resistin基因过表达影响3T3-L1脂肪细胞的脂质代谢

resistin基因过表达影响3T3-L1脂肪细胞的脂质代谢万方数据中华医学遗传学杂志20ar7年6月第24卷第3期chiIlJMedG∞et，Jlme200r7，V01．24，No．3 基因的3，13．L1前体脂肪细胞株为研究工具，观察了 resistin基因过表达对脂肪细胞脂质代谢功能以及与葡萄糖摄取密切相关的葡萄糖转运体4基因(duc0∞ t啪sporter4，说∥群)表达的影响。 1材料与方法 1．1 材料3B．L1前体脂肪细胞株由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所廖侃教授馈赠。 DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司，胎牛血...

万方数据中华医学遗传学杂志20ar7年6月第24卷第3期chiIlJMedG∞et，Jlme200r7，V01．24，No．3 基因的3，13．L1前体脂肪细胞株为研究工具，观察了 resistin基因过表达对脂肪细胞脂质代谢功能以及与葡萄糖摄取密切相关的葡萄糖转运体4基因(duc0∞ t啪sporter4，说∥群)表达的影响。 1材料与方法 1．1 材料3B．L1前体脂肪细胞株由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所廖侃教授馈赠。 DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司，胎牛血清(fetalbovinesemm，FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰岛素、地塞米松、1．甲基3．异丁基黄嘌呤(MⅨ)购自美国si靴公司，油红0染料购自上海化学试剂厂。pcDNA3．1B真核表达载体为美国Invit— rogen公司产品，限制性核酸内切酶勘mHI、‰I及 T4DNA连接酶为日本TaKaRa公司产品，JMl09感受态细胞购自美国№ga公司，胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉为英国unipath公司产品，高纯度质粒抽提试剂盒及F蝉ne6转染试剂购自德国RDche公司。 Westem印记试剂中，小鼠6×His单克隆抗体为美国 BD公司产品，Ⅲ讲标记的抗小鼠IgG单克隆抗体为美国№鼬公司产品，EcL显色试剂购自瑞典舢ner． sh姗公司，低分子量蛋白质Marker购自日本TaKaRa 公司，蛋白酶抑制剂为美国№ga公司。RBP由上海生工生物工程有限公司合成(95％纯度、10Illg)。逆转录PCR(reverset瑚8cription—PCR，RBPCR)实验试剂中，Tdzol为美国Invitmgen公司产品，椰、Oligo(dT) 15蹦111er、M．MLv逆转录酶为美国PIDme朗公司产品， Ex—Taq酶、DNAMarkerD也000购自大连宝生物工程有限公司，二乙基焦碳酸乙酯(DEPc)、琼脂糖、RNasin购自上海生工生物工程有限公司，引物由美国InvitIo辨n 公司合成。 1．2方法 1．2．1，resistin基因过表达3B．Ll前体脂肪细胞株的获得采用RT．PCR法扩增大鼠resistin基因全编码区 cDNA片段，所用引物序列如下，上游引物：砌nHI5’． GCAGGATCCATGAAGjAACCl眦A卫37，]i沩芋．j口砷I5’一 TATCTCGAGCGGGAACCAACCCGC．3’，产物大小362bp，眈mHI和‰I双酶切后插入pcDNA3．1B表达载体。转化JMl09感受态大肠杆菌后挑单克隆测序鉴定，测序正确后抽提质粒转染3耶．L1前体脂肪细胞， G418筛选稳定表达细胞株后westem印记验证resistin 蛋白表达。 1．2．2 3耶．L1脂肪细胞的培养与诱导分化根据 3，13．L1细胞培养和诱导分化方案【引，采用含10％胎牛血清、100u／mL青霉素、100u／mL链霉素的DMEM完全培养液，在37℃、5％c02培养箱中生长，每两天换液一次，待细胞生长至完全融合后两天(Davo)，加入o．5 蝴l／LMⅨ、5彬HlL胰岛素和1坪彬L地塞米松(诱导分化剂I)诱导分化。两天后(Dav2)换用仅含5 肛∥mL胰岛素的完全培养基(诱导分化剂Ⅱ)，再两天后(Dav4)换完全培养基，以后每两天换液一次直至第 10d细胞完全分化成熟。在脂肪细胞诱导分化不同时段，分别收集细胞，一70℃冻存备用。 1．2．3油红0染色鉴定3r13一L1脂肪细胞的分化油红O染料经异丙醇溶解后过滤，置4℃备用。取第0、 2、4、8d的细胞，先用O．01moL／LPBS洗2遍，加入2～ 3IllL中性3．7％甲醛(10％福尔马林)室温下固定2 IIlin，再用三蒸水洗净弃去上清，加入油红O染液室温下染色1h，三蒸水洗至背景透明。显微镜下观察，可见胞浆中脂滴呈圆形亮红色。 1．2．4 RT-PCR检测脂肪细胞分化标志基因及说坍￥基因的表达住zol一步法提取3r13．L1细胞的总RNA，经电泳显示28S、18S和5S清晰3条带，测定 A260／A280比值大于1．8。定量后取总RNA1腭，以Oligo (dT)15为引物进行逆转录反应，反应体系20肚L。取逆转录产物l皿为模板进行PCR扩增，PCR反应体系 20止。95℃预变性5r11in，94℃变性30s，58℃退火， 72℃延伸35s，循环，72℃终末延伸7Inin。所用引物及 PCR反应条件见表1。所选用PCR反应的模板量及循环数均使PcR产物量位于反应曲线的线性范围内。 PCR产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳后，以uvP凝胶密度扫描仪对各基因和8．actin基因特异性扩增产物的电泳条带进行密度扫描，用Labwork3．o软件分析电泳条带密度值，基因mRNA的表达水平以该基因条带密度占8一actin基因条带密度的百分率表示。 1．2．5脂肪细胞内甘油三酯(triglyceride，TG)、游离脂肪酸(kefattyacids，m～s)含量的检测收集分化第 10d的成熟脂肪细胞，裂解细胞，收集胞内蛋白，全自动生化仪比色法检测脂肪细胞内TG、m～s含量。 1．3统计学处理数据以均数± 标准差(菇±s)表示，并采用SPSSll．0统计软件进行数据整理和统计。两小样本均数之间的比较，经方差齐性分析F检验后，选择￡或￡’检验。P0．05)，与正常脂肪细胞中的表达水平差异也无统计学意义(P>0．05)(表2)。 3讨论脂肪细胞是一个高度特异的细胞类型，由起源于胚胎干细胞的前体脂肪细胞通过一系列有序的分化过程形成[6|，成熟的脂肪细胞通过对脂质代谢和糖代谢图2 resi鲥n基因过表达对3T3一u脂肪细胞分化的影响(×10)a：正常3．13一L1细胞．b：大鼠resi出n313。Ll细胞 F电．2『Ille胡础ofresis妇∞rⅢ印ressionoⅡt}le删h∞tiationof3，13·L1adjpocytes(×lO)．a：n0珈flal3r13一Ll；b：Iat-esistin3|13-Ll 万方数据 Q > 三。卜中华医学遗传学杂志20Cr7年6月第24卷第3期c}linJMedGend，June2007，v01．24，N0．3 0d 1．1473±0．0790．7318±0．087

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