学键合的硅胶②亲水树脂凝胶、柱长体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。、洗脱液①以硅胶为基质的填料PH值范围在。②键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离子的反应。a)洗脱液离子强度低时b)洗脱液离子强度低增加到molLc)常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节d)用氯化钠作离子剂疏水作用最小e)PH值不能太低因为H会腐蚀不锈钢柱、流速蛋白质分离时流速对分离度的影响是一个很重要的因素一般在低流速下蛋白质分离是比较理想。、样品容量进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的分离度。样品的浓度范围一般在最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积的比较合适。、蛋白质在变性条件下的分离①变性溶剂如molL盐酸胍、molL脲、十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白质的分子量。②在变性溶剂中柱的分离范围因此而移到低分子量范围内。示例:用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)衍生物的相对分子量rhTNF属基因工程药物其相对分子量的测定是该药质量控制的主要指标之一。仪器与色谱条件:岛津LCAHPLC色谱柱:BeckmanUltraspherogelSEC(cm×cm)流动相mmolLKHPO:mmolLNaSO(:)NaN流速:mLmin检测波长:nm标准蛋白相对分子量曲线的制备:选用四种蛋白:醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐酶及抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等因素对保留时间T的影响而选用了内标法、既在混合标样中加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内标进样后可同时测的完全排阻和完全进入填料孔的两种内标的保留时间T和Tt用分配系数Kd对相对分子量对数作图从而保证结果有良好的重现性。样品测定:根据样品的保留时间T求出其分配系数Kd由Kd从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr计算相对分子质量。第九节亲合色谱法亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用从复杂生物样品中分离和分析特殊物质的一种色谱方法。亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键形式与不溶性载体连接作为色谱介质高选择性地吸附分离具有生物活性的物质它将传统亲合色谱的专一性与HPLC的快速稳定检测方便等优点结合起来。一、亲合色谱分离机理亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合复合物形成及其解离的过程。载体LX配基待分离物质通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的组分洗脱下来:a)如果亲合复合物的亲合力不强b)当配基与被分离组分的亲合力较强c)非常紧密地结合在固定相配基上的物质洗脱配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低也不宜太高。太低专一性太差太高则洗脱困难。R:结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力K:复合物的离解常数L:固定化配基的浓度二、亲合色谱的固定相亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支对于生物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲如果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基就可以建立一种亲合色谱方法用于分离与配基相对应的物质。、有机高分子类:多孔的硬质凝胶交联聚苯乙烯交联聚甲基丙烯酸酯亲水性高聚性等树脂。优点①具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性广泛的PH值的适应性②对于生物大分子样品都有较好的相溶性。③填料容易合成、无机基质①多孔硅胶②可控孔径玻璃、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱的特点①可以提高效率还可以改善回收产物纯度和浓度②检测灵敏度得以大幅度提高③具有更高的选择性④配基结合的牢固性也可以延长填料的寿命并提高产物的质量这对生物工程的分离、纯化工作是非常有利。三、亲合色谱影响因素、平衡和平衡缓冲溶液选择平衡缓冲溶液所具有的PH值离子强度温度和化学组成都应使配体与蛋白质之间能发生比较强的相互作用。、蛋白质的浓度和温度效应①对亲合力一般或较高的蛋白质其互补酶的浓度对亲合容量的影响不明显柱顶端结合的大分子与最初加入的大分子浓度无关。②温度效应在亲合色谱中非常重要因为亲合填料吸附作用的强度随温度升高而降低。、特异性洗脱通常选用对纯化的活性分子有高的亲合力但其结构与填料上的配体不同的配体来洗脱这样就保证了吸附和洗脱双重特异性使非特异性洗脱减少到最小程度。、非特异性洗脱非特异性洗脱主要受缓冲溶液中的PH值离子强度温度和介电常数的控制。第十节色谱分离方法的选择一、相对分子量①分子量>凝胶色谱柱②分子量<但同时分子量相差>凝胶色谱柱③分子量<的水溶性电解质酸性物质用阴离子交换树脂碱性物质用阳离子交换树脂④分子量<的水溶性非电解质选用反相色谱法⑤分子量<的非水溶性物质弱极性物质选用反相色谱法极性物质选用正相色谱法。二、溶解度三、化学结构

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