下载

2下载券

加入VIP
  • 专属下载特权
  • 现金文档折扣购买
  • VIP免费专区
  • 千万文档免费下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 包涵体蛋白表达Ni柱亲和层析纯化操作流程

包涵体蛋白表达Ni柱亲和层析纯化操作流程.pdf

包涵体蛋白表达Ni柱亲和层析纯化操作流程

用户3114056373
2014-01-18 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《包涵体蛋白表达Ni柱亲和层析纯化操作流程pdf》,可适用于自然科学领域

scFv包涵体蛋白表达纯化操作流程FromCXYDay一、配制溶液、LBL、裂解缓冲液mlmMTrismMNacl甘油、含M尿素裂解缓冲液mlmMTrismMNacl甘油M尿素、含TritonX裂解缓冲液mlmMTrismMNacl甘油TritonX、BindingBuffer(PH)mlMNaHPOMTrisClM尿素、WashBuffer(PH)mlMNaHPOMTrisClM尿素、ElutionBuffer(PH)mlMNaHPOMTrisClM尿素、透析袋处理液(PH)LNaHCOmMEDTA、透析缓冲液(PH)各mlMMMM尿素mMPB(PH)、MPB(PH)LmlMNaHPOmlMNaHPO、mMPBS(PH)LmlMPBNaCl~g加水至L二、scFv蛋白诱导表达、挑scFv蛋白表达单克隆℃摇~h、:转接至mlLB(Amp)中℃摇过夜Day、:转接至LLB(Amp)中℃摇h加IPTG至终浓度mM℃继续培养h、取样取ml全菌离心后用ul水重悬沉淀加ul×上样SDSBuffer℃煮沸min标记全菌沉淀和全菌上清上样三、表达产物处理、菌液rpm℃离心min、菌体沉淀按:(菌重L~gL加~ml)裂解缓冲液冰上超声至清亮(W超声s间歇s功率)、取样取ul超声菌液并离心标记超声上清超声沉淀、g℃离心min上清备用标记超声上清、超声沉淀用含M尿素的裂解缓冲液以:比例重悬继续超声min、g℃离心min、超声沉淀用含TritonX的裂解缓冲液重悬℃放置min、g℃离心min获得包涵体、获得包涵体用BindingBufer重悬℃放置过夜Day四、scFv包涵体的纯化、放置过夜包涵体℃高速离心收集上清备用、取样取离心上清标记柱前、使用NiNTA基质进行纯化用BindingBuffer平衡Ni柱柱子平衡后低流速上样整个上样过程使样品处于冰上上样后用~个柱体积的WashBuffer进行漂洗最后用ElutionBuffer洗脱收集吸收峰处的目的蛋白、取样取柱后标记柱后五、scFv包涵体复性、透析袋处理方法:把透析袋简称适当长度(~cm)小段在大体积的(WV)NaHCO和mMEDTA(PH)中将透析袋煮沸min。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在mMEDTA(PH)中将之煮沸min。冷却后存放于℃必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁用前在透析袋内装满水然后排出将之清洗干净、复性采用梯度透析法纯化后包涵体用含M尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约ugml从M、M、M、M依次降低透析液中尿素浓度每个浓度均℃透析~h换新鲜透析液一次高速离心去除沉淀。最后用PBS(PH)℃透析过夜。高速离心去除沉淀超滤浓缩配制溶液LBL裂解缓冲液ml含M尿素裂解缓冲液ml含TritonX裂解缓冲液mlBindingBuffer(PH)mlWashBuffer(PH)mlElutionBuffer(PH)ml透析袋处理液(PH)L透析缓冲液(PH)各mlMPB(PH)LmMPBS(PH)LscFv蛋白诱导表达挑scFv蛋白表达单克隆℃摇~h:转接至mlLB(Amp)中℃摇过夜:转接至LLB(Amp)中℃摇h加IPTG至终浓度mM℃继续培养h取样表达产物处理菌液rpm℃离心min菌体沉淀按:(菌重L~gL加~ml)裂解缓冲液冰上超声至清亮(W超声s间歇s功率)取样g℃离心min上清备用标记超声上清超声沉淀用含M尿素的裂解缓冲液以:比例重悬继续超声ming℃离心min超声沉淀用含TritonX的裂解缓冲液重悬℃放置ming℃离心min获得包涵体获得包涵体用BindingBufer重悬℃放置过夜scFv包涵体的纯化放置过夜包涵体℃高速离心收集上清备用取样使用NiNTA基质进行纯化用BindingBuffer平衡Ni柱柱子平衡后低流速上样整个上样过程使样品处于冰上上样后用~个柱体积的WashBuffer进行漂洗最后用ElutionBuffer洗脱收集吸收峰处的目的蛋白取样scFv包涵体复性透析袋处理方法:把透析袋简称适当长度(~cm)小段在大体积的(WV)NaHCO和mMEDTA(PH)中将透析袋煮沸min。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在mMEDTA(PH)中将之煮沸min。冷却后存放于℃必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁用前在透析袋内装满水然后排出将之清洗干净复性采用梯度透析法纯化后包涵体用含M尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约ugml从M、M、M、M依次降低透析液中尿素浓度每个浓度均℃透析~h换新鲜透析液一次高速离心去除沉淀。最后用PBS(PH)℃透析过夜。高速离心去除沉淀超滤浓缩

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

文档小程序码

使用微信“扫一扫”扫码寻找文档

1

打开微信

2

扫描小程序码

3

发布寻找信息

4

等待寻找结果

我知道了
评分:

/2

包涵体蛋白表达Ni柱亲和层析纯化操作流程

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利