不同血液保存方法对RNA提取的影响(简易版)

不同血液保存方法对RNA提取的影响一、引言1.1探索血液RNA保存方法的必要性全血作为较易获取的人体标本，特别适用于实验室和临床检测。高质量的RNA可以满足RT-PCR、qRT-PCR、Northernblot、基因表达谱、转录组测序、核酸酶保护实验和阵列分析等生物学下游实验的研究需求[1]。但由于RNA自身结构为单链状态，极不稳定，同时广泛分布的RNase时刻发挥着降解RNA的功能，其活性难以被抑制，因此使得从全血中提取RNA以及对RNA的保存相对困难。1.2常见的血液RNA保存方法第一种为分离白膜层[2]，加入RNAlater保护剂冻存-80℃。此种方法为目前样本库常用的血液RNA保存方法，采血后需在常温保存4小时内完成白膜层分离，或在采血2小时内放入4℃冰箱保存，24小时内4℃低温分离，将分离获得的白膜层用RNAlater保护剂保存，RNAlater的主要作用为提供高盐环境使细胞脱水，抑制核酸酶活性。此种方法的优势在于可将全血中大部分对于提取RNA无用的成分去除，缩减了样本的体积，更加便于保存。但此种方法的弊端在于，首先分离白膜层的过程较为繁琐，需要多次离心，在临床医院或临时的采血点往往难以实施，其次高盐脱水后的细胞复性困难，提取RNA的难度增加，且高盐组分不易去除，提取的RNA纯度不高，最后血液在分离白膜层过程中，会有部分白细胞及RNA组分缺失。第二种为专用的静脉真空采血管，其中添加了特殊的试剂，可以保护细胞内的RNA，防止降解，但此方法核酸得率偏低，需大量血液来支撑下游实验研究。本实验内容纵向地比较了两种血液保存方式下，RNA保存效果的对比；并探索了在不同保存温度及不同保存时间下，RNA的保存效果。希望本文可为广大的科研同胞们提供帮助。二、 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法2.1标本来源本组血液样品均采自同一志愿者，采用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 静脉穿刺技术，一次性使用真空采血管EDTA·Na25ml（购于江苏康捷医疗器械有限公司）采集静脉血，全部标本白细胞计数范围为3.16×103~3.25×103。2.2方法2.2.1白膜层分离采集3管新鲜血液，每管5ml，采血后10min内3,000rpm离心10min，吸弃血浆，加入和血浆等体积的PBS缓冲液，颠倒混匀。取15ml离心管，加入7.5mlFicoll-paqueTMPLUSlymphocyteisolationsterilesolution（购于GE公司，Lot.10244745），吸取采血管中血细胞加入分离液中分层，2,000rpm离心20min。吸弃上层PBS，移液器吸取白膜层转移至5ml离心管中，加入PBS吹打混匀，2,000rpm离心10min，弃上清。加入400lPBS缓冲液重悬，然后分别缓慢加入不同RNA保护液。Q组：加入1.2mlRNAlaterRNAStabilizationReagent（购于Qi***n公司，Lot.15****995）；A组：加入1.2mlA***onRNAlaterSolution（购于英**基，Lot.00****70）；B组：加入1.2mlRNAfixer保存液（购于Bioteke公司，Cat.RP1302）。将三管样品均冻存于-80℃保存。2.2.2白膜层RNA提取（沉淀法）取200l保存的白膜层，加2mlRL裂解液，涡旋混匀30s，室温裂解15min；加入300l氯仿，涡旋混匀10s，室温放置3min；12,000rpm离心10min，吸取水相，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀至少2h，若出现浑浊，加入DEPC水配制的50%异丙醇，直至混浊消失；4℃，12,000rpm离心15min，小心弃上清；加入1ml75%乙醇漂洗2次；30lRNase-freeH2O溶解。2.2.3白膜层RNA提取（离心柱法）严格按照试剂盒操作说明操作，所用试剂盒为：血液（液体样本）总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）（购于BioTeke，Cat.RP4001）；动物组织总RNA提取试剂盒（离心柱型）（购于Tiangen，Lot.P4920）。2.2.4血液RNA保存管提取RNA采集新鲜全血，30min内转移2.5ml至10ml血液RNA保存管（购于BioTeke，Cat.ST1001）中，涡旋混匀30s，室温放置10min，而后转移至不同条件保存。提取时取1.6ml液体，恢复室温，放置10分钟，加入200l氯仿，涡旋混匀10s，室温放置3min；4℃12,000rpm离心10min，吸取水相，加入等体积70%乙醇，混匀，将混合液加入RA柱，12,000rpm离心1min，弃滤液；加入500l去蛋白液RE，4℃12,000rpm离心1min，弃滤液；加入700l漂洗液RW，4℃12,000rpm离心1min，弃滤液；加入500l漂洗液RW，4℃12,000rpm离心1min，弃滤液；4℃12,000rpm离心2min；将吸附柱RA插入新的1.5ml离心管，加入30lRNase-freeH2O溶解3min；12,000rpm离心1min。2.2.5RNA质量检测采用超微量紫外分光光度计测定紫外260nm处吸光度值计算RNA浓度，A260/A280和A260/230比值判断提取纯度。电泳时取5l核酸，采用UltraPower核酸染料点染，2%琼脂糖凝胶，150V电压条件下电泳15min拍照，曝光时间2s。三、结果与分析3.1分离白膜层法RNA保存结果与分析表1.沉淀法提取RNAlater保存的白膜层RNA浓度结果样品编号Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度（ng/l）样品类型B0.3750.2251.7450.211.6715.0RNAQ0.2770.1731.0770.261.611.1RNAA0.6260.4162.4150.261.5125.0RNA表2.BioTeke离心柱法提取RNAlater保存的白膜层RNA浓度结果组别Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度（ng/l）样品类型B0.3640.2080.9250.391.7514.5RNAQ0.3120.1640.2681.171.912.5RNAA0.350.1940.4460.781.8114.0RNA表3.Tiagen离心柱法提取RNAlater保存的白膜层RNA浓度结果样品编号Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度（ng/l）样品类型B0.2720.1510.5950.461.810.9RNAQ0.3290.1664.3390.081.9813.2RNAA0.2920.1470.9170.321.9911.7RNA分析：全血经分离白膜层后，采用BioTeke、Q及A三家品牌的RNAlater保存液保存后，分别采用了沉淀法及离心柱法（两种品牌）提取RNA，均未能成功提取RNA。表现在两方面，一是OD260/230比值严重偏低，说明其中有大量盐分的残留，二是得率极低，三种方法的平均得率依次为1.02g/ml、0.82g/ml及0.72g/ml（表1~3）。因此，全血经分离白膜层后，RNA提取效果不好。3.2保存管法（Bioteke）RNA保存结果与分析表4.血液RNA保存管在不同温度下保存3天后提取结果编号保存温度Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度（ng/l）样品类型125℃2.6761.3673.5510.751.96107.0RNA225℃3.3581.7883.1161.081.88134.3RNA34℃2.9521.5923.210.921.85118.1RNA44℃2.811.3981.7181.642.01112.4RNA5-20℃3.7512.0013.3431.121.87150.0RNA6-20℃3.0291.5832.5641.181.91121.1RNA7-80℃2.6641.2931.2272.172.06106.6RNA8-80℃3.7662.0684.4550.851.82150.6RNA图1.血液RNA保存管在不同温度下保存3天后提取结果电泳图表5.血液RNA保存管在不同温度下保存7天后提取结果编号保存温度Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度（ng/l）样品类型125℃3.9892.0712.0521.941.93159.6RNA225℃2.8551.4211.4421.982.01114.2RNA34℃2.9621.5041.8771.581.97118.5RNA44℃3.0481.5441.6351.861.97121.9RNA5-20℃2.4211.2171.5421.571.9996.8RNA6-20℃2.3131.1571.2881.8292.5RNA7-80℃2.7551.4682.8250.981.88110.2RNA8-80℃3.0091.5532.6921.121.94120.4RNA图2.血液RNA保存管在不同温度下保存7天后提取结果电泳图表6.血液RNA保存管在不同温度下保存一年后提取结果编号保存温度Abs260Abs280Abs230260/230260/280样品浓度（ng/l）样品类型5-20℃3.0441.5832.3471.31.92121.8RNA6-20℃2.8891.4661.7891.611.97115.5RNA7-80℃2.7391.4181.8411.491.93109.6RNA8-80℃3.6641.9433.271.121.89146.6RNA图3.血液RNA保存管在不同温度下保存一年后提取结果电泳图分析：样本经Bioteke血液RNA保存管保存3天时，25℃、4℃、-20℃和-80℃保存条件下的RNA得率无明显的差异，平均为8.75g/ml；保存7天的结果RNA平均得率为9.82g/ml，25℃的血液开始降解；-20℃--80℃保存1年血液RNA无明显降解（表4~6，图1~3）。因此，全血经Bioteke血液RNA保存管保存后，效果优。四、讨论血液中核酸绝大部分存在于白细胞当中，而白细胞仅占血液成分1%左右，并且血液中含有丰富的RNA酶，这就使得血液的保存以及RNA提取变得十分棘手。通过本文实验，采用淋巴细胞分离液分离白膜层后，提取RNA效果较差。分析原因可能是RNAlater本身为高盐溶液，其本身会造成白细胞失水皱缩，导致复性困难。采用Bioteke血液RNA保存管保存血液，其3天、7天、1年的平均得率为9.33ug/ml，Bioteke核酸得率约为市面上常用的D公司BloodRNATube采血管的7.8倍。此外全血采集后直接冻存-80℃也可作为一种保存血液的方式，已有研究表明，尽管低温可以抑制酶的活性，但即使在-20℃甚至-80℃中，RNase还可以缓慢发挥功能，-80℃保存一周的RNA浓度和纯度与新鲜全血相比均略有下降，需要进行RNA提取的全血标本保存时间最好不要超过4个月。在实验中我们还发现，血液RNA保存管在7天左右的常温条件下也可保存较高质量的核酸，这个特性可解决采血后因实验设备落后无法及时处理血液的问题以及运输不便利的难题。参考文献[1]章佳英,嵇承栋,万悦竹,等.生物样本库中血液RNA提取方法的介绍[J].中国医药生物技术,2017,12(1):84-87.[2]李慧,刘春燕,李浩龙,等.分离白膜后血浆制备冷沉淀的质量 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 [J].中国输血杂志,2015,28(4):396-398.