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化学发光免疫分析技术.ppt

化学发光免疫分析技术

redsun4343
2013-08-06 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《化学发光免疫分析技术ppt》,可适用于自然科学领域

化学发光免疫分析技术第十章化学发光免疫分析技术第十章化学发光免疫分析技术第一节慨述 一、化学发光 二、化学发光效率第二节化学发光剂和标记技术 一、化学发光剂 二、发光剂的标记技术第三节化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析四、临床应用思考题小结发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。第一节概述第一节概述放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术三大经典标记技术发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后由基态(较低能级)跃迁到激发态(较高能级)然后再返回到基态并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光(photoluminescence)是指发光剂(荧光素)经短波长的入射光照射后电子吸收能量跃迁到激发态在其回复至基态时发射出较长波长的可见光(荧光)。生物发光(bioluminescence)是指发生在生物体内的发光现象如萤火虫的发光反应底物为萤火虫荧光素在荧光素酶的催化下利用ATP能生成激发态氧化型荧光素它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。化学发光(chemiluminescence)是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时吸收了反应过程中所产生的化学能使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态当电子从激发态回复到基态时以发射光子的形式释放出能量这一现象称为化学发光。一、化学发光一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态若被激发的是一个反应产物分子则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下:A十BC*C*C+h·γ其中γ为光子C*表示C处于单线激发态。若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上使D分子激发到电子激发态D分子从激发态回到基态时发光这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下:A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率(φCE)和激发态分子的发射效率(φEM)。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围完全由发光物质的性质所决定每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率第二节化学发光剂和标记技术在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物。一、化学发光剂能作为化学发光剂的条件:①发光的量子产率高②它的物理化学特性要与被标记或测定的物质相匹配③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物④其化学发光常是氧化反应的结果⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。㈠直接化学发光剂直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用直接参与发光反应它们在化学结构上有产生发光的特有基团可直接标记抗原或抗体。  吖啶酯在碱性条件下被HO氧化时,发出波长为nm的光具有很高的发光效率其激发态产物 N甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。.三联吡啶钌三联吡啶钌RU(bpy)是电化学发光剂它和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌电化学发光剂反应原理㈡酶促反应发光剂:是利用标记酶的催化作用使发光剂(底物)发光这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。.鲁米诺及其衍生物.AMPPD.鲁米诺鲁米诺发光原理鲁米诺增强发光反应原理.AMPPD〔(‘螺旋金刚烷)甲氧基(“磷酰氧基)苯,二氧杂环丁烷〕〕碳二亚胺(EDC)缩合法二、发光剂的标记技术过碘酸钠氧化法.重氮盐偶联法N羟基琥珀酰亚胺活化法.发光剂的选择.被标记蛋白质的性质.标记方法的选择.原料比.标记率.温度.纯化与保存影响标记的因素第三节化学发光免疫分析的类型用吖啶酯直接标记抗体(抗原)与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后形成固相包被抗体待测抗原吖啶酯标记抗体复合物这时只需加入氧化剂(HO)和NaOH使成碱性环境吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能这部分光的积分与待测抗原的量成正比可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析发光YYY磁微粒被测抗原抗体带丫啶酯标记物抗体冲洗后夹心法()加入HO(pH<)()加入碱(pH>)直接化学发光的机理磁微粒模式图YYYYYYYYYYYY特点抗原和抗体结合与未结合部分的易分离磁微粒技术化学发光酶免疫分析(chemiluminescenceenzyme immunoassayCLEIA)是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后形成固相包被抗体待测抗原酶标记抗体复合物经洗涤后加入底物(发光剂)酶催化和分解底物发光由光量子阅读系统接收光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大再把它们传送至计算机数据处理系统计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析该分析系统采用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(或抗原)在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后形成固相包被抗体待测抗原酶(HRP)标记抗体复合物这时加入鲁米诺发光剂、HO和化学发光增强剂使产生化学发光。㈠辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原)在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后形成固相包被抗体待测抗原酶标记抗体复合物这时加入AMPPD发光剂碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。㈡碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图分析步骤分析步骤电化学发光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassayECLIA)是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)以三丙胺(TPA)为电子供体在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应它包括电化学和化学发光两个过程。三、电化学发光免疫分析在电化学发光免疫分析系统中磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)用三联吡啶钌标记抗体(抗原)在反应体系内待测标本与相应的抗原(抗体)发生免疫反应后形成磁性微粒包被抗体待测抗原三联吡啶钌标记抗体复合物这时将上述复合物吸入流动室同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时被安装在电极下面的电磁铁吸引住而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压启动电化学发光反应使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移产生电化学发光光的强度与待测抗原的浓度成正比。电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫测定示意图标记磁颗粒在电场中发光工作示意图甲状腺激素.生殖激素.垂体激素和皮质激素.贫血因子.肿瘤标志物.感染性疾病.糖尿病胰岛素、血清C肽、血浆胰高糖素等。.心脏标志物.病毒标记物.过敏性疾病.治疗药物监测四、临床应用.什么是发光免疫分析?什么是化学发光免疫分析?.化学发光与荧光的区别?化学发光反应的条件?.什么叫化学发光剂?化学发光剂必须具备那些条件?.吖啶酯化学发光的原理和特点是什么?.酶促反应的发光剂有哪些?其发光原理和特点是?.三联吡啶钌发光的原理和特点是什么?.三丙胺在电化学发光中起什么作用?发光剂的标记有那些方法?影响因素有那些?.什么是直接化学发光免疫分析?其特点是什么?.什么是化学发光酶免疫分析?其特点是什么?思考题发光是指分子或原子中的电子吸收能量后由基态跃迁到激发态然后再返回到基态并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术分为直接化学发光免疫分析化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。小结

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