志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity医用分子生物学实验技术青海大学医学硕士研究生课程志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity重组DNA技术操作步骤志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity 基本原理志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity 主要步骤：①制备目的基因和选择相关载体②目的基因和有关载体进行连接③重组的DNA导入受体细胞④DNA重组体的筛选和鉴定⑤DNA重组体的扩增、
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
达和其他研究志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity以质粒为载体的DNA克隆过程*志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity（三）PCR扩增特定基因（四）人工合成一、目的基因的获得——分（一）从基因组文库中获得（二）从cDNA文库中获得志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因*志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity 从cDNA文库获取目的基因*志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity几种常用克隆载体的比较注：+表示可用；-表示不可用比较内容质粒λ噬菌体黏性质粒M13噬菌体克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因组DNA文库-++-cDNA文库++--亚克隆+--+序列分析++-+E.coli表达++--二、载体的选择与准备——选志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity三、DNA分子的体外连接——接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity（一）黏性末端志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity（二）人工接头志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity（三）加入同聚体尾待克隆DNA片段重组质粒混合、退火空白质粒志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity（四）平端连接志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity载体DNA目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´3´A(A)nAA(A)nAλ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTP5´3´5´志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity四、外源DNA导入宿主细胞——转 受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent) 导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。五、目的基因的筛选和鉴定——筛志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity1.借助载体上的遗传标志进行筛选(1)利用抗生素抗性标志筛选(2)利用基因的插入失活/插入表达特性筛选(3)利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选2.序列特异性筛选(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸杂交法(4)DNA测序法志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity（一）遗传学方法1.插入灭活法志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity插入失活筛选带有重组载体的克隆志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity2.蓝-白筛选（α互补）许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lacZ基因灭活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversityα互补筛选（蓝-白筛选）志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversity志比昆仑学竞江河青海大学QinghaiUniversityPCR产物的T载体克隆和转化实验目的：学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。实验要求：掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。技术应用：目的基因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因的目的。 材料：目的基因片段（回收的PCR产物） 药品：pEMGT-Vector(Promega公司) 质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。质粒载体 克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。 基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。实验原理 普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A； T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有一个单链状态的T； 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。载体结构的三大要素：多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位pGEM-T载体的结构pGEM-TEasy载体的结构实验步骤（1）目的片段的制备--胶回收法回收PCR产物：(2)连接实验：在0.2mlPCR管加入以下试剂：目的片段（100ng/ul）3μlpGEM-TEasy（50ng/ul）1μlT4DNALigase1μl2×RapidLigationBuffer5μlTotal10μL 备注：混合均匀，瞬时离心。4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。说明1.回收DNA片段可以用沉淀法，但是只适用于PCR扩增产物为单一片段，而且需要
检测
工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训
PCR扩增结果后进行；2.此种连接方法是根据普通Taq酶会在3´末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的Taq酶会自动切除末端的A，所以，这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。3.T-载体的阳性克隆筛选同样可以使用“蓝白斑”法，方便，快捷。***
浙公网安备 33021202002483