巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展

江苏农业科学2012年第40卷第3期 一35一姚 晶，吴正钧，任婧．巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展[J]．江苏农业科学，2012，40(3)：35—38巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展姚晶1’。，吴正钧2，任婧1(1．乳业生物技术国家重点实验室／光明乳业股份有限公司技术中心，上海200436；2．上海海洋大学食品学院，上海201306)摘要：巴氏毕赤酵母表达系统具有优良的特性，是目前广泛应用的微生物表达系统之一，它在理论研究和实践应用上尤其是在大规模发酵中具有重要的意义。本研究综述了巴氏毕赤酵母的生物学和遗传学特性，详细阐述了巴氏毕赤酵母表达系统的组成以及影响外源基因表达的因素，并提出了一些提高表达量的方法。关键词：巴氏毕赤酵母；表达系统；表达；影响因素中图分类号：Q786 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2012)03—0035—04随着分子生物学理论研究的不断深入，分子生物学技术得到了快速发展，与此同时，构建的不同表达系统也层出不穷。巴氏毕赤酵母(Pwhiapastor括)是1969年由Ogata等首次发现的，并于20世纪80年代迅速发展为一个新兴的表达系统。巴氏毕赤酵母表达系统具有优势的生物学和遗传学特性，和大肠埃希菌(Escherwhmcoli)、酿酒酵母(Saccharo—m，，凹scerev西iae)等传统表达系统一样，被广泛用于外源基因的表达。1巴氏毕赤酵母的特性巴氏毕赤酵母是一种甲基营养型酵母。甲基营养型酵母是指一类可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长的酵母菌，主要包括：汉逊酵母属(Hansenula)、念珠酵母属(Candida)、球拟酵母属(％删掣蠡)、克勒克酵母属(K如eck—em)以及毕赤酵母属(Pwhia)等。现研究证实，可作为表达外源蛋白的宿主菌的主要是巴氏毕赤酵母(P．pastoris)和多形汉逊酵母(Hpolymorpha)旧o。甲基营养型酵母的甲醇代谢途径与甲醇氧化机制非常相似，图1为甲醇在巴氏毕赤酵母中的代谢过程睁1，甲醇酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长，因为其细胞中含有甲醇代谢途径的必需酶，如醇氧化酶(AOX)、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中AOX是甲醇酵母代谢途径中的第1个酶，它催化甲醇被氧化为甲醛和过氧化氢，过氧化氢进一步由过氧化氢酶分解成水和氧。甲醛在胞浆内被甲醛脱氢酶(FMD)和甲酸脱氢酶(FMDH)氧化成CO：，或者在5一磷酸木酮糖(Xu5P)、二羟丙酮合成酶(DHAS)催化下形成3一磷酸甘油醛(GAP)和二羟丙酮(DHAP)；DHAP与GAP在1，6一二磷酸果糖醛缩酶作用下形成果糖一1，6一二磷酸(FBP)；FBP又经1，5一二磷酸果糖酶去磷酸化生成Xu5P和GAP；Xu5P又一次参加循收稿日期：2011—05一09基金项目：国家“973”计划(编号：2010cB735705)；上海市科委课题(编号：09DZ2251400)。作者简介：姚晶(1987一)，男，江苏宜兴人，硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。E—mail：yawin905@sina．com。通信作者：任 婧，博士，主要从事乳酸菌分子生物学研究。E—mail：叫ing@bnghtdairy．corn。1一醇氧酶；2一过氧化氢酶；3一甲醛脱氢酶；4一甲酸脱氢酶；5～二羟丙酮合成酶；6-二羟丙酮激酶；7—1，6一二磷酸果糖醛缩酶；8一果糖一l，6．二磷酸化酶；9一甲醛还原酶图1 巴氏毕赤酵母中甲醇的代谢途径环，而GAP有1／3进入主代谢途径，用于合成其他物质。从图1中可以看出，在甲醇代谢途径中，涉及到多种酶，这些酶都是由染色体上的有关基因编码表达的。巴氏毕赤酵母染色体内含有甲醇代谢必需的关键调控酶——醇氧酶(al-eoholoxidase，AOX)基因，它可以产生2种酶——A0x1和AOX2。当葡萄糖、甘油或乙醇等作为碳源时，AOX几乎不表达，进一步研究表明AOX的表达受转录水平调控，强诱导型启动子Paox能有效控制AOX表达H1。最近有研究报道，将顺式元件与原始启动子连接成新型的人工启动子，可以提高外源蛋白的产量和活性”1。此外，甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶(pero】【isome)体中，形成区域化：在以葡萄糖作碳源时，菌体中只有1个或几个很小的过氧化物酶体；而在以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80％，因此，当在AOX基因前利用同源重组方式插入外源蛋白基因时，可获得大量表达怕1。在构建表达菌株时，AOX的1个或2个基因的缺失就会导致菌株对甲醇利用能力的改变，根据菌株的基因型可将毕赤酵母分成3种表型：(1)甲醇快利用型菌株(Mut+)，它含有AOXJ基因，能够快速利用甲醇作为碳源和能源，以野生型速率生长；(2)甲醇慢利用型菌株(Mut8)，它虽然不含有AOXJ基因，但含有AOX2基因，能缓慢利用甲醇；(3)甲醇不利用型菌株(Mut一)，它与AOXJ万方数据一36一 江苏农业科学2012年第柏卷第3期和AOX2基因同时缺失，不能在甲醇培养基中生长。2巴氏毕赤酵母表达系统2．1宿主菌株巴氏毕赤酵母是DNA转化的宿主菌，该体系以巴氏毕赤酵母缺乏组氨酸脱氢酶的营养缺陷突变株为基础。如表1所示，目前用于外源基因表达的巴氏毕赤酵母菌株为Invitrogen公司构建，主要有X一33、GSll5、KMTI和SMDll68等，用得较多的是巴氏毕赤酵母GSll5，它们都是由原始菌株巴氏毕赤酵母NRRLY一11430衍变而来的”o。SMDll68菌株为蛋白酶缺陷型菌株，这类菌株基因组中缺失编码蛋白酶A(PeP4)和编码蛋白酶B(prbl)的基因。蛋白酶缺陷型菌株减弱了蛋白酶对外源蛋白的降解作用，特别适用于分泌型表达。GSIl5、KM71菌株均为组氨酸脱氢酶基因缺陷型菌株(his4)，培养基中必须含有组氨酸才能生长，利用这一特性可以在无组氨酸的葡萄糖基础培养基(minima]dextrosemecli—ttm，MD)上筛选阳性转化子。裹1几种常见的巴氏毕赤酵母寰达菌株豆其基因型和表型菌株基因型表型GSll5Ah／s4Mut+．His—KM71／,h／s．aozl：：AR9．4，d讲Mut‘。His—KMTlHaox1：：ARG4，耐Mut‘SMDll68ddds4，d粥P4Mut+．His一．Pep4一SMDll68H蜊Mut+，Pep4—2．2表达戢体巴氏毕赤酵母胞内没有天然质粒，表达载体需要和宿主菌染色体进行同源重组，从而达到外源基因在宿主菌中进行异源表达的目的。为了达到这个目的，选择的表达载体一般为整合型载体”】。表达载体都是穿梭质粒，能够穿梭于大肠杆菌和巴氏毕赤酵母之间．包括启动子、克隆位点、终止序列和筛选标记等，图2为InviUogen公司构建的一种商品化表达载体pA0815，它和pPIC9、pPiC9K等表达载体一样。含有强诱导表达的启动子P筛选标记基因H／s4以及整合到宿主菌染色体靶位点的3’AOXJ序列；此外，pA0815还有多个插人位点，而且可以控制目的基因的拷贝数。表2是巴氏毕赤酵母常用表达载体的信息，根据表达载体的表达方式可以分为分泌型表达载体(如pPICgK)和胞内型表达载体(如pAOSl5)，这2种表达载体的基因组件虽然各有特点．但还是具有一些共同的序列．如这些载体都包括一个表达盒(c挣sette)和一个多克隆位点，表达盒由900bp的5’AOXJ序列和约300bp的3’转录终止序列组成。2．3巴氏半赤酵母表达系统的特点巴氏毕赤酵母表达系统具有较多优点[91：(1)营养要求低，生长周期短，适合高密度培养，成本低廉；(2)胞内存在合成过氧化酶的微体，有利于外源基因的表达，且避免了产物蛋白的损失；(3)含有甲醇诱导机制的相关基因(如强诱导性启动子P．帆)，对外源基因的表达严格调控；(4)同源重组后形成十分稳定的重组子。有利于外源基因过量表达。目的蛋白产量较高；(5)拥有真核生物对产物蛋白的修饰加工功能，能更飞}●l＼0．●图2巴氏毕赤酵母表达mItpA0815一切圈谱裹2几种常见的巴氏毕赤酵母寰达藏体表达载体表达类型标记基因pP]cz胞内掘‘pPIC6胞内^VpAOSl5胞内h／s4．amp’pPlCZcx分泌掘7pPIC9K分泌抽4．^∞’pPIC6a分泌6W好地保持目的蛋白的生物学活性。3表达的影响因素 ·巴氏毕赤酵母表达系统之所以能够高效地表达外源基因。与其独特的生物学和遗传学特性是分不开的。与开发最早最普遍应用的大肠杆菌表达系统相比，巴氏毕赤酵母表达系统产量高，产物纯化简单，且生物学活性好；与最早开发的酵母类表达系统——酿酒酵母表达系统相比，它营养要求低，重组子稳定性好，且含有严格的甲醇诱导表达机制的相关基因．表达效率高”。目前，已有数百种外源蛋白在巴氏毕赤酵母表达系统中成功表达，表3列举了几种近几年在巴氏毕赤酵母表达系统中成功表达的外源蛋白。虽然巴氏毕赤酵母表达系统具有高效表达外源基因的能力，但并不是每个实验室构建的表达系统都能够高效表达，它受影响的因素较多。如外源基因、分泌信号、翻译后修饰、培养条件等因素都会对其高效表达产生影响。表3近几年在巴氏毕赤酵母中裹达的外蠢叠白【¨一‘3．1外濠基因外源基因是通过表达载体整合到巴氏毕赤酵母的染色体上的，因此，其自身的结构性质是外源基因在巴氏毕赤酵母表达系统中高效表达的重要影响因紊。外源基因AT含量过高，常常导致翻译表达过程提前终止，使其不能有效表达；相反。GC古量过高．特别是在mRNA5’端翻译区，容易导致翻译万方数据姚晶等：巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展一37一能障过高，翻译过程不III顷利进行，进一步导致表达量减少；大影响‘24“。。另外，培养基的碳源及其浓度也对巴氏毕赤酵另外，mRNA5’端非翻译区序列的结构和长度也会对外源基母表达系统有较大影响。在毕赤酵母表达体系中、，混合碳源因的有效表达产生影响Ⅲ。1。因此，可以通过调整外源基因流加策略被逐渐采用，甘油、山梨醇等碳源和甲醇的混合添加的AT和GC含量，使之顺利表达。此外，选择的外源基因应可以提高细胞活力，增强醇氧酶活力，提高毕赤酵母表达外源尽量避免稀有密码子，尽可能含有巴氏毕赤酵母偏好的密码蛋白效率，其中山梨醇与甲醇的混合流加效果最为显著∽“，子，这样可以提高翻译效率，从而增加表达量。1“。如人类葡如利用山梨醇与甲醇的混合流加生产碱性果胶酶，酶活性和萄糖脑苷脂酶基因在巴氏毕赤酵母中表达时，通过优化密码生产强度比对照分别提高了84．6％和45．2％，实现了碱性果子和调整GC含量，其产量分别增加了10．6、7．5倍‘1。基因胶酶的高效生产、2。此外，诱导剂浓度及添加时机、方式直剂量也会对外源基因的表达产生影响，基因剂量就是指外源接关系到外源基因的高效表达，也关系到所产蛋白中完整蛋基因在巴氏毕赤酵母表达系统中的拷贝数。在一般情况下，白的含量‘。表达量和基因剂量呈正相关关系；也有研究报道，一些基因的巴氏毕赤酵母表达系统最大的一个弱点是存在降解表达在单拷贝时可以达到最大表达，而随着拷贝数的增加，表达量蛋白的蛋白酶。不少学者对发酵过程中的蛋白酶进行了监反而减少Ⅲ。，这可能是随着拷贝数的增加而产生的负反馈机测，Wu等认为总蛋白酶活性随着发酵过程的推移不断增制调控的结果。强Ⅲ1；Wang等在开始用甘油培养时没有发现蛋白酶活性，而3．2分泌信号当用甲醇诱导培养时发现，蛋白酶活性迅速上升并维持在一一般来说，为了更加方便获得巴氏毕赤酵母表达系统的定水平‘3。因此，如何控制蛋白酶的降解和表达蛋白的稳定表达蛋白，都期望表达蛋白可以分泌到环境中。如表2中所是培养过程中须要密切关注的问题。首先，培养基组成与蛋列举的几种分泌型表达载体构建的表达系统，他们利用自身白酶的产生有很大的关系，在合成培养基中，氮源的缺乏往往的分泌信号就可以将表达分泌至胞外。而对于自身没有分泌伴随着蛋白酶活性的增加，可以在天然培养基或者氨基酸富信号的表达系统，就需要选择一些合适的分泌信号；如果选择足的培养基上培养，这样既可以避免氮源的缺乏，又可以通过的分泌信号不合适，会导致表达蛋白分泌量的减少，甚至不分培养基中充足的酶解底物抑制蛋白酶的活性，获得较高的产泌，另外还会对目的蛋白的正常翻译产生不利影响。因此，可量口“。其次，培养温度也会影响表达蛋白的稳定性及诱导表以通过优化信号肽密码子、适当地增加氨基酸和改造表达载达效率。Jahic等在研究中发现，虽然较低的温度能显著限制体信号肽，将表达载体改造为新的表达载体，如谢涛对菌体的生长，但是此时蛋白酶的活性最低，同时AOX的活性pPIC9K中d因子信号肽进行密码子的优化改造时，人工合成增强，表达蛋白的产量增加了1倍日“。同样，pH值也影响着新的信号肽MS，构建了新型酵母表达载体pPIC9K—MS，其蛋白酶的活性和表达蛋白的稳定性。根据研究报道，在pH构建的2株不同植酸酶工程菌表达量就出发菌株在BMGY／值5．5～8．o时，蛋白酶的活性最低，同时表达蛋白稳定性也BMMY培养基中分别提高了2．81、1．51倍旧“。能维持在较高水平’3。另外，在培养体系中加入蛋白酶抑制3．3翻译后修饰剂也是控制蛋白酶降解的有效手段。Sinha等在培养体系中分巴氏毕赤酵母表达系统能进行与高等真核细胞相似的许别加入了1mmol／L丝氨酸蛋白酶抑制剂——苯甲基磺酸氟、多翻译后修饰，包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、脂类添1mmol／L的EDTA及1mmo]／L苯甲基磺酸氟和1mmol／L加、0一连接糖基化和N一连接糖基化等，通过翻译后修饰，MEDTA的混合物，其总蛋白酶活性分别降低了78％、45％、表达蛋白才具有生物学活性。翻译后修饰是对表达蛋白分泌 94．2％[34]．前很复杂的加工过程，其中包括一系列酶促反应，保证修饰过程的顺利进行是稳定表达蛋白高水平表达的先决条件。2“。4结语如毕赤酵母对产物蛋白过度糖基化加工，会导致产物产量和巴氏毕赤酵母表达系统作为新兴的表达系统，已经广泛活性的降低，为了避免过度糖基化，可以通过定向突变去除糖地用于多种蛋白的高效表达，它既具有原核表达系统的操作基化位点、将目的蛋白质与糖苷酶共同表达、构建重组基因简单、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具库、改变培养基、在体内用衣霉素抑制糖基化及用酶对重组蛋有真核表达系统的对外源蛋白翻译后修饰等特点，如糖基化、白质去糖基化等手段避免目的产物过度糖基化口“。蛋白磷酸化等；同时它还避免了酿酒酵母的分泌效率差、表达3．4培养条件菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，在分子生物学、微生和其他表达系统相似，培养条件对于巴氏毕赤酵母表达物学等多个领域中发挥了重要的作用。随着对巴氏毕赤酵母系统高效表达有着举足轻重的影响。在大规模生产目的蛋白表达系统研究的不断推进，将有越来越多的外源基因在巴氏时，往往是利用发酵罐进行高密度连续培养，因此，通过对发毕赤酵母表达系统中成功高效表达，在分子生物学、微生物酵条件的优化，可以达到实际的最高产量。温度、pH值、溶氧学、医学等相关领域及工业化应用中发挥出更大的作用。量等因素直接或者间接影响菌体生长。例如巴氏毕赤酵母的最佳生长温度为30℃，而有报道称15℃的诱导温度可以有 参考文献：效提高外源蛋白的产量，另外，较低的温度可以降低蛋白酶的[1]SiegeiRS．MethylotroyphicyeastP／ch／apastourproducedinhiishcell活力，从而增加目的蛋白的产量；巴氏毕赤酵母的最佳生长densityfermentationwithhi【ghcellyieldsasvehicleforrecombinantpH值为3～7，如果培养基的pH值不在这个范围内，虽然对proteinproduction[J]．BiotechnologyandBioegineering，1989，34：菌体生长没有很大影响，但是对蛋白的稳定性及其活力有很 403—404．万方数据一38一江苏农业科学2012年第40卷第3期[2]CereghinoJL，CreggJM。Heterologousproteinexpressioninthem一[19]SinclairG，ChoyFY．Synonymouscodonusagebiasandtheexpres—ethylotrophicyeastPichiapastoris[J]．FEMSMicrobiolRev，2000，sionofhumanglucocerebresidaseinthemethylotrophicyeast，Pichia24(1)：45—66．pastoris[J]．ProteinExprPurif，2002，26(1)：96—105．[3]QureshiMS．利用pH和甲醇在线控制策略促进Pichiapastoris[20]MurasugiA，Tohma—AibaY．Comparisonofthreesignalsforsecre—GSll5发酵生产碱性果胶酶[D]．无锡：江南大学，2009．toryexpressionofrecombinanthumanmidkineinPichiapastoris『4]XieJL，ZhouQw，DuP，eta1．Useofdifferentcarbonsourcesin[J]．BioscienceBiotechnologyandBiochemistry，2001，65(10)：cultivationofrecombinantPichiapastorisforangiostatinproduction2291—2293．[J]．EnzymeMicrobTechnd，2005，36(2／3)：210—216，[21]谢涛．表达载体信号肽改造提高毕赤酵母植酸酶phyA基因表[5]Ha．,恤erFS，RuthC，LangeneggerD，eta1．Promoterlibrarydesigned达量研究[D]．雅安：四川农业大学，2006．forfine—tunedgeneexpressioninPichiapastoris[J]．NucleicAcids[22]ViilatteF，HusseinAS，BachmannTT，etal。ExpressionlevelofRes，2008，36(12)：e76．heterologousproteinsinPichiapastorisisinfluencedbyflaskdesign[6]ScorerCA，BuckholzRG，ClareJJ，eta1．Theintraeellularproduc—[J]．AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2001，55(4)：463tionandsecretionofHIV—Ienvelopeproteininthemethylotrophie—465．yeastPichiapastoris[J]．Gene，1993，136(1／2)：111—119．[23]顾园，诸欣平，王少华．毕赤酵母表达蛋白质的糖基化[J]．生[7]BarrKA，HopkinsSA，SroekrishnaK．Protocolforefficientsecretion命的化学，2004，24(4)：353—355．ofHSAdevelopedfromPichiapastoris[J]．PharmEng，1992，[24]WuD，HaoYY，ChuJ，eta1．Inhibitionofdegradationandaggrega—12：48—51．tionofrecombinanthumanconsensusinterferon·-otmutantex--[8]ShiX，KarkutT，ChamankhahM，eta1．OptimalconditionsforthepressedinPichiapastoriswithcomplexmediuminbioreactor[J]．expressionofasingle—chainantibody(scFv)geneinPichiapastorisApplMicrobiolBiotechnol，2008，80(6)：1063—1071．[J]．ProtExpPur，2003，28(2)：321—330．[25]SirenN，WeegarJ，DahlbackaJ，eta1．Productionofrecombinant[9]XiongAS，YaoQH，PengRH，eta1．Highlevelexpressionofasyn—HIV一1Nef(negativofactor)proteinusingPichiapastorisandathetiegeneencodingPeniophoralyciiphytaseinmethylotrophicyeastlow—temperaturefed—batchstrategy[J]．BiotechnolApplBio·Pichiapastoris[J]．Appl MicrobiolBiotechnol，2006，72(5)：1039—1047．[10]CreggJM．MethodsinMolecularBiologyV01．389Pichiaprotocols[M]．2nded．Totowa：HumanaPress，2007：1—10．[11]S6mehez—VenegasJR，NavarreteA，DinamarcaJ，eta1．Cloningandconstitutiveexpression of DeschampsiaantarcticaCu／Znsuperexidedismutasein Pichiap∞toris[J]．BMCResNotes，2009，2：207．[12]WangJ，EdmoodsonDE．Hi曲一levelexpressionandpurificationofrat monoamineoxidase A(MAOA)inPichiapastoris：comparisonwithhumanMAOA[J]．ProteinExprPurif，70(2)：21l一217．[13]KotakeT，KitazawaK，TakataR，etal．Molecularcloningandexpres-sioninPichiapastorisofaIrpexlacteusexo—beta一(1q)一rgalac—tanasegene[J]．BiosciBiotechnolBiochem，2009，73(10)：2303—2309．[14]BasantaA，G6mez—SalaB，S6nchezJ，etal．UseoftheyeastPichiapastorisasanexpressionhostforsecretionofenteroeinL50，aleader-lesstwo—peptide(L50AandISOB)bacteriocinfromEnterococcasfaeciumL50[J]．AppliedandEnvironmentMicrobiology，2010，76(10)：3314—3324．[15]MaresovaH，MarkovdZ，ValesovdR，eta1．Heterologousexpressionofleader—lesspgageneinPichiapastoris：intraceUularproductionofprokaryoticenzyme[J]．BMCBiotechnol，2010，10：7．[16]LingLY，IthoiI，YikFM．Optimizationforhigh—levelexpressioninPichiapastorisandpurificationoftruncatedandfulllengtllrecom—binantSAG2ofToxoplasmagondiifordiagnosticuse[J]．South—east AsianJTrepMedPublicHealth，2010，41(3)：507—513．[17]MansurM，CabelloC，HemgmdezL，eta1．Multiplegenecopynumberenhances insulinprecursorsecretionintheyeastPichiapastoris[J]．Biotechnologyletters，2005，27(5)：339—345．[18]ClareJ，ScorerC，BuckholzR，eta1．ExpressionofEGFandHIVell—velope glycoprotein[J]．MethodsMolBiol，1998，103：209—225．chem，2006，44(Pt3)：151—158．[26]JahicM，GustavssonM，JansenAK，eta1．AnalysisandcontrolofproteolysisofafusionproteininP／ch／apastor／sfed—batchprocesses[J]．JBiotechnol，2003，102(1)：45—53．[27]ZhangW，SinhaJ，SmithLA，eta1．Maximizationofproductionofse—cretedrecombinantproteinsinPichiapastorisfed——batchfermenta--tion[J]．BiotechnolPros，2005，21(2)：386—393．(28]汪志浩，张东旭，李江华，等．混合碳源流加对重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的影响[J]．生物工程学报，2009，25(12)：1955—1961．[29]KhatriNK，HoffmannF．Impactofmethanolconcentrationonsecre—tedpmteinproductioninoxygen—limitedculturesofrecombinantPichiapastoris[J]．BiotechnolBioeng，2006，93(5)：871—879．[30]WangJ，NgnyenV，GlenJ，eta1．Improvcdyieldofrecombinantmero-zoitesurfaceprotein3(MSP3)fromPichiapastorisusingchemicallydefinedmedia[J]．BiotechnolBioeng，2005，90(7)：838—847．[31]ChoiDB，ParkEY．Enhancedproductionofmouseo【一amylasebyfeeding combinednitrogenand carbon sourcesin fed—batch cultureofrecombinantPichiapastoris[J]。ProcBiochem，2006，41(2)：390—397．[32]JahicM，WallbergF，BoHokM，eta1．Temperaturelimitedfed—batchtechniqueforcontrolofpreteolysisin Pichiapastorisbioreactorcultures[J]．MicrobCellFact，2003，2(1)：6．[33]IdirisA，TohdaH，KumagniH，etal．Engineeringofproteinsecretioninyeast：strategiesandimpactonproteinproduction[J]．ApplMi—crobiolBiotechnol，2010，86(2)：403—417．[34]SinhaJ，PlantzBA，InanM，eta1．CausesofproteolyticdegradationofsecretedrecombinantproteinsproducedinmethylotrophieyeastPichiapastoris：casestudywitllrecombinantovineinterfeYon—T[J]．BioteehnolBioeng，2005，89(1)：102—112．万方数据巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展作者：姚晶，吴正钧，任婧作者单位：姚晶(乳业生物技术国家重点实验室/光明乳业股份有限公司技术中心,上海200436;上海海洋大学食品学院,上海201306)，吴正钧(上海海洋大学食品学院,上海,201306)，任婧(乳业生物技术国家重点实验室/光明乳业股份有限公司技术中心,上海,200436)刊名：江苏农业科学英文刊名：JiangsuAgriculturalSciences年，卷(期)：2012,40(3)被引用次数：3次参考文献(34条)1.SiegeiRSMethylotroyphicyeastPichiapastourproducedinhighcelldensityfermentationwithhighcellyieldsasvehicleforrecombinantproteinproduction19892.CereghinoJL;CreggJMHeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris[外文期刊]2000(01)3.QureshiMS利用pH和甲醇在线控制策略促进PichiapastorisGSl15发酵生产碱性果胶酶20094.XieJL;ZhouQW;DuPUseofdifferentcarbonsourcesincultivationofrecombinantPichiapastorisforangiostatinproduction2005(2/3)5.HartnerFS;RuthC;LangeneggerDPromoterlibrarydesignedforfine-tunedgeneexpressioninPichiapastoris[外文期刊]2008(12)6.ScorerCA;BuckholzRG;ClareJJTheintracellularproductionandsecretionofHIV-1envelopeproteininthemethylotrophicyeastPichiapastoris1993(1/2)7.BarrKA;HopkinsSA;SreekrishnaKProtocolforefficientsecretionofHSAdevelopedfromPichiapastoris19928.ShiX;KarkutT;ChamankhahMOptimalconditionsfortheexpressionofasingle-chainantibody(scFv)geneinPichiapastoris2003(02)9.XiongAS;YaoQH;PengRHHighlevelexpressionofasyntheticgeneencodingPeniophoralyciiphytaseinmethylotrophicyeastPichiapastoris2006(05)10.CreggJMMethodsinMolecularBiologyVol.389Pichiaprotocols200711.Sátnchez-VenegasJR;NavarreteA;DinamarcaJCloningandconstitutiveexpressionofDeschampsiaantarcticaCu/ZnsuperoxidedismutaseinPichiapastoris[外文期刊]200912.WangJ;EdmondsonDEHigh-levelexpressionandpurificationofratmonoamineoxidaseA(MAOA)inPichiapastoris:comparisonwithhumanMAOA13.KotakeT;KitazawaK;TakataRMolecularcloningandexpressioninPichiapastorisofaIrpexlacteusexo-beta-(1→3)-galactanasegene2009(10)14.BasantaA;Gómez-SalaB;SánchezJUseoftheyeastPichiapastorisasanexpressionhostforsecretionofenteroeinL50,aleaderlesstwo-peptide(L50AandL50B)bacteriocinfromEnterococcusfaeciumL502010(10)15.MaresováH;MarkováZ;ValesováRHeterologousexpressionofleader-lesspgageneinPichiapastoris:intracellularproductionofprokaryoticenzyme[外文期刊]201016.LingLY;IthoiI;YikFMOptimizationforhigh-levelexpressioninPichiapastorisandpurificationoftruncatedandfulllengthrecombinantSAG2ofToxoplasmagondiifordiagnosticuse2010(03)17.MansurM;CabelloC;HernándezLMultiplegenecopynumberenhancesinsulinprecursorsecretionintheyeastPichiapastoris2005(05)18.ClareJ;ScorerC;BuckholzRExpressionofEGFandHIVenvelopeglycoprotein199819.SinclairG;ChoyFYSynonymouscodonusagebiasandtheexpressionofhumanglucocerebrosidasein