null氨基酸的分离鉴定——纸层析法氨基酸的分离鉴定——纸层析法生物化学实验一、实验目的一、实验目的1. 掌握纸上层析的一般原理和方法
2. 了解氨基酸的特征性颜色反应 二、实验原理 二、实验原理 层析法(色谱法、色层分析法、层离法等):
层析系统有两相组成:一是固定相,是固体物质或固定在固体物质上的成分;一是流动相,即可以流动的物质。当待分离的混合物通过层析系统时,由于各组分的理化性质存在差异,与两相发生作用(吸附、溶解、融合)的能力不同,与固定相相互作用能力弱的组分,随流动相移动时受到的阻滞作用小,向前移动的速度快,相反,与固定相相互作用能力强的组分,向前移动的速度慢,从而将混合物分开。
原理:相似相溶叶绿素叶绿素叶黄素', "叶黄素茨维特色谱图
(1906)实验原理实验原理分配系数:K
它是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。
两种溶剂A、B,一种溶质M,即可溶于A,也可溶于B。先将M溶于A中,然后加入B,这时A中的M将部分转移到B中,当达到平衡时,只要温度不变,M分配于A、B中的浓度Ca、Cb不会改变,两者的比值是一个常数K。K被称为M在A和B中的分配系数。即K=Ca/Cb
null分离过程示意图各组分同时进入各组分开始分离各组分基本分离各组分完全分离null色谱分析仪 二、实验原理 二、实验原理纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离。
溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示:
Rf =原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离= X/Y
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。 Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、实验器材三、实验器材(1)层析缸
(2)毛细管:5只/组。
(3)培养皿:1只/组。
(4)层析滤纸(长16cm、宽16cm的):1张/组。
(5)直尺、铅笔:自备。
(6)电吹风:1只/组。
(7)针、白线:1套/组。
(8)小试管:4只/组
null四、实验试剂四、实验试剂1. 展层剂和平衡液
正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5,充分摇匀,用分液漏斗取上层液作展层剂;下层液作平衡液(弃去)。
2. 样品液
用水配成每ml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml的氨基酸溶液,以及上述四种氨基酸的混合液(各4mg/ml)。
3. 茚三酮
按展层剂0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中,使其溶解。 实验试剂 实验试剂 五、实验操作五、实验操作1.检查培养皿是否干燥、洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。 2. 规划:取一张层析滤纸,距纸底边2cm处 用铅笔划一横线,沿线每隔2.5cm作一记号为点样处,点样处也不要太靠近两侧边(约距1.5cm),会产生边缘效应。null3. 点样:在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号(混合样可写M),然后用毛细管吸取样品,轻轻地点到相应的氨基酸圈内,待晾干或用冷风吹干后再点第二次。前三种氨基酸各点3次,混合液点3次。将点过样的滤纸用针线卷成筒状(点样面向内。
null 4. 层析:将培养皿中放入2/3量的展层剂,迅速放置于层析缸中。将点样点向里,滤纸卷成筒状,把滤纸筒转移到此培养皿内,样品端向下垂直放置,切勿使展层剂浸到样品点(点样的一端在下,扩展剂的液面需低于点样线1cm ) 。当溶剂前沿到达滤纸2/3处,取出滤纸。null5. 显色:热风吹干滤纸至显出氨基酸斑点,用铅笔描出轮廓。参见左图。null6. 计算各种氨基酸的Rf值,并判断混合样品中都有哪些氨基酸,各人将自己的实验结果贴在实验
报告
软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载
上,见表3-2。
7. 倒掉用过的展层液,将培养皿洗净,整理好桌面上的仪器和试剂,并注意清洁自己的操作台,请老师验收,实验报告当场交给老师。
8. 计算 Rf
9.分析讨论纸层析结果纸层析结果注意事项注意事项1 、铅笔、格尺自备。
2、手尽量小心接触滤纸。
3、吸取样品的毛细管不可混用。
4、点样圈不能距离纸边太近,各点之间的距 离不能太近。
5、吹干时一定要保证完全吹干。
null6、缝合时,滤纸的两个纸边不能相互接触并且底边应对齐,点样线一面滤纸朝内。
7、点样时,样品扩散圈不能过大,直径小于3mm。
8、 实验结束, 回收各组的实验仪器和试剂,放置原处以供下次课同学使用。
10、实验报告要写同组同学号数、名字,层析滤纸贴在其中一位同学的实验报告上。
11、坐椅放在实验台上,空出过道。
思考题思考题1. 氨基酸纸上层析用哪种物质作为显色剂?这种显色剂与哪些氨基酸反应不产生蓝紫色?写出这种显色剂与氨基酸反应的反应式。
2. 何谓Rf值?影响Rf值的主要因素是什么?
3. 网上搜索与层析相关的知识,自学。