组织化学技术4-酶组化

第二章酶组织化学酶组织化学（EnzymeHistochemistry）是利用组织细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。一般是用冻结或固定的切片，再一定条件下（具有酶的底物等）全酶进行催化作用，产生一种可见产物，沉淀在酶所在的部位，最终通过显微镜对酶的活性进行定位或定量研究。※特点：①在原位检测②检测酶的活性而不是酶分子本身酶的分类：按生物化学分类——六大类①氧化还原酶②转移酶③水解酶④裂解酶⑤异构酶⑥连接酶常用检测方法1．沉淀法①金属沉淀法：Ca++—Co++法；Pb法②偶联法：重氮盐法③靛原法④四唑盐法12．后偶联法Post-coupling（ACP）3．合成法4．底物膜法设计半透膜切片/孵育法★★★影响酶组化实验的关键因素①酶活性的保存a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不同的酶适用不同的固定剂△抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。△慎用醛2b）取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙酮∶氯仿=1∶1）4℃，5～10分钟，但脂溶性蛋白脱落。②底物浓度A）量要足够1∶20V/VB）孵育法只能用一次，配制时要适量（节俭）③PH和渗透压应以缓冲液调节④温度控制与时间：室温37℃（40min）4℃（5～10min）3⑤捕获剂亦要求一定浓度，要以反应原位瞬时沉淀。⑥激活剂与抑制剂（对照）a）两者的选择都应具有特异性。b）要有适当的浓度范围⑦时间：通过实验自行摸索。任何配方都是一个很大的范围（指时间），受多种因素的影响，因药品的质量、环境因素的变化而变化。故不可轻信之。⑧扩散：控制反应速度，避免扩散（冰冻切片孵育尤应注意）4⑨对照：必须设立对照，以防非特异反应。这对结果的解释非常重要。★★★对结果的分析，应考虑如下几个问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ：①　经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟能保留多少？②　酶是否在原位？③　反应中多少酶起了作用？④　酶的活性是否代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 细胞生活时的活性？⑤　沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延长，会不会改变？⑥　是否有扩散移位5一、钙—钴法显示碱性磷酸酶AlkalinePhosphatase（ALP）〔原理〕以天然存在的β—甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式如下：67〔方法〕标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片）厚6微米。固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃2~5′①切片标本入下列孵育液中，37℃，5分钟孵育液：3％β—甘油磷酸钠6ml底物保2％巴比妥钠6ml调PH证2％氯化钙（无水）9ml沉淀剂新2％硫酸镁6ml激活剂鲜蒸馏水3ml30ml将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4。②流水流水洗2分钟后→入蒸馏水③入2％硝酸钴，5分钟（小肠可3分钟）置换Ⅰ④流水洗5分钟，入蒸馏水。⑤入0.5硫化胺，2分钟。置换Ⅱ⑥流水洗10分钟，入蒸馏水。⑦入Mayer氏苏木精染液(复染核)1分钟⑧流水洗5分钟→蒸馏水。⑨甘油明胶或Apathy糖胶封固。结果：肾小体（近端小管）刷状缘、小肠绒毛纹状缘和血管内皮出现黑色的硫化钴沉淀，显示ALP活性强。△ALP为一种膜酶，广泛存在于肾小管、小肠绒毛、膀胱、肾上腺、包曼氏囊、肝、脾、乳腺及卵巢等细胞膜，与细胞的吸收有关。〔对照〕①无底物孵育，以蒸馏水代替孵育液中的3％β—甘油磷酸钠，其余各步进行同上。②加热灭活酶活性。③加抑制剂，左旋咪唑0.1～1.0mmol/L〔注意事项〕①〔Ca2+〕要足量②硫化钠（NH4）S配置成淡黄色，可提供S2-〔滴2～3滴〕③用水将钴离子洗净，以防止出现假阳性。④有些组织中有色素（含铁血黄素、黑色素）出现，可影响结果。★本法可用显示：5—核苷酸酶、肌蛋白ATPase、ALP二、铅法——显示酸性磷酸酶（Gomori，1950Lojda，1979）〔原理〕以β—甘油磷酸钠为底物，在酸性PH下，被ACP水解，释放出磷酸盐，遇铅离子则生成磷酸铅沉淀。在被S2-置换，最终生成硫酸铅棕色沉淀。反应式如下：★酸性磷酸酶AcidPhosphatas（ACP）※ACP的特性①PH4.5～5.5适宜②激活剂：Mn2+③抑制剂：NaF，有些ACP为Cu2+、酒石酸盐、四氧嘧啶甲醛等抑制剂。〔ACP定位〕①溶酶体（颗粒状）内；②溶酶体外ACP存在于ER和胞液。③该酶活性高的器官：肾、肝、肠、脾、肾上腺。〔方法〕标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6微米。固定：冰冻片或横冷箱切片。冻融，有时也可用甲醛，但影响活性。本实验不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液，4℃，2～5min步骤：①将标本放于下列孵育液中37℃，10～15′孵育液：0.1M醋酸缓冲液，PH5.215ml0.24％硝酸铅15ml3％β—甘油磷酸钠3ml33ml混匀，置37℃水浴中15～30分钟后，过滤。②于37℃蒸馏水中洗2次，每次1分钟。（温蒸馏水洗）③入5％硫化胺，1～2分钟。④流水冲洗3～5分钟后，换蒸馏水。（可用Mayer苏木素复染核）⑤用甘油明胶或Apathy氏糖胶封固。〔结果〕酶活性部位→棕黑色硫化铅沉淀。分布于肾近曲小管细胞核周围，肝细胞毛细胆管周围均有棕黑色颗粒。〔对照〕孵育液内加0.01MNaF（13.9mg/33ml）→（—）〔注意事项〕①铅离子的浓度→关键问题，没有底物，有些组织吸附铅离子（+），因此必须用NaF抑制酶活性→排除假阳性反应。②孵育时间不可过长，否则染色扩散或核染色。［应用范围］“铅法”适用于：ACP，5’--核苷酸酶G—6—P酶;膜ATPaseMito—ATPaseTTPase（硫胺素焦磷酸酶）三、偶氮偶联法显示ACP［原理］以奈酚的衍生物磷酸脂NaphtholAS—BLPhosphate为底物，在酸性PH（5.2）下，经酸性磷酸酶水解释放出NapholAS—BI，立即与六氮化对品红偶联，生成红色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。［方法］标本：大白鼠肾、肝横冷箱切片（载片），厚6微米。不固定或固定于丙酮∶氯仿（1∶1）混合液内，4℃，2～5min①标本入下列孵育液，37℃，30～60分钟。孵育液：磷酸奈酚AS—BI15mg溶于二甲基亚砜0.6ml六氮化对品红缓冲液30ml30.6ml充分混匀并过滤②蒸馏水洗③入Mayer苏木精内染1分钟。④流水冲5分钟后入蒸馏水。⑤用Apathy糖胶或甘油明胶封固。［结果］酶的活性部位呈红色，核兰色。分布于肾近端小管核周，肝毛细胆管周围。※ACP是溶酶体的标志酶。※※六氮化对品红液的配制（30ml）①4％对品红盐酸溶液碱性品红400mg浓盐酸2ml蒸馏水8ml②4％NaNO3配好后于冰箱保存用时取1ml。①+②等量混匀（各取1ml），盖严并置室温静止一分钟，待混合液变为淡黄色→倒入28ml2.72％醋酸钠溶液，用1NNaOH调PH至5～5.5即成。四、四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶［对照］用抑制剂NaF浓度为10mmol/LCa2+浓度为10mmol/L［注意事项］①六氮盐浓度不能太高②背景会略带黄色［应用范围］本法用于ALP、ACP、非特异性脂酶。［原理利用］利用H受体的H2，使四唑还原成甲月替：反应式如下：本实验：以琥珀酸（钠盐）为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑（nitroBT）为受H体，其接受H后被还原成甲月替呈紫色以代表琥珀酸脱氢酶的活性。※琥珀酸脱氢酶是线粒体的标志酶之一。△抑制物：丙二酸盐（竞争抑制），磷酸盐，氯化物，苏拉明草酰乙酸（竞争抑制）凡与-SH基化合的作用剂皆抑制其活性。［方法］标本：大白鼠肝、肾或心肌。横冷箱切片，后6微米不固定。步骤：　①将标本放入下列孵育液中，37℃，约5　　　分钟。孵育液：nitroBT10mg0.1MPBS，PH7.810mlPMS（吩嗪硫酸甲酯）1mg徐徐加温，使其溶解，冷却过滤。再加入琥珀酸钠80mg②蒸馏水洗净③Apathy氏液糖胶封固［结果］酶活性部位成蓝紫色沉淀。此标本内所见蓝紫色颗粒即线粒体。［对照］孵育液去底物，加入等量蒸馏水，同时孵育（—）［注意］①甲月替易溶于脂，反应扩散时组织内脂滴被染。②加入PMS（中间递氢体）定位更加准确。③如果聚乙烯醇PVA，可以保护线粒体膜，使反应局限在线粒体内。［应用范围］适用于：甲胺氧化酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶。五、DAB法显示过氧化物酶〔原理〕过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。〔光镜显示方法〕（1）孵育液的配置：预孵育液：DAB4HCL10mg溶于蒸馏水5ml0.2M磷酸缓冲液（PH6.5）5mlFahimi孵育液:DAB4HCL10ml溶于蒸馏水5ml0.2M磷酸缓冲液（PH6.5～7.0）5ml0.3％H2O20.1mlGraham—K孵育液：DAB4HCL5mg0.05MT—H缓冲液（PH7.6）10ml1％H2O210mlLojda孵育液：0.1％N—苯基—对—次甲苯二胺25ml0.1％α--萘酚25ml0.3％H2O2（新配）1ml〔方法〕①固定：温度4℃，30分钟（3％戊二醛固定液：20％戊二醛15ml，或25％戊二醛12ml0.2M磷酸缓冲液50ml，蒸馏水加至100ml止）；②洗涤：洗涤三次以上，每次15分钟，或过滤。③切片：Cryostat制成切片（5～10μm）[染色步骤]①切片入下列孵育液中a．预孵液：室温下10～30分钟b．后孵液：Fahimi孵育液，室温5～60分钟Gropam--Karnovsky液，室温，3~10分钟②洗涤：蒸馏水漂洗③染核：亚甲蓝染核④封固：甘油明胶封固▲髓性过氧化物酶显示法。①固定与切片：用冷的2.5％戊二醛固定30～60分钟，然后用Cryostat制成20微米切片。②孵育：Lojda孵育液，室温，3～10分钟。③洗涤：蒸馏水洗。④染核：卡红矾染核。⑤封固：甘油明胶封固。[结果]酶活性阳性部位呈茶褐色。髓性过氧化物酶→蓝色〔对照〕一般DAB法：①去掉H2O2；②将20～50mM的3—氨基—1，2，4—三唑加进预孵育液和DAB反应液内。髓性过氧化物酶的显示法：用50mMKCN处理。