高速逆流色谱技术在中药及天然产物领域中的应用

高速逆流色谱技术在中药及 天然产物领域中的应用 宫静静 ，谢静 ，沈平壤n，卓超 ，王娟 (1_华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237； 2．国家中药制药工程技术研究中心，上海 201203) [摘要]高速逆流色谱 (HSCCC)技术是国际上较新型的液液分离技术。由于其独特的优点，它在各分离提纯领域 中的应用越来越多，新的HSCCC技术和应用成果相继被报道出来，本文对近几年来高速逆流色谱在中药及天然产物领 域内的应用进行了综述。 [关键词】高速逆流色谱；天然产物；中药 高速逆流色谱 (High—speed counter—current chromatograph，HSCCC)技术是国际上较新型的液 液分离技术，其工作原理建立在美国国立卫生院 Yiochiro Ito．博士发明的逆流色谱技术基础上。 HSCCC是属于分离比较完全的液液分配色谱，其 溶剂系统由互不相溶的两相溶剂组成，依靠聚四氟 乙烯蛇形管的方向性及特定的高速行星式旋转所产 生的离心场作用，将两相溶剂固定于管中，分别充 当固定相和流动相。由于各组分在两相中的分配能 力不同，故其在蛇形管中的移动速度也不同，因而 使样品组分得到分离 j，且分离比较完全。 HSCCC技术已经成为一种备受关注的新型分 离纯化技术。由于其具有较好的分辨性、固定相不 需要载体、进样量大、分离完全等优点，因此被广 泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等诸 多领域。我国还是继美国、日本之后最早开展逆流 色谱应用的国家，也是世界上高速逆流色谱仪生产 国之一，我国丰富的资源给HSCCC技术提供了广 阔的平台。本文就近几年来 HSCCC技术在中药及 天然产物中的应用作一综述。 1 黄酮类化合物 黄酮类化学物质在自然界中广泛存在于多种植 物，且对于治疗多种疾病有着重要的作用，是一类 比较重要的植物化学成分。现已成功应用 HSCCC 技术分离提纯该类化合物的对照品。 常用的分离黄酮类化合物的溶剂系统为氯仿 一 甲醇一水 (4：3：2)，例如潘霞等 以芦荟全叶为原 料，经过一系列的预处理手段获得芦荟色酮粗提物， 采用氯仿一甲醇一水 (4：3：2)混合溶液和二氯甲烷 一 甲醇一水 (5：4：2)混合溶液为溶剂分离系统，经 过两步HSCCC分离纯化出纯度在95％以上的芦荟色 酮单体。通过紫外检测、快原子轰击质谱及核磁共 振等 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的结构分析鉴定证实分离所得物质为肉桂 酰基一C一葡萄糖苷芦荟色酮。蔡定国等 使用该溶 剂系统成功分离了陈皮中的橙皮苷；Yang F Q等H 用该体系成功分离了沙棘中的茨非醇。 其他溶剂系统有：Jinyong Peng等 以己烷 一 醋酸乙酯一甲醇一水 (10：11：11：8)为溶剂系统从 败酱草中分离得到 bolusanthol B、5，7，2 ，6 一四 羟基 一6，8一二 ( ， 一二甲代烯丙基)黄烷酮和 tetrap terol I。马晓丰等 采用 HSCCC法，以正己 烷一氯仿一甲醇 一水 (1．5：3：3：2)组成的二相系统 对黄芪的醋酸乙酯粗提物进行了分离纯化，分离出 的毛蕊异黄酮纯度可达95％以上，并可以初步纯化 芒柄花素；然后用正己烷 一氯仿 一甲醇 一水 (4：4：5：4)组成的系统进一步纯化芒柄花素，其纯 度达 95％以上。Lijuan Chen 采用 HSCCC—MS联 用，以正己烷 一醋酸乙酯 一甲醇 一水为溶剂，从木 蝴蝶中分离得到了3个黄酮化合物，并鉴定纯度达 到92％以上。Du Q Z 以正己烷一醋酸乙酯一正丁 [通讯作者】 沈平娥，Tel：(021)38953270，E—mail：spn@nercmtcm．com。 s o 'IWM f 33 维普资讯 http://www.cqvip.com 醇一甲醇一醋酸一水 (1：2：1：1：5：1)为溶剂分离了 大豆中的黄豆苷、染料木苷，以正己烷一醋酸乙酯 一 甲醇 一水 (1：3：2：4)为溶剂分离了Ampelopsis grossedentata中的 (+)二氢杨梅黄酮。 2 生物碱 大多数的生物碱都具有较活泼的生物活性， 故生物碱的HSCCC提取文献报道较多。较常用的 溶剂系统主要是氯仿 一甲醇一酸性改性剂体系。 蒋凯等_9 采用 HSCCC分离纯化黄花乌头块根中的 生物碱类化学成分，其溶剂系统采用氯仿 一甲醇 一 0．2 mol·L 盐酸 (10：3：3)，从黄花乌头块根中 一 次性分离得到8个化合物，其中化合物 13B— diacetyl一14一hydroxyhetisine为新化合物，命名为 关附未素 (Guanfubase R)。洪波等 。。采用 HSC- CC对附子中的化学成分进行研究，分离得到了 15一 一羟基新乌碱单体，溶剂系统为氯仿 一甲 醇一0．3 mol·L 盐酸 (4：3：2)。颜继忠等⋯ 以氯 仿一甲醇 一0．2 mol·L 盐酸 (2：1：1)为溶剂体 系，用 HSCCC成功分离出金果榄中的巴马亭成 分，经测定组分纯度大于 99．6％，并由IR、 H． NMR和Ms确定结构。Fuquan Y等 ¨利用HSCCC 以氯仿 一甲醇一0．3 mol·L 盐酸 (4：1．5：2)为溶 剂系统，从乌头的总生物碱粗提物中分离出高乌 碱、Ⅳ一去乙酰基高乌碱。 3 有机酸 有机酸类是分子结构中含有羧基的一类化合 物，在中草药的叶、根特别是果实中广泛分布，常 见植物中的有机酸有脂肪族的一元、二元、多元羧 酸，如酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸 (即维生素 c)等，亦有芳香族有机酸如苯甲酸、 水杨酸、咖啡酸等。HSCCC分离纯化有机酸类成 分的研究已经被广泛报道。Thorsten Maier等 用 HSCCC分离了葡萄酱中的 hydroxycinnamoyhartaric acids，使用的溶剂系统为正己烷 一醋酸乙酯 一甲 醇 一水 (3：7：3：7)，结构经 HPLC、 H—NMR、LC— Ms分析鉴定。王凤美等 ¨采用 HSCCC，以正己烷 一 醋酸乙酯一水 一甲醇 (1．5：5：5：1．5)为溶剂系统 分离纯化丹参水溶性成分丹酚酸类物质，结果一次 分离可制备63．4mg丹酚酸 B，其纯度为98．6％。 该方法可作为高纯度丹酚酸B化学对照品的制备分 离方法。黄健光等_1 以正己烷 一醋酸乙酯 一甲醇 一 水 (7：3：6：4)为溶剂系统，成功分离了邻苯二酚 114／MNO 和对苯二酚这一对同分异构体。孙爱玲等 刮建立 了HSCCC分离制备厚朴的有效成分厚朴酚与和厚 朴酚的新方法，溶剂系统为石油醚一醋酸乙酯 一甲 醇 一1％醋酸 (5：5：7：3)。从100rag厚朴粗提物制得 和厚朴酚33．3mg，厚朴酚19．5mg，经HPLC分析， 纯度均大于 99．5％，其化学结构由。H．NMR和 ”C．NMR鉴定。Lu Haitao等 ¨应用正丁醇 一冰醋 酸一水 (4：1：5)系统从金银花中分离得到绿原酸。 4 蒽醌类及其他 陈存社等 ¨经过分析得出，用氯仿 一甲醇 一 丙酮 一水 (9：8：1：8)为溶剂系统分离纯化芦荟有效 成分蒽醌类物质芦荟大黄素和芦荟大黄素苷的效果 最佳。袁黎明等 ¨对芦荟的乙醇粗提物在不同的 溶剂系统比例下进行了分离，当氯仿 一甲醇 一水 (4：3．8：2)时，分离结果最好。王春燕等。加J应用 HSCCC法，以溶 剂 系统 氯 仿 一 甲 醇 一水 (9：10．5：8)的上相为固定相，下相为流动相，从 芦荟生药 中一次 性分离得 到芦荟 苷 (纯度 99．99％)和芦荟大黄素 (纯度95．83％)。实验中 还分离得到一个未知物，其薄层色谱鉴别与芦荟苷 一 致。经 HPLC测定其纯度为99．26％，是否为芦 荟苷的异构体，有待进一步研究。Yang F Q等 用氯仿一甲醇 一水 (4：3．8：2)分离了虎杖中的白 藜芦醇和白藜芦醇苷。Weiduo Si等 以正己烷 一 醋酸乙酯一甲醇 一水 (2：8：2：8)为溶剂，用 HSC- cc技术对绿茶粗提物中的杀菌成分进行了分离， 得到两个活性成分。Qizhen Du等 利用HSCCC技 术从越桔粗提物中提取花青素，从500mg越桔粗提 物得到 cyanidin一3一O—sambubioside和 delphini- din3—0一sambubioside提纯品 77mg和 130mg，其 溶剂系统为三氟乙酸一水 一正丁醇 一叔丁基甲醚 一 乙腈 (0．01：5：4：1：1)。 综上所述，HSCCC技术在我国中药和天然产物 领域的研究已经广泛展开。随着 HSCCC技术的发 展．HSCCC与紫外检测器连用已经不能满足分离的 要求．其与MS、傅立叶红外光谱 (FTIR)、蒸发光 散射 (ELSD)以及其他检测器的连用，为 HSCCC 技术的应用提供了新型多维分离分析方法，为HSC- cc在新药开发、成分研究、指纹图谱的建立以及标 准品的制备等方面的应用提供了技术支持。近年来， 国际上不断有新的 HSCCC技术和应用成果报道出 来，国内也不断有专家学者加入到HSCCC技术的应 维普资讯 http://www.cqvip.com 用研究队伍中，相信 HSCCC将会更加完善、更加完 美，并且极大地应用于人类生活的各领域。匝圈 参考文献 [1]HisaoOka，OkaH．。hoY．．Systematic searchfor suitabletwo -phase solvent system for high-speed counter-current chroma- tography[J]． Chromatography。1991，538(1)：99-l08． [2]潘霞，曹学丽，董银，等．芦荟色酮的高速逆流色谱分离制备 方法研究[J]．色谱，2O05，23(1)：96-99． [3]蔡定国，余佳红，刘文庸，等．高速逆流色谱制备巨分离纯化白果 内酯和橙皮甙对照品[J]．中药新药与临床药理1999，10(6)：364． [4]Yang F Q，Quan J，Zhang T Y，et a1．Multidimensional counter- current chromatographic system and its application[J]．Chro- matography A。1998。803(1-2)：298． [5]Jinyong Peng，Guomng Fan，Yutian Wu，et a1．Preparative i- solation and separation of a novel and two known flavonoids from Patrinia villo ssJuss by high．speed counter．current chro-- ·matography[J]．J Chromatography A，2O05，1092：235-240． [6]马晓丰。屠鹏飞。陈英杰。等．高速逆流色谱法分离纯化黄芪中 的芒柄花素和毛蕊异黄酮[J]．色谱，2OO5，23(3)：299-301． [7]Lijuan Chen。David Games，Jonathan Jones，et a1．Separa tion and identification of flavonoids in an extract from the seeds of Oroxylum indicum by high speed Counter-current Chromatography[J]．Journal ofLiquid Chromatography and Related Technologies，2003，26(9-10)：1623-1636． [8]Du Q Z，Cai wJ，Xia M，et a1．Purification of(+)．dihya~． myricetin from leaves extract of Ampelopsis grussedentata using high-speed counter--current chromatograph with scale--up triple columns[J]．ChromatographyA，2ID呓，973(1-2)：217． [9]蒋凯，杨春华，刘静涵，等．黄花乌头中Hetisine型生物碱的高速 逆流色谱分离与结构鉴定[J]．药学学报，2OO6,41(2)：128-13l_ [10]洪波，司云珊，赵宏峰，等．高速逆流色谱法分离附子中的 15- -羟基新鸟碱[J]．吉林农业大学学报，2O04，26(1)：3-／．58． [11]颜继忠，褚建军，徐聪，等．高速逆流色谱分离金果榄中巴马 亭[J]．理化检验化学分册，2O04，40(8)：450-451． [12]Fuquan Y，ho Y．Preparative separation of lappaeonitine，ran- aconitine，N·deacetyllappaeonitine and N-deaeetylranaconi- tine from crude alkaloids of sample A．conitum sinom ontanum Nakai by high-speed counter-current chromatography[J]．．， Chromatography A。2002。943：219-225． [13]311orsten M．，Solveigh S．，Dietmar R．KalTlnlel~r，et a1．Iso- lation of hydroxyeinnamoyltartaric acids from grape pomace by Kgh-speed counter-current chromatography[J]．Journal of Chromatography．A，2OO6，1128：61-67． [14]王风美，陈军辉，李磊，等．高速逆流色谱法分离制备丹酚酸 B[J]．天然产物的研究与应用，2OO6，l8(1)：100-104． [15]黄健光，李总成．利用高速逆流色谱分离邻苯二酚和对苯二 酚[J]．化学工业与工程，20O5，22(3)：249-251． [16]孙爱玲，冯蕾，柳仁民．高速逆流色谱分离制备厚朴的有效 成分厚朴酚与和厚朴酚[J]．分析化学研究 简报 工程竣工验收简报对口支援简报控辍保学的简报义务教育法简报棋类比赛简报 ，20O5，33 (7)：1016-1018． [17]h Haitao，Jiang Yue，Chen Feng．App lication of preparative gh speed counter-current chromatography for separation of chlorogenic acid from Flos Lonicerae[J]．J Chromatography A，2O04，1026：185-190． [18]陈存社，刘玉峰，周志兰．高速逆流色谱分离纯化芦荟中的 活性物质[J]．色谱，2003，21(4)：435． [19]袁黎明，谌学先，刘国祥，等．高速逆流色谱对芦荟有效成分 的制备出分离研究[J]．分析化学，2003，31(2)：251． [20]王春燕，蔡定国，柳正良，等．芦荟甙和芦荟大黄素的高速逆流 色谱法分离纯化[J]．中国医药工业杂志，2001，32(4)：145 ． 147． [21]Yang rQ，Zhang T Y，Yoichim ho，Large-scale separation of resveratrol，anthraglycoside A and anthraglycoside B from Pc- lygonum cuspidatum Sieb．et Zucc by high-speed countereur- rent chromatography[J]．Chromatogr A，2001，919(2)：443． [22]Weiduo Si，Johua Gong，Rong Tsao，et a1．Bioassay-guided purification and identification of antimicmbial components in Chinese green tea extract[J]．Journa／of Chromatography．A， 2006．1125：204 210． [23]Qizhen Du，Jem，G．，et a1．Isolation of two anthocyanin sambubiosides from hilberry by high-sPeed counter-current chromatography[J]．Journal ofChromatography．A，2004， 1045(1-2)：59 63． (收稿日期 2006．10．12) (上接第32页) [16]马云淑，刘月圆．黄连解毒巴布剂的研制与体外透皮吸收研 究 [J]．云南中医学院学报，20a2，25 (3)：31-33． [17]王建新，郭力，李令壤 如意巴布剂中透皮促进剂的选研究 [J]．中国中药杂志，1998，23(2)：90． [18]杨莉娅，谢松，吴云鸣，等．巴布剂复方紫荆消伤膏质量标 准研究 [JJ．中草药。20oo，31(11)：826． [19]陈志维，张兆华．好及施巴布剂在骨科疾病中的临床应用 [J]．中国中医骨伤科杂志，2003，ii(6)：51． [加]刘志敏，牛欣，牛淑冬．那如一3巴布荆的抗炎镇痛作用研 究 [J]．北京中医药大学学报，2oo5，28(3)：41． [21]唐良平，程泽，谭邦贵，等 肩腰腿一贴灵基质配比研究 [J]．时珍国医国药，2ooi，12(4)：289． [22]戴鸾眷，欧阳强．癌痛宁巴布剂皮肤刺激性和致敏实验 [J]．时珍国医国药，20oo，ii(12)：1o63． (收稿日期 2o06．08．29) SINO ¨ ／35 维普资讯 http://www.cqvip.com