能源植物乌桕快速繁殖与转基因技术研究

湖北大学本科毕业论文( 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ) 湖北大学本科毕业论文(设计) 湖 北 大 学 本 科 毕 业 论 文（设 计） 题 目 能源植物乌桕快速繁殖与转基因技术研究 姓 名 金亮 学 号 2005221107210014 专业年级 2005级生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 指导教师 陈永勤 职 称 教授 2009年5月 8日 目 录 11 前言 1.1 新能源开发的重要性 1 1.2 乌桕简介 1 1.2.1 乌桕的生物学特性 1 1.2.2 乌桕的开发利用价值 2 1.3 有关乌桕快速繁殖及转基因技术的研究进展 2 1.4 本课题的研究意义 2 2 材料与方法 3 2.1 试验材料 3 2.1.1 乌桕成熟种子及组培苗 3 2.1.2 质粒和农杆菌菌株 3 2.2 仪器与药品 3 2.3 种子的无菌萌发 3 2.4 茎段离体再生培养 4 2.5 乌桕愈伤组织的转基因 4 2.5.1 农杆菌菌液的制备 4 2.5.2 乌桕愈伤组织的准备 4 2.5.3 农杆菌的侵染 4 2.5.4 共培养 4 2.5.5 选择再生 4 2.5.6 转基因的检测 4 2.6 培养基 4 2.7 培养条件 4 3 结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 5 3.1不同激素组分对乌桕种子无菌萌发的影响 5 3.2 不同激素组分对茎段离体再生培养的影响 6 3.3 转基因结果 7 4 讨论 8 参考文献 10 致 谢 11 能源植物乌桕快速繁殖与转基因技术研究 摘 要 乌桕是我国的传统能源植物，其种子富含油份，是制备生物柴油的重要原料之一。本文研究了乌桕种子的萌发技术、离体再生技术和乌桕转基因技术。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明：无激素或低浓度（0.5～1.0mg/L）BA的培养基均适合进行乌桕种子的无菌萌发，其中以无激素培养基为最佳；0.2mg/L的BA对侧芽形成、伸长，而1.0 mg/L的KT对侧芽形成的促进效果也相当高，到达最高的72.7%的侧芽生长率，但对侧芽伸长的促进效果不佳；通过农杆菌介导进行乌桕转基因方面，在相同条件下，乌桕子叶外植体形成不定芽的能力比下胚轴和胚乳形成不定芽的能力要差得多。初步检测表明目的基因可以转入乌桕细胞中去。 【关键词】 乌桕 种子萌发 茎段外植体 离体培养 农杆菌介导的转基因 Rapid multiplication and transgenic research of the energy plant Sapium sebiferum Abstract Sapium sebiferum is a tradiditonal energy plant, whose seeds contain rich oils that may be used to produce biodiesel. Experiments on seed germination , in vitro plantlet regeneration and Transgenic research of Sapium sebiferum were carried out. The results showed that Hormone-free or low-concentration (0.5 ~ 1.0mg / L) BA medium were suitable for the aseptic Sapium seed germination, which is the best medium without hormone; 0.2mg / L of BA medium is the best medium for the lateral bud formation, elongation and callus formation at the bottom of the promotion of better, and 1.0 mg / L of KT on the promotion of the effect of lateral bud formation is quite high, reaching the top of the 72.7% rate of lateral bud formation, but the promotion of lateral bud elongation ineffective; through Agrobacterium-mediated gene transfer to discolor, it was difficult to induce the cotyledon explants to initiate adventitious buds on the tested culture media. Preliminary testing showed that gene can be transferred to Sapium cells. 【Key words】 Sapium sebiferum seed germination stem explants in vitro culture Agrobacterium-mediated genetic transformation 1 前言 1.1 新能源开发的重要性 自20 世纪90 年代以来，新能源的开发和发展很快，世界上许多国家都把开发新能源作为能源政策的基础。当前，各国石油界均加强了新能源的开发利用，并取得了显著成效。对新能源的研究与开发范围包括太阳能、风能、地热能、海洋能、天然气、沼气资源、水能、地热、氢能和核能等等，这类资源具有可再生、潜力巨大及利于环保等特点。 具体地讲，新能源分为非再生能源(如核能)和可再生天然能源(太阳能、地热能、风能、海洋能及非天然生物能源等)。可再生能源可分为传统可再生能源和新可再生能源，前者主要指大中型水电和生物质能直接燃烧产热；后者包括小水电、生物质能新技术利用、太阳能、风能、地热、海洋能等[1]。 在新能源中，生物质能源是未来最重要的能源形式之一。生物质能是我国仅次于煤的第二大能源，占全部能源消耗总量的20%。生物质能源是通过种植含有大量能源的植物、并对这些植物进行加工转换而生产出的电力、气体或液体燃料等二次能源。植物能源有许多优点：一是不形成有害物质, 没有污染。据研究，利用绿色植物生产出的生物柴油不含硫化物，因此不会形成酸雨现象；另外它还可以借由生物分解，避免对土壤、地下水的污染。二是植物能源具有可再生性。矿质燃料是经过漫长的地质历史时期形成的, 是不可再生资源, 而植物则是可再生的, 只要管理得当是可以实现持续稳定供给的。三是投资少。植树种草的投资比水电投资要少得多。四是分布范围广。地球上植物能源的分布范围远远超过矿物能源的分布范围。同时据专家测算, 目前全世界植物能源的生长量, 每年相当于600～800 亿吨石油, 而石油开采量每年只有30 亿吨, 后者仅是前者的1 / 20 ～1 / 27。由此可见, 植物能源的前景非常广阔，发展植物能源对我国这样的农业大国意义深远。 能源植物作为生物质能源的主要原料，其种类较多，且分布很广。其主要集中在夹竹桃科、大戟科、菊科以及豆科等，像我们熟知的岫莱、蓖麻、麻疯树、乌桕、大豆、花生等。这些原料在我国均为优势资源,其中木本油料植物为我国最理想的能源植物。它们适合山地种植，不与农业争地，不影响粮棉油等生产，而且一次种植可以多年受益。本研究涉及到的能源植物乌桕便属于木本油料植物，其随着人们对新能源的重视也得到了进一步的开发利与用。 1.2 乌桕简介 乌桕[Sapium sebiferum (L) Roxb]，又名木蜡树、木油树、木梓树、虹树、蜡烛树，为大戟科乌桕属落叶乔木。其树冠整齐，叶色秀丽，入秋后红艳美观不亚于丹枫；冬天白色的种子簇生枝头经久不落，也很美。它不仅是一种观赏风景树，而且还可被建造成效益较高的经济林。 在我国历史上，乌桕被作为重要油料树种，有千余年的栽培历史。乌桕主要产于我国秦岭、淮河流域以南，东至台湾，南至海南岛，西至四川中部海拔1000m以下，西南至贵州、云南等地海拔2000m以下，主要栽培区在长江流域以南的浙江、湖北、四川、贵州、安徽、云南、江西、福建等省。 1.2.1 乌桕的生物学特性 ① 气候要求。 凡年平均气温15 ℃以上，年降水750 mm以上的地方均可生长。但在年平均气温16～19 ℃，年降水1 000～1 500 mm的情况下，生长更好。 ② 土壤要求。 乌桕对土壤适应性较强。红壤、黄壤、黄褐土、紫色土、棕壤都可生长，土壤质地从沙土到粘土都能适应，甚至钙质土、酸性、中性、微碱性土都行，适应pH值5～8 ，具有一定的抗盐性，也能抗氟化氢。 ③ 海拔。 海拔800 m 以下地区均能生长，但海拔300～400 m生长较好。 ④ 生长发育及形态特征。 乌桕属速生树种， 喜光，1 年生实生苗高可超过1 m，一般10年生树高8～10 m，胸径14～18 cm，5～8 年开始开花结果，盛果期10～50 年，树的寿命可达100 年以上。开始结果后，树体生长减慢，70 年后，结果很少。乌桕果实6～7 月形成，8～10 月为果实旺盛生长期，11 月以后果实呈白色时，便可采摘。 乌桕根系发达， 花单性，雌雄同株。树高可达15 m，胸径60 m。树冠近球形，枝细小；叶菱形或者菱状卵形，先端突渐尖，基部宽楔形，全缘；叶柄细长，顶端有2腺体；花序顶生，花黄绿色，花期5-7月果熟期10-11月；果扁球形，黑褐色，熟时开裂；种子黑色，外被白蜡，宿存在果轴上经冬不落。 ⑤ 抗性。 乌桕特别耐水湿，水灾时全淹没3～4 个月仍未淹死，其耐水淹程度超过柳树。 1.2.2 乌桕的开发利用价值 在我国历史上，乌桕是重要油料树种，其油常常作为照明用。其种籽的主要用途用于香皂、蜡纸、蜡烛、油漆、油墨等相关行业[2-11]。 而现如今，乌桕的利用价值被开拓得更为广泛。其中，乌桕被作为化工原料的开发受到了广泛的重视。乌柏作为重要的木本油料树种，包含两种类型的油皮油和梓油， 皮油是从柏蜡中提取的固体油，梓油是从种仁中提取的液体油，种子含油率达41% 以上，每100 公斤种子可出皮油25～26 公斤，梓油16～17 公斤[11]，曾经被日本科学家誉为“ 绿色原子弹”，因此乌桕可作为重要的生物柴油原料树种。 此外，乌桕的开发与利用在材料价值、药用价值、观赏价值及制作食品等方面都有所体现。随着科学技术的发展，乌桕的开发利用将更加深入广泛，已引起世界一些国家的关注，在我国合理开发利用乌桕资源，具有广阔的前景。 1.3 有关乌桕快速繁殖及转基因技术的研究进展 目前，在乌桕繁殖及转基因研究领域，国内外都有所涉及。近年来，由于乌桕在生物能源方面的巨大应用潜力，国内各地政府越来越重视乌桕的研究、生产和利用。2006年福建省开展了“乌桕作为生物能源树种开发利用的研究”的重大工程，2007年湖北省林业局设立了“乌桕新品种选育与快繁技术及集约化经营技术研究与示范”的科技专项。有关乌桕的栽培技术和种子繁殖与扦插繁殖技术也有一些报道，如骆琴娅用 IBA和PP333进行了乌桕扦插试验，结果表明IBA 1000倍液对乌桕生根有良好的促进作用[12]；宋建伟等研究表明600mg/L GA处理乌桕种子后，经低温处理 (5℃)30 d后，乌桕种子可通过生理休眠，萌发率和发芽势最好[13]；周兰英[14]、于芳雷等[15]、张其霞[16]等对乌桕的无性繁殖技术也进行了研究。国外方面，关于乌桕高效离体再生培养方法的研究也有所进展。 综上，国内外已对乌桕的研究做了不少的工作，但这些工作主要集中在资源调查和品种快速繁殖方面，有关利用转基因技术改良乌桕遗传性状的研究尚数不多。 1.4 本课题的研究意义 随着世界油荒的进一步加剧, 生物柴油作为矿石柴油的替代品逐渐成为关注的焦点。欧美各国、日本通过出台各种优惠政策积极扶持与发展生物柴油产业，我国于2005年2月28日出台了《可再生能源法》。生物柴油具有可再生，环境友好，安全的特点，并且作为国家的战略储备物质，在国家的长远发展中，具有重要意义。 生物柴油产业发展方兴未艾，而原料是其产业发展瓶颈，成本的75%来自于原料。乌柏作为重要的木本油料树种，其种子的出油率相当高，再加上由于梓油转化为生物柴油的工作已经取得重要进展，所生产的生物柴油质量好，并已获得了专利（CN200510082921.8 乌桕油制备生物柴油的生产技术），因此乌桕将成为我国重要的生物柴油原料树种之一。如之前所述，乌桕主根发达，对气候、海拔及土壤要求不高，属速生树种，种子出油率高等，这些特性都为将其作为生物柴油原料进行大规模种植创造了条件，然而在作为生物柴油原料进行生产时又面临着一个重要问题。由于自然变异率低，从自然变异体中进行选择新品种的效率是非常很低的。众所周知，乌桕的营养生长期比较长，从种子播种到开花结果一般需要6-8年，且通过杂交育种的方法来提高乌桕种子产量和含油量、改善油脂品质、提高其抗病抗虫能力等工作十分漫长。因此，乌桕的常规育种无法满足规模化栽培对优良乌桕品种的需求，这对大规模快速生产生物柴油带来不便，如何快速大量繁殖乌桕的优良品种，从而提供生产原料已经成为我国生物柴油产业化发展的瓶颈。 植物转基因技术可以快速、定向改变植物的遗传性状，且目前已经在一些重要农作物上得到了成功的应用，取得了巨大的经济效益和社会效益。本课题的研究目的就是通过植物转基因技术，对乌桕的遗传性状进行改良，如在乌桕细胞中导入早花基因来缩短开花所需时间，或导入多脂基因进一步提高出油率等，然后再通过植物组织培养技术快速大量繁殖该优良品种，从而使生物柴油生产中原材料供应问题得以解决。因此对乌桕快速繁殖与转基因技术的研究具有重要意义。 2 材料与方法 2.1 试验材料 2.1.1 乌桕成熟种子及组培苗 供试的乌桕（Sapium sebiferum (L) Roxb）成熟种子由湖北省林业科学院提供，组培苗由本实验室将乌桕胚轴进行诱导再生而形成。 2.1.2 质粒和农杆菌菌株 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105含有pCAMBIA-PNN-35S-AP1-Tnos植物表达载体（图2.1）。该载体含拟南芥花芽原基决定基因AP1、卡那霉素抗性基因（NPTⅡ）和报告基因（GUS）；这些基因均由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动。 图2.1 pCAMBIA-PNN-35S-AP1-Tnos植物表达载体结构示意图 LB：T-DNA左边界；35S：花椰菜花叶病毒35S启动子；AP1：拟南芥花芽原基决定基因；NPTⅡ：卡那霉素抗性基因；GUSplus：含内含子的β-葡糖醛酸酶基因（即报告基因）；RB：T-DNA右边界。 2.2 仪器与药品 高压蒸汽灭菌装置，超净工作台，电子天平，去离子水净化器，pH计，移液枪和各种分析纯或优级纯的化学试剂。 2.3 种子的无菌萌发 首先去掉乌桕干种子外部的蜡质层和果壳，然后将种子用纱布包裹放入75% 的酒精中浸泡2～3分钟，然后再在盛有添加了4～6 滴Tween和20% NaOCl溶液的锥形瓶中消毒30-45 min，期间摇动锥形瓶数次。消毒结束后用无菌水对种子冲洗5～6 遍，然后将种子从纱布里取出，分别接在植物激素BA和NAA不同组合的培养基中进行种子的无菌萌发（每瓶5～7 粒），找出最适萌发条件并为之后的转基因研究提供材料。其中，以MS培养基作为基本培养基，植物激素按照表3.1进行组合。 2.4 茎段离体再生培养 将实验室中通过胚轴诱导再生而成的乌桕幼苗用于该部分的研究。 先将组培苗的茎段切下，以带1~2 个侧芽的茎段、茎尖做外植体，每节长1～2 cm，再将外植体接入在以1/2 MS为基本培养基，BA或KT为植物激素的培养基上进行无菌培养，对照比较出最适再生条件，其中植物激素BA与KT按表3.2进行组合。 2.5 乌桕愈伤组织的转基因 2.5.1 农杆菌菌液的制备 将含有pCAMBIA-PNN-35S-AP1-Tnos的农杆菌EHA105菌株的单菌落接种在约3ml YEP培养基（加50 mg/L卡拉霉素和50 mg/L利福平），在28℃下于摇床上培养36h， 摇床转速为200rpm。当试管中菌液浑浊时，取1ml浑浊的菌液于盛有50ml YEP培养基（加50mg/L卡拉霉素和50 mg/L利福平）的250ml三角瓶中，在28℃下于摇床上培养至O.D600=0.8。将菌液倒入无菌的离心管中，于4℃下、5000 rpm离心12 min。倒出上清夜，用MS0 + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA的液体培养基来悬浮菌体，再在4℃下、5000 rpm离心12min；倒出上清夜后，再用同样的液体培养基悬浮菌体，备用。 2.5.2 乌桕愈伤组织的准备 将先前无菌萌发得到的幼苗上的子叶和胚轴切成小片或小段，每段长0.5～1.0 cm，再将胚轴小段径向切开，然后将它们接入盛有MS0 + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA液体培养基的平板中，备用。 2.5.3 农杆菌的侵染 将准备好的农杆菌菌液倒入上述平板中，完全淹没子叶片和胚轴，约30 min，期间摇动数次。 2.5.4 共培养 侵染结束后，将平板中的子叶片和胚轴转到准备好的无菌吸水纸上，吸去多余液体，然后再将子叶和胚轴转接到分别盛有MS + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA + 100 (M AS和MS + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA + 200 (M AS培养基的平板上，密封，于25℃、弱光条件下培养3天。 2.5.5 选择再生 共培养3天后，将平板中的子叶转移到分别盛有MS + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA + 10 mg/L Kanamycin + 100 mg/L Timentin + 100 (M AS和MS + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA + 10 mg/L Kanamycin + 200 mg/L Timentin + 200 (M AS这两种再生培养基的锥形瓶中；将茎段转移到分别盛有MS + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA + 10 mg/L Kanamycin + 100 mg/L Timentin + 100 (M AS + 1.0 mg/L 活性炭和MS + 1.0 mg/L BA + 0.2 mg/L NAA + 10 mg/L Kanamycin + 200 mg/L Timentin + 200 (M AS + 1.0 mg/L 活性炭这两种再生培养基的锥形瓶中，均置于25℃、光照下培养，注意观察 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 材料上不定芽的形成及生长情况。 2.5.6 转基因的检测 将在选择再生培养基上形成的部分愈伤组织浸在GUS染色液中，于37℃下保温12小时。GUS染色液的组成为100 mM 磷酸缓冲液 (pH 7.0)， 10 mM NaEDTA， 0.5 mM K3Fe(CN)6， 0.5mM K4Fe(CN)6，0.1%TritonX-100，1mg/LX-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid)。染色结束后，愈伤组织经95%乙醇和70%乙醇分别脱色后，再观察愈伤组织的染色情况。 2.6 培养基 供试培养基以MS或1/2MS为基本培养基，蔗糖 20 g／L、琼脂 8 g／L、活性炭 1 g／L。选用植物激素分别是：乙酰丁香酮（AS）、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、6_糠氨基嘌呤(KT)等。调培养基pH值调至5.7左右，在121℃， 1.1 kg/cm2压力下高温高压灭菌20分钟。 2.7 培养条件 所有培养均在培养室中进行，培养室温度为24～26 ℃，光照强度为2000 Lux，光照时间为16 h/d。 3 结果与分析 3.1不同激素组分对乌桕种子无菌萌发的影响 本试验于2月底开始，经去壳消毒的乌桕种子接入不同激素组合的萌发培养基中，5天后，部分种子明显变大、胚乳裂开，少数种子的子叶和下胚轴有少许伸长；10天后，大部分胚的胚根都已伸入培养基中，子叶展开，大部分种子都萌发正常形态的幼苗（如图3.1）。但从表3.1 可以看出不同激素组合的培养基中，种子的萌发率及幼苗的长势都有所差异，经观察统计，以MS培基养上的幼苗长势最好，且发芽率达到87.5%以上。 图3.1 去壳的乌桕种子在无激素的MS培养基上无菌萌发 表3.1 不同激素组分对乌桕种子无菌萌发的影响 激素浓度(mg/L) 接种数 萌发数 污染数 萌发率 (%) 幼苗生长势 BA NAA 0.0 0.0 28 24 0 85.7 + + + + 0.5 0.0 28 23 0 82.1 + + + 1.0 0.0 28 22 0 78.6 + + + 2.0 0.0 27 25 0 92.5 + + 5.0 0.0 27 24 0 96.0 + + 0.5 0.2 28 21 0 75.0 + 1.0 0.2 27 22 0 81.5 + 2.0 5.0 0.2 0.2 28 26 23 18 0 0 82.1 69.2 + + 注：培养时间为10 天； 萌发率（%）=幼苗数 / 接种的种子数 ×100 从表3.1不难看出，植物激素BA对种子的萌发率影响不大。培养基中不添加任何激素的情况下，萌发率达到85.7%， BA浓度在2.0或5.0 mg/L的情况下甚至达到了90%以上。从数据显示，不同浓度BA刺激下，萌发率的变化没有很明显的规律，总体上植物激素BA对萌发影响不大，但考虑到芽的生长情况，可以发现无激素的情况下 ，芽的伸长及生根等情况相对其他培养基而言较为显著，其长势最好，在低浓度BA（0.5～1.0mg/L）情况下，芽的生长势也较好；当BA与NAA同时作用下，不仅种子的萌发率下降，且芽的生长情况也较差，总体上不如无激素或含低浓度BA的培养基。综上所述，无激素或低浓度（0.5～1.0mg/L）BA的培养基均适合进行乌桕种子的无菌萌发，其中以无激素培养基为最佳，而BA与NAA的组合培养基不适合其种子萌发。 3.2 不同激素组分对茎段离体再生培养的影响 该试验于3月初开始进行，主要研究了BA和KT植物激素对乌桕茎段离体再生培养的影响。培养50d的结果见表3.2。 表3.2 不同激素组分对茎段离体再生培养的影响 激素浓度(mg/L) 接种茎段数 侧芽生长率（%） 新幼茎平均节数 生根率(%) 愈伤组织形成率(%) BA KT 0.0 0.0 19 44.4 2.8 55.6 0.0 0.2 0.0 16 62.5 3.0 0.0 100.0 0.5 0.0 23 55.0 1.6 0.0 80.0 1.0 0.0 17 54.5 2.0 0.0 91.7 2.0 0.0 21 44.4 1.3 0.0 33.3 0.0 0.2 32 34.5 2.5 55.2 0.0 0.0 0.5 29 48.3 2.1 31.0 6.9 0.0 0.0 1.0 2.0 27 29 72.7 39.3 1.9 2.1 22.7 7.1 22.7 46.4 注：培养时间为50天；新幼芽平均节数=总节数 / 侧芽数 侧芽生长率（%）=形成侧芽的茎段数 / 接种茎段数×100； 生根率（%）=生根的茎段数 / 接种茎段数×100； 愈伤组织形成率（%）=形成愈伤组织的茎段数 / 接种茎段数×100； 从表3.2可以发现，在无任何激素的培养基中，茎段侧芽生长率为44.4%，在加了低浓度（0.2～1.0 mg/L）BA的情况下，对侧芽形成均有促进作用，其中以0.2 mg/L浓度的BA促进效果最好，但随着浓度的递增，效果逐渐递减，当浓度达到2.0mg/L时，其相对无激素的情况而言，对茎段侧芽的生长无任何促进作用。在新幼芽伸长方面，无激素和低浓度（0.2mg/ L）BA培养基中，侧芽伸长情况较好，但随着BA浓度的增加，BA对侧芽有抑制作用，伸长情况不好；在生根率方面，BA的作用强烈抑制了茎段底部的生根；而低浓度（0.2～1.0mg/L）BA对茎段底部颗粒状绿色愈伤组织的形成有较强的促进作用。总体上，对茎段的离体培养，BA的浓度以0.2mg/L为最佳，其侧芽生长和伸长情况最好，增值效果最佳。同样的，在KT激素刺激下，较低或过高浓度的KT对侧芽的形成均没有太大 的效果，只有当KT浓度为1.0mg/L时，才有显著促进作用，能达到72.7%的最高侧芽生长率，但KT对新幼芽伸长的影响作用均不大，1.0mg/L的KT作用下伸长情况也不是很好，但KT对茎段底部生根的抑制作用不像BA那样强烈，相对无激素情况的培养基，低浓度KT对生根没有太大影响，但随着浓度的递增，其生根也会逐步受到越来越大的抑制作用。在底部愈伤组织形成方面，KT的促进作用不是很明显，特别是低浓度（0.2mg/L）的KT对愈伤组织的形成没有任何促进效果，但随着浓度的不断提高，KT对愈伤组织的形成也逐步起到促进作用，但不如BA的促进效果那么大。 a)培养基MS无激素，50days b)培养基MS+BA 0.1mg/L,50days c)培养基MS+BA 0.2 mg/L,50days d)培养基MS+BA 0.5 mg/L,50days 图3.2 乌桕茎段离体再生培养 a) 在无激素的MS培养基中培养50天，侧芽生长形成新的幼芽，但长势不好，且底部生根； b) 在MS+0.1mg/L BA的培养基中培养50天，侧芽生长形成新的幼芽，长势较好； c) 在MS+0.2 mg/L BA的培养基中培养50天，侧芽生长形成新的幼芽，长势很好，且底部形成较多不定芽； d) 在MS+0.1 mg/L BA 的培养基中培养50天，侧芽生长形成新的幼芽，长势较差，底部形成颗粒状绿色愈伤组织。 综上所述，0.2mg/L的BA对侧芽生长、伸长及底部愈伤组织形成的促进效果较好，而1.0 mg/L的KT对侧芽生长的促进效果也相当高，到达最高的72.7%的侧芽生长率，但对侧芽伸长的促进效果不佳，所以进一步的试验，可以考虑将0.2mg/L的激素BA与1.0mg/L的激素KT混合试用，找出茎段离体再生培养的最适条件。 3.3 转基因结果 将在选择再生培养基上形成的愈伤组织浸在GUS染色液中，于37℃下保温12小时。染色结束后，愈伤组织经95%乙醇和70%乙醇分别脱色，再观察愈伤组织的染色情况，验证目的基因能否成功转入乌桕细胞中去。初步检测结果见图3.3。 图3.3 乌桕愈伤组织转基因结果 （左面为非转基因的愈伤组织；右面是转基因愈伤组织，蓝色是报告基因gus表达的结果） 4 讨论 众所周知，植物基因工程技术可以快速、定向改变植物的遗传性状，是植物遗传改良的一个非常有效的手段。转基因技术对于生长周期长的木本植物尤为重要。但是，植物基因工程技术必须依赖植物离体再生技术。所以本次研究的相关内容相辅相成，其中有关乌桕快速繁殖的研究成果即为乌桕转基因技术的研究打下了重要基础，同时，转基因技术的研究也可以为乌桕的快速繁殖提供更为快捷的途径。 本次研究在乌桕快速繁殖方面，主要以种子无菌萌发和茎段离体再生培养的最适条件为探索目标。通过不同激素组合培养基的试用和筛选，结果表明：无激素或低浓度（0.5～1.0mg/L）BA的培养基均适合进行乌桕种子的无菌萌发，其中以无激素培养基为最佳；其次，0.2mg/L的BA对侧芽形成、伸长及底部愈伤组织形成的促进效果较好，而1.0 mg/L的KT对侧芽形成的促进效果也相当高，到达最高的72.7%的侧芽形成率，但对侧芽伸长的促进效果不佳，所以进一步的试验，可以考虑将0.2mg/L的BA与1.0mg/L的KT混合使用，找出茎段离体再生培养的最适条件。乌桕快速繁殖的研究成果为转基因优良品种的乌桕进行大规模增值提供了有效快捷的途径， 在乌桕转基因研究方面，本次研究主要使用农杆菌介导的转化方法，将目的基因转入乌桕胚轴和子叶外植体中，再通过对所形成的愈伤组织作初步的转基因检测，探究目的基因成功转入效率。由于实验的时间的限制，从乌桕转基因的愈伤组织上诱导出的不定芽数量甚少，如果将试验继续下去，得到转入了目的基因的乌桕苗是完全可能的，并可再通过乌桕组织培养技术大量快速繁殖该优良品种。同时，研究发现，在相同的培养基条件下，形成的不定芽均来自茎段外植体，而子叶外植体上尚未发现不定芽的形成，这表明了乌桕不同器官的形态发生全能性的潜力差异比较大。 目前，类似乌桕这样木本植物的转基因研究还很多,但大多都处在实验室研究阶段,其商业化生产还处于起步阶段。在木本植物的转基因研究中还存在着很多问题,木本植物的遗传转化体系还不够完善。另外,个体基因型的不同会严重影响到植株的再生和转化的效率[17] ,而且由于转基因技术将外源基因整合到植株中,对植株再生也会产生影响,一方面降低了再生频率[18] ,同时也会产生表型异常的植株。在选择标记系统方面，木本植物还是主要依靠抗生素、除草剂等负向选择标记系统，而这些系统存在着很多的弊端。相对来说,应用正向选择标记系统如甘露糖、木糖选择标记系统可以降低公众对转基因作物的担忧，还能提高转化效率，这将是未来木本植物转基因技术发展的一大方向[19]。 尽管在乌桕转基因技术的研究开展刚刚开始，还有许多问题有待解决，但随着今后分子生物学等理论和技术的进步,转基因技术作为一项重要的品种改良手段,必然会在类似乌桕这样的能源木本植物上得到广泛应用,从根本上解决其营养周期长等缺陷，建立完善高效的乌桕遗传转化体系，从而更快地投入到实际生产中去，满足市场的需求。 参考文献 [1] 刘峰等. 积极推进我国新能源的开发和利用. 石油规划设计，2008，19（1）：8-10，21 [2] 刘玉环，阮榕生，欧阳海峰.生物柴油规模化生产原料开发研究[J].可再生能源，2007，2：21-26. [3] 于凤文，计建炳.生物柴油的现状和发展方向[J]. 能源环境保护，2003，6：15-19. [4] 蒲晓斌，蒋梁材，张锦芳. 生物柴油—一类新的可再生清洁燃料[J]. 四川农业科技，2004，8: 15-21. [5] 陈英歌. 能源植物资源研究进展[J]. 河北林业科技，2006，5: 33-35. [6] 梁磊. 能源植物的开发和利用[J]. 宁夏农林科技，2006，5:75-76. [7] 陈英明，肖波，常杰. 能源植物的资源开发与应用[J]. 氨基酸和生物资源，2005，27: 1-5. [8] Cardone M， Prati MV， Rocco V， Seggiani M， Senatore A， Vitoloi S. Brassica carinata as an alternative oil crop for the production of biodiesel in Italy: engine performance and regulated and unregulated exhaust emissions [J]. Environ Sci Technol. 2002， 36: 4656-466. [9] Durrett TP， Benning C， Ohlrogge J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels [J]. The Plant J. 2008，54:593–607. [10] 杨成兴. 积极开发利用乌桕资源[J]. 今日科技，1986，8: 13-18. [11] 金代钧，黄惠坤，唐润琴．中国乌桕品种资源的调查研究[J]．广西植物，1997，17：345-362. [12] 骆琴娅. IBA和PP333对乌桕扦插生根的作用. 中南林学院学报，1991，2:196-199 [13] 宋建伟，苗卫东，王志玲，朱春茂．低温GA3处理对乌桕种子发芽的影响[J]．安徽农业科学，2006, 34: 673-674 [14] 周兰英，黄从德，肖千文．乌桕雾插技术研究．四川农业大学学报，1996，14：488-490 [15] 于芳雷，许爱云，张先林．乌桕播种育苗技术．山东林业科技，1997,4: 46-47 [16] 张其霞. 乌桕播种育苗与无性繁殖技术. 现代农业科技，2007,18：45-51 [17] Iocco P ,Franks T ,Thomas M R1Genetic transformation of major wine grape cultivars of Vitis vinifera L[J ]1Transgenic Re2 search ,2001 ,10 :105-1121 [18] ervera M ,Pina J A ,J uarez J ,et al1A broad exploration of a transgenic population of citrus : stability of gene expression and phenotype[J ]1Theor Appl Genet ,2000 ,100 :670-6771 [19] 杜景川，何正权，陈发菊，姚伟，李凤兰. 木本植物转基因研究进展[J]. 福建林业科技，2007，34：142-148 致 谢 本毕业论文是在陈永勤教授的悉心指导下完成的。陈老师严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到论文的完成，陈老师始终给予我无微不至的关怀和悉心的指导。在此谨向陈老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！ 从开始进入课题到论文的顺利完成，我还要感谢给我提供了不少帮助的师长、朋友和同学。在此，我要特别感谢实验室里的肖柳青师姐。在具体试验过程中，肖师姐给予了我很多的指导和建议，同时她对学业的端正态度和严谨向上的积极心态也使我受益匪浅，在此衷表谢意！ 最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，感谢你们在我学习上所给予的莫大支持与鼓励! 在这毕业之际，我心潮澎湃，我知道大学四年的读书生活在这个季节即将划上一个句号，但于我的人生却只是一个逗号，我将铭记大家对我的关心和帮助，继续踏上新的征程。 PAGE 11