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利用LCMSMS建立生物样品分析方法.doc

利用LCMSMS建立生物样品分析方法

redfir
2013-08-13 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《利用LCMSMS建立生物样品分析方法doc》,可适用于自然科学领域

利用LCMSMS建立生物样品分析方法::|分类:lcms|标签:液色迷人液相色谱专家|字号订阅如何利用LCMSMS更快更好的建立生物样品分析方法如何利用LCMSMS更快更好的建立生物样品分析方法以前曾在实验室的seminar上做过一次关于如何建立生物样品分析方法的工作报告。时隔两年恰逢仪器信息网举办第一届网络原创作品大奖赛在这里将这几年来对于生物样品分析的一点点感受总结一下与大家交流、分享。首先明确一下文中提到的“生物基质”主要指的是血浆、血清、唾液、尿液或者器官组织等。药物透过机体的各种生理屏障进入到这些基质中就是我们所说的“生物样品”(Biosample)。生物样品中的药物浓度极低我们如何利用灵敏度高的仪器如LCMSMS更好的建立测定生物样品中药物浓度的分析方法呢?下面我主要从以下四个方面进行阐述:一、色谱质谱条件的确立、质谱条件的确立当使用液质联用仪对某一个化合物进行定量分析时我们就需要建立一个质谱分析方法。虽然仪器的型号不尽相同但原理却是一致的基本原理如图所示。我们在确定方法时主要考虑以下几个因素:()化合物的性质:包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。首先了解化合物的结构我们可以大概的推断其碎片离子的断裂方式选择较为稳定的碎片离子作为定量反应的子离子也可以根据经验判断选用哪种source更为合适根据化合物的极性大小我们可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒既能保证完全将样品溶解又能提高化合物的质谱响应而清楚化合物的pKa值有助于我们选择流动相的添加剂及其pH值从而提高质谱响应。()流动相添加剂的选择:在液相紫外检测中我们使用的添加剂的种类繁多可以是挥发性的酸或者碱(如甲酸、乙酸和氨水等)也可以是不易挥发的缓冲盐(如磷酸二氢钠磷酸缓冲液、磷酸二氢钾磷酸缓冲盐)。但是在液质分析中基于质谱检测的原理我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐那么种类就会受到极大的限制。在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐见图一。三乙胺在紫外检测中常作为扫尾剂但是在液质检测中是绝对禁止的。因为三乙胺进入质谱后不易清除残留及其严重能够抑制离子的响应。一旦三乙胺用量增加时间延长那么慢慢地质谱就不能灵敏的检测化合物了所以这点大家要注意尤其对于液质的初期使用者。图一INCLUDEPICTURE"http:bbslabscncomuploadacdedcebaacecbdfjpg")质谱离子源的选择:质谱出现早期主要有电子轰击源(EI)、化学电离源(CI)、电喷雾电离源(ESI)和大气压化学电离源(APCI)。但随着科学技术的进步源的发展也是日新月异。目前用于定量的离子源主要是电喷雾电离源(ESI)和大气压化学电离源(APCI)他们的使用范围如图二所示。图二ESI源是液相离子化主要用于分析极性比较大的化合物及大分子化合物而APCI源是气相离子化主要用于分析极性较小的小分子化合物。在掌握以上基本信息后根据各个型号仪器的标准操作规程(SOP)进行操作对各个参数进行优化从而确定质谱分析方法。、色谱条件的建立在液相色谱紫外检测中要求化合物之间的分离必须达到完全分离即R》如果进行定量那R最好≧这就给分析工作者提出了很高的要求准确的配制流动相精确的调好流动相的pH及添加剂的浓度。但在液质分析中我们经常使用多反应监测(MRMSRM)对化合物进行定量由于MRM要求选择两次离子因此它具有很高的专属性基于这点我们对多个化合物同时进行检测时不需要彼此间达到完全分离就可以对他们进行定量分析。但这里需要强调的一点是由于生物样品中含有大量的基质这些基质的存在会严重的干扰和影响化合物的测定因而我们需要利用色谱将化合物与基质分开从而降低基质效应的影响即降低离子抑制。二、内标的选择检测时使用内标物的目的是消除操作误差因此我们在进行生物样品分析时必须选择一个合适的化合物作为内标物。LCMSMS法的高专属性使其对内标物与待测物的色谱分离要求不高但要求内标物色谱行为及提取回收率尤其是质谱信号响应与待测物的接近要求在测定过程中内标物受系统误差及碰撞压力变化的影响与待测物一致。所以理想的内标物应为待测组分的同位素标记物但由于同位素标记物价格非常昂贵且不易获得我们尝试选用结构相似的化合物(或者同系物)作为内标物。三、样品预处理方法的选择根据前人的经验我们在生物样品预处理中经常使用到的方法主要有以下三种沉淀蛋白法(PPT)、液液提取法(LLE)和固相萃取法(SPE)而这三种方法的选择主要取决于化合物的特性。分析极性比较大的化合物优先考虑使用沉淀蛋白法这种方法操作简单省时省力缺点是生物基质中内源性物质去除的不彻底基质效应较大使得方法灵敏度不高。分析极性较小的化合物我们可以选择液液萃取法这种方法根据相似相溶的原则进行分离提取优点在于处理完的样品较干净内源性物质去除彻底缺点在于消耗有机试剂的量很大对操作人员、环境的污染也大。固相萃取法在国外使用尤为广泛。它采用固相萃取小柱作(见图三)为分离媒介小柱中添加了不同填料的固定相如以键合硅胶为基质的如C、NH、COOH、PSA、SAX等是硅胶的表面活性大为降低最大程度的降低了极性化合物的不可吸附和拖尾使样品回收率和重现性得到保障以高分子聚合物为基质的如PEP、HXN、PAX、PCX等具有高纯度、高比表面的特点以吸附型填料为固定相的如硅酸镁、氧化铝等主要通过表面的极性吸附达到分离的目的。因此固相萃取法适用于各种极性的化合物样品处理过程中使用的设备(见图四)简单柱子活化便捷基质效应低缺点是价格昂贵不太适合我国目前的国情。近年来又出现了孔板的固相萃取小柱可以批量处理样品耗材少耗时短大大提高了工作效率。图三图三图四固相萃取使用的设备图四四、仪器使用维护经验严格按照仪器的SOP进行操作否则容易引起仪器故障对液相使用熟练的操作人员在使用液质时尤其要注意三个方面的问题:一是液质的流速不能太大若流速太大对于ESI源而言不易于离子化而APCI源流速可以在mLmin二是流动相的添加剂不管是缓冲盐还是酸、碱必须是易挥发的否则容易堵塞管路和源内的毛细管三是在液相操作中我们经常使用三乙胺作为扫尾剂但是在液质中尽量不使用三乙胺使用前请咨询工程师看看三乙胺的浓度不高于多少对仪器影响甚微定期清洗离子源尤其在使用沉淀蛋白法处理生物样品时离子源很容易脏定期清理可以提高灵敏度。再者每天做完样品分析后要及时清洗液相系统及时冲洗和吹扫管路机械泵的震气这个可能只有waters的仪器需要。震气是为了将机械泵及其管路内的灰尘颗粒清除出去以提高灵敏度去污剂、表面活性剂会产生离子抑制现象表面活性剂产生的加合物和离子簇会干扰质谱数据因此不要使用洗涤剂清洗玻璃器皿等容器如果一定要用建议超声清洗多次。

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