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植物病害检疫检验技术真菌.ppt

植物病害检疫检验技术真菌

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2018-05-29 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《植物病害检疫检验技术真菌ppt》,可适用于市场营销领域

第四章植物病害检疫检验技术第一节植物检疫性真菌常见检疫检验技术直接检验比重检验染色检验洗涤检验保湿萌芽检验分离培养检验、适用范围混杂在种子间的较大病原体(线虫瘿、菌核)污染大量病菌孢子的种子(小麦腥黑穗病)种子带明显病症的病粒(小麦黑胚病)(一)直接检验肉眼检验小麦黑胚病粒腥黑穗病在检查时应先进行外表和周围的检查然后由表及里仔细观察病害症状、菌瘿、菌核等病症。对于苗木、接穗、插条等应注意茎、叶、芽、根各部位并需检查粘着和夹带的土壤。对块茎、块根以及鳞茎应特别注意芽眼、凹陷处、伤口和附着的土壤。主要工具:放大镜或解剖镜。检查要求:、检验方法:将送验样品分出一半试样放在白纸或白色塘瓷盘中检出线虫瘿、麦角菌、黑粉菌球、菌核及病粒称其重量计算病害感染率。、注意无病征的种子不一定是无病的种子。不同的病害可以表现类似的症状同一病害也可产生不同的症状。在确定某种病害时须与其他方法配合使用。、适用范围检查混杂在种子内较大的病原体如菟丝子、菌核、线虫瘿和杂草种子等。利用病原体与种子形状、大小的不同通过一定的筛孔将病原体筛出来然后进行分类称重。(二)过筛检验大豆菟丝子为害、检验方法将送验样品分出一半作为试样用规定孔径的筛子过筛。各层样品倒入白瓷盘内检查最下层的杂质倒入黑玻璃盘中用肉眼或放大镜检查。病原体含量()=病原体重量(g)试样重量(g)times过筛检验主要用于检验粮谷、种子、油料、干果和生药材。、适用范围:种子表面带病而肉眼看不见的种子病害。(附着在种子表面的病菌孢子)(三)洗涤检验小麦矮腥黑穗病菌洗涤检验法原理:主要用于检查附着在种子表面的各种真菌孢子。种子表面常附着真菌孢子将一定量的样品放入容器内加一定量的无菌水充分振荡可使病菌孢子洗涤下来而后离心后可沉淀镜检沉淀物可确定其种类和数量。主要仪器和试剂:振荡器、离心机、显微镜、%吐温溶液等、检验方法:样品制备:取样(g)份于ml三角瓶内加蒸馏水ml(加%吐温溶液)振荡~min显微计数:悬浮液~rmin离心~min吸去上清液留ml沉淀部分滴于个载玻片加盖玻片镜检每片检查个视野并计算每视野平均孢子数N=ntimesntimesnm式中:N--每克种子的孢子负荷量n--每视野平均孢子数n--盖玻片面积上的视野数n--ml水的滴数m--供试样品的重量(g)如果镜检洗涤液时没有检查到病菌孢子则对同一样品要重复几次取样洗涤对每一洗涤液至少要镜检张玻片。当一个样品两次取样洗涤检验的结果相差很大时则需要重复一次。检验结果有四个影响因素:a.种子或其他粮谷类产品表面所粘附的病菌孢子不一定能完全洗涤下来。b.在离心管内悬浮液表面常形成一层极难沉降的孢子薄膜而管壁上也可能粘附着孢子使检验结果很难代表实际情况因而影响计算的准确性c.将悬浮液滴于玻片时由于孢子迅速沉淀造成一些视野间孢子分布极不均匀这也影响计数的准确性都可能增加误差程度d.操作不够严格会造成人为误差以及制样中也会出现偏差。原理:由于菌瘿、菌核、病秕粒都要比健康籽粒轻。若将其浸入一定浓度的食盐水(糖、泥土等)或其他溶液中时就会浮于液面。捞取浮物结合解剖镜进行检验即可鉴定其种类。(四)比重检验法比重检验法一般用于检验种子、粮谷、豆类中的菌瘿、菌核和病秕籽粒等。原理:某些植物或植物器官被病原感染后或某些病原物本身常可用特殊的化学药品处理使其染上特有的颜色帮助检出和区分病虫种类。这种方法即为染色检验法。例如:马铃薯癌肿病(薯块上癌瘤不明显时可做徒手切片加滴%的ldquo藏花红rdquo染色液健康组织细胞壁呈亮红色感病组织细胞壁呈暗红色。麦类赤霉病的检验:将病粒放在对硝基苯胺酒精溶液中经小时受侵染部分或有菌丝分布的部分呈现暗红色至咖啡色而未受侵染部分为黄色℃温度下颜色更明显。(五)染色检验法(六)解剖检查法有许多病害或一些病害初发生阶段在种子、苗木及其他植物产品表面没有明显的症状诊断比较困难有时为要了解病原物潜伏的场所常常需要用解剖检验进行鉴定如散黑穗病菌以菌丝体在胚中越冬,有的果树病害以菌丝体在花芽或鳞片中越冬。解剖检验主要采用徒手切片或切片机切片经过染色制成玻片标本后放在显微镜下观察鉴定。对于某些病害或种子苗木及其产品有时采用粗放的解剖方法也可进行检查。(七)保湿萌芽检验原理:种子携带的真菌无论外表黏附的还是潜伏种子内的在种子萌发阶段即可开始侵染甚至有些在种子还未萌发时就可长出病菌。主要仪器及试剂:吸水纸、沙土、冰箱、培养箱等。常规植物病理学方法保湿萌芽检验的方法:、保湿培养检验、沙内萌芽检验、土内萌芽检验、试管幼苗症状测定.保湿培养检验此法一般又分为:吸水纸法、冰冻吸水法和琼脂平皿法等。()吸水纸法广泛用于各种类型的种子包括禾谷类、豆类、麻类、烟草、各种蔬菜、观赏植物和树木种子等种传真菌病害的检验。吸水纸法的标准操作:a用三层无菌吸水纸吸足无菌水后滴掉多余的水放人经消毒的培养皿内将种子排列在吸水纸上。b各粒种子间要保持一定距离一般不得少于cm再将培养皿置于适当温湿度的恒温箱培养。c在培养期间每天用h光照和黑暗交替处理保持一定周期。d作物种子和病菌一般经d培养种子表面就会长出待检病菌最后进行镜检。优点:设备简单应用范围广操作方便花费少快速准确易于掌握受检病症立体感强容易鉴定和便于制作标本等。缺点:在此条件下有些真菌的菌丝生长不旺盛和产孢量少而很快被许多杂菌快速生长超过或掩盖被检病菌。吸水纸法的特点:()冰冻吸水法这是一种改进的保湿培养法其操作步骤如下:a种子排列在吸水纸上一般谷物种子在℃下保持d使其先萌芽。b℃的温度下保持d(其他种子在℃下保持d)。c再将幼苗在℃的温度下进行冰冻过夜以死亡的幼苗作为培养基。d℃的温度下用光/暗交替处理h保持d。为了防止细菌的污染可在吸水纸上加些抗生素如times金霉素或土霉素等数滴。优点:有利于病原物形成孢子同时又避免因种子萌芽伸长后造成相互覆盖便于检查。()琼脂平皿法此法与吸水纸法所不同之处就是用%琼脂经灭菌后倒入无菌培养皿中制成一定厚度的平面代替吸水纸。优点:因含水量均匀一致有利于病原菌生长皿内洁净杂菌少便于检查因此常用于植物检疫检验。琼脂平皿法用于棉花枯、黄萎病菌的检验。将沙用清水洗去泥垢然后用沸水煮过铺在经酒精或福尔马林液消毒过的萌芽器内加冷开水至含沙量的%左右。沙面应低于容器边缘cm在铺平的沙上排列种子间隔一定距离。排好种子后再加细沙覆盖cm并加容器盖置于℃的温箱中。当第一个幼芽长高碰到顶盖时即应去盖。经过一定时期将幼芽连根取出并取出发芽的种子根据幼苗和未发芽种子所表现的症状及种苗上有无孢子就可计算发芽率及发病率。.沙内萌芽检验.土内萌芽检验将种子播种在含有灭菌土壤的盆钵或播种箱内保持适宜发芽的温、湿度。待种子发芽出土后进行检验分析其发病情形。.试管幼苗症状测定做试管斜面每管放人粒种子塞紧管口。再置于℃下用人工光照和黑暗各半处理。当幼苗达到管顶时即可将管盖取掉。待培养期到后检查幼苗症状。保湿萌芽检验的优点:容易检查根部和绿色部分也可避免相互传染但操作较麻烦一般可用于检验珍贵的繁殖材料。保湿萌芽检验的缺点:、在对寄主生长发育不良而适宜于病菌生长发育的条件下则某些腐生菌可能变成萌芽阶段的寄生菌造成幼芽发生部分病斑。、由于主要还是依靠肉眼检查多种病害可以产生类似的病症就是同一种病害也可发生不同的症状等这些情况都足以影响检验结果的准确性。(八)分离培养检验分离培养主要应用于检验潜伏于种子、苗木或其他植物新产品内部不易发现和鉴定的病原菌或当种子、苗木或其他植物产品上虽有病斑但无特殊性的病原菌可供鉴定的场合。不同的病原菌其所用的培养基、分离方法、培养条件等不尽相同必须因病制宜地加以使用。通过分离培养所得到的待检病菌应通过必要的步骤进行仔细鉴定。分离真菌的方法有:、组织分离法:将样品材料经表面消毒并冲洗后切成小块轻轻置于培养基平板表面写好标签后即可培养观察。、稀释分离法:将寄主组织受害部位的孢子洗下配成悬浮液经稀释后与熔化并冷却℃左右的琼脂培养基混合然后倒在灭菌的培养基中。从种子、苗木及其他繁殖材料上获得的病菌有时还需接种到植株上使其表现典型症状后再检查鉴别。(九)接种方法由于病原种类与传播方式不同其接种的方法也各不相同常用接种方法有下列几种:()拌种接种:用病菌孢子拌种是接种黑粉病(如矮腥黑穗病)最常用的方法。()浸种接种:用病原真菌孢子悬浮液浸种也是常用的接种方法。()花期接种法:主要用于从花期侵入的病菌。如:大麦、小麦散黑穗病菌的接种。在抽穗后天用冬孢子悬浮液注射到花内。()整株喷雾接种:孢子悬浮液喷在叶片或茎部()土壤接种法:针对一些土传病菌如棉花枯、黄萎菌。核酸技术是一种DNA分析鉴定技术其方法快速、准确因此在植物病原菌的分类鉴定和亲缘关系分析等方面已有广泛的应用。核酸技术基于PCR(聚合酶链式反应)它是一种体外DNA扩增技术由于其快速、准确、所需样品量少的特点十分符合植物检疫检验过程的要求。根据不同的检疫对象需设计出特异性的引物就可鉴定特定的病原菌。(十)核酸技术(十)隔离种植检验不易发现症状或病原物需要在生长发育阶段进行病害观察或分析鉴定。隔离种植应在温室或极为严密的隔离区进行并在各个生长发育阶段进行观察。对不同的病害用不同的方法:对较大的病原体过筛肉眼对种子外表有明显症状的表面带菌但看不见的洗涤滤纸培养胚内病菌离体胚培养种子内部的病原菌琼脂培养肉眼第二节植物病原细菌检疫检验技术主讲:王晓东副教授所有已知植物细菌病害都可以通过种苗传播通过种子传病的占%以上准确检测种子和种苗是否携带检疫性病原细菌是防治这类病害的关键。一、病原细菌的检测植物病原细菌的检测方法大致可分为直接检测和间接检测两大类。直接检测:检测病原细菌时病原物不被提取或分离出来。间接检测:先把病原细菌提取、分离或破坏以后进行检测。又分为活菌检测和非活菌检测。(一)直接检测直观检验直观检验是以症状为主的田间检测植物细菌病害的产地检疫主要是以这种方式进行的。通过肉眼观察植株的症状、菌脓以及镜检观察并结合田间诊断结果而做出。快速诊断细菌性病害方法细菌溢生长检验:生长检验有实验室和田间幼苗症状检验两种。()实验室检验:这种检验是将种子播种在湿润吸水纸上或水琼脂培养基平板上根据幼芽和幼苗症状做出初步诊断。()田间幼苗症状检验:此法常受到环境条件的影响。在植物检疫中生长检验多作为初步检验。(二)间接检测活菌检测()分离培养法检验A分离病原细菌一般用稀释分离法。稀释分离有以下两种方法。培养皿稀释分离法平板划线分离法培养皿稀释分离法平板划线分离法取小块病组织用灭菌玻棒研碎。静置一定时间用灭菌的移植环蘸取以上组织液在琼胶平板上划线培养先在平板的一侧顺序划~条线再将培养皿转deg将移植环灭菌后,从第二条线末端顺序划出条线。目的都是使细菌分开形成分散的菌落。传统鉴定方法培养性状观察培养性状对细菌的鉴定是很重要的。不同属的植物病原细菌它们的培养性状显然不同。培养性状要分别在培养液、琼胶斜面和琼胶平板上观察。描述时要指明培养基、培养时间和培养温度等。细菌的色素非水溶性色素:水溶性色素:细菌的形态革兰氏染色法阳性菌mdashmdash紫色阴性菌mdashmdash红色鞭毛染色涂片干燥固定染色min水洗、吸干镜检制备涂片标本rarr染色生理和生物化学性状用细菌的培养物接种于一些特定的培养基上或检测管内通过产酸、产气、颜色变化等反应检测细菌的耐性、好氧或厌氧性、对碳素、氮素和大分子化合物的利用和分解能力等以达到鉴定的目的。常见的生化反应对糖的发酵甲基红试验单糖发酵试验对蛋白质的发酵吲哚试验硫化氢试验其他试验尿素酶试验枸橼酸盐利用试验目前在传统测定的基础上发展了测定细菌多项生理生化指标并且借助于计算机统计和决策的快速测定方法。常见的有生化测定试剂盒、Biolog测定、甲基脂肪酸气相色谱分析法等。()浓缩接种及离体叶检测法把繁殖材料或种子的提取液经浓缩后通过注射、针刺、摩擦、剪叶或喷雾接种等方法接种到感病植物上观测是否发病及其症状特点()噬菌体检验原理:噬菌体侵染细菌裂解寄主细胞在固体平板上培养则出现噬菌斑。噬菌体具有专化性利用此特点可鉴别细菌的种类。噬菌体是侵染细菌的病毒能在活细菌细胞中寄生、繁殖并裂解寄主细胞。优点:噬菌体法要是简便、快速能直接用种子提取液测定。缺点:非目标菌量多存在时敏感性较差噬菌体寄生的专化性和细菌对噬菌体的抵抗性都可能影响检验的准确性。过敏性反应mdashmdash致病性的初步测定为了确定分离到的大量菌种哪些是致病性的用常规接种方法比较费事有的要经过相当长的时间。用植物的过敏性反应来快速筛选致病性细菌。方法是将浓度ml的细菌的悬浮液注射在烟草叶片的细胞间致病性细菌往往在h内就在注射点周围出现过敏性枯斑而腐生性细菌则不表现这种反应。注射Pseudomonas属细菌的一般在h即出现枯斑注射Xanthomonas属细菌的要h。烟草、蚕豆叶片也是很好的试验材料。用于植物病原细菌鉴定和检测的主要方法、非活菌检测()免疫吸附分离检测法原理:结合血清学与平板分离技术利用与抗原高度亲和性的抗体来捕获目标细菌样本中其他细菌均被冲洗掉再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。方法:平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法该法可以定性、定量检测样品中的抗体或抗原具有灵敏、简单、快速等优点已被广泛地用于植物病原细菌的检测。在这种测定方法中有种必要的试剂:①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)②酶标记的抗原或抗体(标记物)③酶作用的底物(显色剂)酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺,lsquo连胺基(乙基并噻唑啉磺酸)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色碱性磷酸酯酶硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚ASMx磷酸盐重氮盐黄色红色葡萄糖氧化酶ABTSHRP葡萄糖葡萄糖甲硫酚嗪噻唑兰黄色深蓝色betaD-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色,免疫荧光抗体测定是先将荧光染料(异硫氰酸荧光黄或罗丹明等)与抗体以化学方法结合起来形成标记抗体。当与相应的抗原反应后产生有荧光标记的抗体抗原复合物。()免疫荧光抗体法荧光染料不影响抗体的免疫特性但在荧光显微镜下能观察到黄绿色荧光荧光的存在就表示抗原的存在。()PCR技术及其应用PCR的原理基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段引物DNA聚合酶℃变性℃退火XX℃延伸℃PCR的过程重复~步~轮目的DNA片段扩增万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成条单链子链延伸DNA加倍标准的PCR反应体系种dNTP混合物各micromolL引物     各~pmol模板DNA   ~microgTaqDNA聚合酶uMg     mmolLPCR的特点灵敏度高皮克(pg=)量级扩增到微克(microg=)水平能从万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达个RFU细菌检测的最小检出率为个细菌简便、快速一次性加好反应液~h完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA总之对于植物病原细菌的检验检疫目前国内外多采用一种ldquo活体检测法rdquo和一种ldquo非活体检测法rdquo相结合的办法进行植物病原细菌的检测两种方法取长补短以达到理想的效果。

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