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分子生物学技术在细菌耐药性研究中的应用
俞云松
随着抗菌药物的广泛应用,细菌耐药情况越来
越严重,受到临床医生、实验室工作人员及流行病学
专家等各界的重视。对细菌耐药现状和耐药机制的
研究,可为临床治疗、院感控制、新药研发等提供重
要的依据。在细菌耐药性的研究中,分子生物学技
术发挥了至关重要的作用。我们从流行病学调查和
耐药机制研究两大方面,介绍分子生物学技术在细
菌耐药性研究中的应用。
一、分子生物学技术在耐药菌分子流行病学研
究中的应用
分子流行病学调查是细菌耐药研究中至关重要
的一部分,能够及时、准确地阐明耐药菌的流行状况
和克隆特征,为有效控制院内感染和细菌耐药性的
播散提供依据。目前常用的分子分型技术主要有
3类:基于酶切的DNA指纹图谱技术、基于PCR的
分子分型技术及基于测序的分子分型技术¨J。
(一)基于酶切的DNA指纹图谱技术
1.限制性片段长度多态性(restrictionfragment
lengthpolymorphism,RFLP):该技术是用限制性内
切酶将基因组DNA进行消化,不同基因组中限制性
内切酶的酶切位点不同,从而产生不同长度的酶切
片段,然后在琼脂糖凝胶上电泳分离,分析其多态
性。RFLP多用于构建遗传图谱。作为分子分型技
术,RFLP存在一定的缺点,重复性差,效率低,产生
的大量酶切片段难以分析。
2.脉冲场凝胶电泳(pulsed—fieldgel
electrophoresis,PFGE):该技术采用稀有酶切位点
的限制性内切酶对细菌基因组进行消化,得到较大
的DNA片段(10000~80000bp),利用周期性改变
电场方向,有效地分离大的DNA片段,从而通过对
DNA条带图谱的比较确定细菌的分型。两种常用
的方法有动态调控闭合均一电场电泳(CHEF)和场
倒置凝胶电泳(FIGE)。目前广泛采用Tenover等旧1
作者单位:310003杭州,浙江大学医学院附属第一医院传染病
诊治国家重点实验室
通讯作者:俞云松,电子信箱:yvysll9@163.corn
.综述.
提出的
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
来判读PFGE结果,电泳条带无差异为
同一克隆菌株,1—3条差异为单一遗传事件所致,
提示同一个克隆不同亚型的细菌;4~6条差异可能
由两次遗传事件所致,6条以上差异可能由3次或
更多遗传事件所致,菌株间无相关性。PFGE图像
可采用计算机软件进行分析,如BioNumerics。
PFGE分型技术分辨力高、重复性好,是目前短时间
内院内感染暴发流行诊断的金标准。它也存在一定
的不足:操作繁琐、耗时长;对于时问跨度长、地区跨
度大的研究,PFGE的分辨率过高;结果为图谱形
式,难以标准化和数字化,不同实验室之间结果难以
比较。笔者对我国19家医院分离的亚胺培南耐药
鲍曼不动杆菌采用PFGE进行同源性分析,结果显
示我国主要存在六个流行克隆株,占菌株总数的
87%,克隆株在病房内、病房间、医院之间、地区之间
播散已经成为我国亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌分离
率不断上升的最主要原因L3J。
3.质粒酶切指纹图谱分析:该技术是较早用于
流行病学研究的分子分型技术HJ。抽提出来的细
菌质粒用限制性内切酶消化,通过比较琼脂糖凝胶
电泳分离的片段大小进行分型。质粒及位于质粒上
的转座子是能够水平移动的DNA元件,可自发的获
得和丢失,因此质粒酶切指纹图谱分析通常不用于
细菌亲缘关系的研究,而是广泛应用于质粒水平传
播导致耐药性播撒的流行病学研究。
(--)基于PCR的分子分型技术
1.扩增片段长度多态性(amplifiedfragment
lengthpolymorphism,AFLP):该技术是在RFLP和
PCR基础上发展起来的分子标记技术。选用2种不
同的限制性内切酶(稀有位点和常见位点)消化基
因组DNA,在酶切片段的末端连接特异性人工接
头,以黏性末端和接头序列作为引物的结合位点进
行PCR选择性扩增,然后通过电泳分离PCR产物
得到DNA指纹图谱,进行多态性分析。5J。除了绘制
遗传图谱,AFLP迅速应用于微生物研究领域,如病
原微生物的分类鉴定和流行病学调查。相对于
RFLP,AFLP具有稳定性好、重复性好、结果易于判
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读等优点。
2.随机扩增多态性(randomlyamplified
polymorphicDNAassay,RAPD):该技术用一系列随
机的核苷酶序列(通常含10个碱基)作为引物,对
基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物通过电泳分
离检测其多态性。扩增时只有距离最近、方向相反
的2个引物之间的DNA片段才能被扩增,基因突变
可能导致这些结合位点分布发生变化,从而形成扩
增产物的多态性。与其他技术相比,RAPD操作简
便、快捷,费用合理,分辨力依靠引物的数据和核苷
酸序列而改变。尽管分辨力不如PFGE,但在医院
内感染暴发流行时不失为可行的辅助诊断技术。
RAPD的缺点主要有两个方面:(1)干扰因素多
(PCR条件及体系等),导致重复性差;(2)结果缺乏
统一的判读标准,由于扩增片段的多态性不能和特
定的遗传事件紧密关联,所以不能采用PFGE的判
读标准峥o。
3.可变数目串联重复多态性(variablenumber
tandemrepeats,VNTRs):细菌基因组中通常含有多
个短的串联重复序列,该技术利用这些重复序列为
引物靶序列,进行PCR扩增,对PCR产物电泳结果
进行比较。不同菌株重复序列问的距离和重复序列
的数量不同,从而形成指纹图谱的多态性一1。
VNTRs操作简便,分辨力高,成功应用于流行病学
调查。
(三)基于测序的分子分型技术
1.单位点序列分型(single-locussequence
typing,SLST):同种细菌不同菌株的某个特定基因
或核酸序列有一定的差异性,如单核苷酸多态性、重
复序列多态性等。SIST即通过测定这一特定位点
的核苷酸序列,在不同菌株之间进行序列比对,从而
判断菌株之问的同源性。目前应用最为广泛成熟的
是金黄色葡萄球菌的spa分型技术。spa数据库已
有3735种类型,最近的研究表明,spa分型方法既
适用于短期的流行病学调查,也可用于长期的全国
性的监测¨1。
2.多位点序列分型(multi—locussequence
typing,MIST):通过比较一系列看家基因(通常是7
个或更多)的核苷酸序列进行分子分型的。以测序
为基础的分型技术具有明显的天然优势,可重复性
强、易于标准化、判读方便、易于数字化(A、T、c、G)
从而形成数据库,因此进行保存和比较非常方便。
MIST最初用于脑膜炎奈瑟菌分型研究,现已成功
应用于其他多种病原体的分子流行病学研究,如甲
氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、空肠弯曲菌、
霍乱弧菌等。目前互联网上已有2个MIST数据库
(http://www.mist.net和Pubmlst.org),全世界各个
不同的实验室可以直接在网上进行数据提交和比
对,并逐步完善MLST数据库资料,促进全球耐药菌
的协作研究。由于管家基因的高度保守性,MIST
的分辨力低于PFGE,更适用于时间跨度和空间跨
度大的流行病学调查及分子进化关系的研究。
MIST也有一定局限性,如测序费用贵、对短时间内
院内感染暴发流行分辨力过低等一J。Enright等¨训
通过MIST研究发现世界范围流行的MRSA主要为
5个克隆复合体(CC8、CC5、CC30、CC45、CC22),而
MSSA则有更广泛的遗传背景。此外,研究表明,亚
洲除了韩国和日本的MRSA主要为CC5外,其他地
区的MRSA多为CC8(Srl239)u“。
二、分子生物学技术在耐药基因检测和定位中
的应用
1.PCR:可以体外酶促合成特异DNA片段,是
最常用的分子生物学技术之一。PCR技术具有快
速、特异性高、敏感性高等优点,已被广泛应用于耐
药基因的筛查工作,再结合DNA测序技术可以进一
步寻找基因突变位点,进行分子分型。影响PCR扩
增反应的主要因素包括DNA模板、特异性引物以及
扩增体系和条件几个方面。利用商品试剂盒从细菌
中抽提的基因组、质粒,纯度和浓度均很高,可作为
稳定的DNA模板,而通过挑取菌落煮沸裂解直接得
到细菌DNA模板,方便快捷,适合大通量地进行耐
药基因的筛查-12|。引物的特异性以及扩增体系和
条件对于PCR的特异性和敏感性非常重要,每次实
验中均应包含阳性对照样本和阴性对照样本。
2.核酸杂交:尽管PCR技术在细菌耐药基因检
测中具有快速准确的优点,但仍然会遇到目标基因
序列改变导致引物错配的情况,因此为了避免假阴
性的结果往往需要通过核酸杂交进行验证。通常将
细菌菌落直接转移到滤膜上杂交,探针可采用同位
素、地高辛或者生物素标记。核酸杂交还可以用于
耐药基因定位。将细菌抽提出的质粒通过琼脂糖电
泳、转膜并用特异性的耐药基因探针进行杂交,观察
质粒在电泳胶图的位置上是否存在杂交信号可以判
断该耐药基因是否定位于质粒。Poirel等。1副在研究
喹诺酮耐药基因与超广谱B内酰胺酶(ESBL)基因
共同传播机制的问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
中,成功地运用Southernblot
核酸杂交技术将qnrA基因与blaVEB一1基因定位于
同一个可结合质粒上。同样,如果对细菌全基因组
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酶切电泳图谱转膜、杂交,也可以将耐药基因定位到
一条具体的酶切条带上。
3.酶切克隆:PCR和核酸杂交技术只能对已知
的耐药基因进行筛查和验证,如果需要寻找未知的
耐药基因,可以利用酶切克隆和抗生素筛选的方法。
通常对于具有抗生素耐药表型的细菌,首先挑选合
适的核酸限制性内切酶对基因组进行酶切,再将酶
切的片段连接入载体(如质粒载体,噬菌体载体),
通过该耐药表型的抗生素筛选重组子可以获得携带
耐药基因的质粒,最后对所获得质粒进行测序明确
耐药基因的具体信息¨4|。实验的关键点是所挑选
的内切酶必须有比较合适的切点,即酶切片段大小
要适中,片段太长不易连接人载体,而片段太短则不
能包含完整的基因序列导致缺乏耐药表型。
4.全基因组测序:随着测序技术在近几年的飞
速发展,获得一个物种的全基因组序列已经不是非
常困难的事情,特别是相对简单的细菌基因组。明
确耐药菌株的核酸全序列之后,可以在基因组的水
平对基因分布、代谢途径、调控通路有一个全局性地
认识,特别是可以明确耐药基因的进化和传播机制,
深入了解目前广泛存在的细菌泛耐药问题。比较传
统有效的全基因组测序方法一般采用基于毛细管电
泳的Sanger末端终止法,需要先构建全基因组DNA
文库,利用载体克隆大量的文库DNA片段进行毛细
管电泳测序,再将测序片段进行拼接以获得完整的
基因组全长¨引。Sanger法获得的DNA片段较长
(约500—1000bp),测序质量较稳定,目前已经完
成的全基因组测序工作大多基于这种方法。但它也
有比较明显的缺点,
流程
快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计
繁琐,工作量大,自动化程
度不高,且需要较高的成本。
近2年基于芯片技术的新的全基因组测序技术
刚刚兴起,其特点是自动化程度非常高,工作量少且
通量大,可在短时间内获得大量的测序结果,而成本
非常低。已经有不少国际上的生物公司根据这种方
法研制出了全自动的测序工作站,如罗氏公司的
454系统,Illumina公司的solexa系统、ABI公司的
solid系统等。其中采用焦磷酸测序
(pyrosequencing)技术的454系统已经完成了部分
全基因组测序工作,例如Smith等¨刮运用此技术成
功地完成了全长3976746个碱基对的鲍曼不动杆
菌基因组测序工作。然而,由于芯片技术的特点,这
种方法获得的测序片段长度很短,在30~200bp长
度之间,给序列拼接工作带来一定的挑战,不过现在
已经开发出了大量的软件来应对这个问题。
三、在耐药基因转录水平研究中的应用
1.实时荧光定量PCR(RT—PCR):是指在PCR
体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测
整个PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板进行
定量分析的方法,尤其适用于基因表达量的研究。
在细菌耐药机制研究领域,往往要考虑相关基因表
达量的差异对耐药表型的影响。通过提取细菌
RNA并逆转录成cDNA,再结合RT—PCR技术,就可
以分辨出不同耐药表型的菌株耐药基因表达量的差
异。这种方法在分析外排泵基因以及膜孑L蛋白基因
表达量对细菌耐药的影响时经常使用u川。例如,
Jiang等u副在做结核分枝杆菌外排泵系统研究工作
的时候,利用RT.PCR技术检测了1499株多耐药菌
株外排泵基因的表达水平,发现了2个外排泵基因
的异常高表达同多耐药表型相关,并且找到一个异
烟肼相关特异外排基因【18]。
根据使用荧光基团的不同,常用的RT.PCR方
法可以分为SYBR荧光染料法和Taqman荧光探针
法。SYBR荧光染料可以特异性地掺人DNA双链
而发射出荧光信号,不掺入DNA双链中的SYBR染
料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号
的增加与PCR产物的增加同步。SYBR荧光染料法
不需要设计特异性的探针,具有价格低廉,使用简便
等优点,但有时会受到PCR非特异性扩增的影响带
来实验误差。Taqman荧光探针法已经有了成熟的
商品试剂盒,相对而言成本稍高,但特异性更好。这
种方法需要自行设计探针,PCR扩增时,Taq酶的
57-37外切酶活性将探针酶切降解,使
报告
软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载
荧光基团
和淬灭荧光基团分离,荧光监测系统即可接收到荧
光信号,而完整的探针的荧光信号则被淬灭基团吸
收,这样保证了每扩增1条DNA链,就有1个荧光
分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成
完全同步。
2.基因芯片:工作原理与经典的核酸分子杂交
方法是一致的,都是应用已知核酸序列作为探针与
互补的靶核苷酸序列杂交,通过随后的信号检测进
行定性与定量分析。基因芯片在微小的基片(硅
片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子识别探
针,能够在同一时间内平行分析大量的基因,进行大
信息量的筛选与检测分析。因此,利用基因芯片技
术可进行大通量的病原微生物检测和攀定,也可以
设计特异性的耐药基因探针,进行大规模的抗生素
耐药性相关筛选。通过多色荧光标记的芯片技术还
可以直观地比较不同来源样品的基因表达差异,从
生堡焦墼匡堂苤盍塑!生!旦笠!!鲞笠!翅垦!也』!生丛型:』!些!鲤!:!些!!:塑!:鱼
而可以将不同耐药株表型差异和相关基因表达差异
联系起来。
随着分子生物学技术的不断发展,其在细菌耐
药性研究中的应用13益广泛,对揭示细菌耐药性产
生及流行的分子机制,控制耐药细菌流行播散发挥
13益强大的作用。
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real—timerevel'BetranscriptionPCR.MicrobDrugResist,2008,
14:7-11.
(收稿日期:2008-04-10)
(本文编辑:史红)
问:检测肿瘤自身抗体谱有何临床应用优势?
答:在肿瘤发生发展的复杂过程中,每个阶段都有其特
异性表达的抗原,这些时序性表达的抗原刺激机体的免疫系
统,诱导产生自身抗体,从而形成了一个时序性存在的肿瘤
自身抗体谱。针对这些肿瘤自身抗原的肿瘤自身抗体叮以
作为细胞癌变过程中的报告分子。但是单一应用一种肿瘤
自身抗体筛查肿瘤,其敏感度和特异性都难以满足临床需
要,因此联合应用一组肿瘤自身抗体——肿瘤自身抗体谱已
成为更好的选择。肿瘤自身抗体谱检测的临床应用优势主
要有以下2个方面:
1.用于早期筛查和癌前预警:目前常规检测的肿瘤标志
对肿瘤预警和早期诊断效果不好。这主要是因为早期患者
病灶小,标志物分泌少,释放人血液的标志物更少,甚至检测
不到,这是现有的肿瘤标志在早期诊断方面的主要缺陷。肿
瘤自身抗体足免疫细胞识别肿瘤细胞后产生并分泌至血液
.专家答疑
循环的,经过免疫系统的“放大”作用,即使微小的分子改变
信号也会被放大,从而更易被探测。因此检测肿瘤自身抗体
谱可更灵敏地检测早期肿瘤和癌前病变。
2.用于肿瘤分期、分级和疗效与复发监测:随着肿瘤生
长和病情变化,肿瘤自身抗体谱也不断地发生特异性的改
变,因此检测各阶段的特异性肿瘤自身抗体谱可辅助临床确
定肿瘤的分期、分级及进行疗效与复发监测。此外,自身抗
体谱可反映机体所有蛋白水平的异常,并提供个体化的全面
信息。因此,可更全面的辅助肿瘤分型和提示预后。
‘总之,肿瘤患者的自身抗体谱作为一种新型的肿瘤分
子标志,有常规标志无法比拟的优势。
(齐军王憨杰 高佳)
(收稿口期:2008-04-03)
(本文编辑:李建陵)
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