动物细胞培养基行业标准和检测方法使用手册

0 北京清大天一生物技术有限公司 BEIJING TSINGHUA SKYWING BIO TECH CO.,LTD 1 前前 言言 22000077 年年 1100 月月 11 日日国国家家发发展展和和改改革革委委员员会会在在国国家家化化工工行行业业标 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 准中中公公布布 了了《《哺哺乳乳类类动动物物细细胞胞培培养养基基》》行行业业标标准准，，为为国国内内动动物物细细胞胞培培养养基基产产品品质质量量 及及检检测测方 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 法提提供供了了统统一一的的标标准准。。由由于于各各生生产产企企业业及及用用户户对对行行业业标标准准的的理理解解 和和执执行行情情况况存存在在差差异异，，为为了了使使广广大大用用户户更更加加深深入入理理解解和和执执行行行行业业标标准准，，执执 行行统统一一的的培培养养基基产产品品质质量量标标准准及及检检测测方方法法，，由由北北京京清清大大天天一一生生物物技技术术有有限限 公公司司质质量量管管理理部部编编制制《《哺哺乳乳类类动动物物细细胞胞培培养养基基行行业业标标准准及及检检测测方方法法》》使使用用 手手册册，，以以便便于于使使用用者者参参考考。。 本本手手册册分分为为两两部部分分内内容容：：一一、、国国家家化化工工行行业业标标准准《《哺哺乳乳类类动动物物细细胞胞培培养养 基基》》（（HHGG//TT 33993355--22000077））；；二二、、细细胞胞培培养养基基检检测测项项目目指指标标说说明明及及检检测测注注意意事事 项项。。 2 目 录 1、国家化工行业标准《哺乳类动物细胞培养基》HG/T 3935-2007 全文 ......................................................................................................................... 3 2、哺乳类动物细胞培养基检测项目指标说明及检测注意项................ 14 2.1 性状 ....................................................................................................... 14 2.2 澄清度 ................................................................................................... 14 2.2.1 澄清度检测操作方法 ......................................................................... 14 2.2.2 注意事项 软件开发合同注意事项软件销售合同注意事项电梯维保合同注意事项软件销售合同注意事项员工离职注意事项 ............................................................................................. 14 2.3 pH 值 ..................................................................................................... 14 2.3.1 pH 值介绍 ........................................................................................... 14 2.3.2 pH 计操作方法 ................................................................................... 15 2.3.3 pH 计使用常见问题 ........................................................................... 16 2.4 干燥减量 ................................................................................................ 19 2.5 渗透压 ................................................................................................... 20 2.5.1 渗透压介绍 ......................................................................................... 20 2.5.2 渗透压仪操作方法 ............................................................................. 21 2.6 细菌内毒素 ........................................................................................... 24 2.6.1 细菌内毒素介绍 ................................................................................. 24 2.6.2 细菌内毒素检查中凝胶法所使用的试剂及操作方法..................... 25 2.6.3 细菌内毒素检查中凝胶法注意事项 ................................................. 31 2.7 微生物限度 ........................................................................................... 33 2.7.1 微生物限度介绍 ................................................................................. 33 2.7.2 微生物限度操作方法 ......................................................................... 33 2.8 细胞生长试验 ....................................................................................... 39 2.8.1 细胞生长试验操作方法 ..................................................................... 39 2.8.2 细胞生长试验的影响因素 ................................................................. 41 3 11、、 国国家家化化工工行行业业标标准准《《哺哺乳乳类类动动物物细细胞胞培培养养基基》》HHGG//TT 33993355--22000077 全全文文 CS 71.080.99 G 17 备案号：20517－2007 中华人民共和国化工行业标准 HG/T3935-2007 哺乳类动物细胞培养基 Cell culture media 2007-04-13发布 2007-10-01实施 中华人民共和国国家发展和改革委员会 发布 4 前 言 本标准附录A为资料性附录。 本标准由中国石油和化学工业协会提出。 本标准由全国化学标准化技术委员会有机分会（SAC/TC63/SC2）归口。 本标准由北京清大天一生物技术有限公司负责起草。 本标准主要起草人： 陈文庆、罗海春。 哺乳类动物细胞培养基 1 范围 本标准规定了哺乳类动物细胞培养基的要求、试验方法、检验规则及标志、 包装、运输、贮存。 本标准适用于哺乳类动物细胞培养基。该产品主要用于哺乳类动物细胞 培养。 2 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期 的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于 本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件 的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 191-2000 包装储运图示标志（eqv ISO 780:1997） GB/T 1250 极限数值的表示方法和判定方法 5 GB/T 6679 固体化工产品采样通则 中华人民共和国药典 2005 年版二部附录 中华人民共和国药典 2005 年版三部附录 中华人民共和国药典 2005 年版二部 纯化水 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 每升标示量 marker liter 在产品包装上标注的配制 1L 液体细胞培养基所需干粉细胞培养基的 质量，单位为 g。 4 分类和命名 哺乳类动物细胞培养基按主要成分的不同分为四型，其命名及对应主 要成分见表1。 6 表1 哺乳类动物细胞培养基型号命名 型号命名a 主要成分 DMEM粉末细胞培 养基 氯化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、 L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐 酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨 酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-葡萄糖、 酚红、丙酮酸钠、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸 吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺 199粉末细胞培 养基 氯化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、无 水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天门冬氨 酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘 氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨 酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、 L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫酸腺嘌呤、腺苷酸、脱氧核糖、D- 葡萄糖、谷胱甘肽（还原型）、盐酸鸟嘌呤、次黄嘌呤、酚红、D-核糖、 乙酸钠、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、维生素 C、维生素 E、维生素 H、 D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐 酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素 A 醋酸酯 MEM粉末细胞培 养基 氯化钙、九水硝酸铁、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、 L-精氨酸盐酸盐、L-天门冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-胱氨酸盐酸盐、L- 谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨 酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、 L-酪氨酸、L-缬氨酸、D-葡萄糖、酚红、丁二酸、丁二酸钠、D-泛酸钙、 氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺 RPMI1640粉末细 胞培养基 四水硝酸钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、L-精氨酸、 L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰 胺、甘氨酸、L-组氨酸 、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨 酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、 L-色氨酸、L-酪氨酸 、L-缬氨酸、D-葡萄糖、谷胱甘肽（还原型）、HEPES、 酚红、维生素H、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、对氨基 苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12 a每一型号可根据配方不同分为若干亚型。 7 5 性状 粉红色或类白色固体粉末。 6 要求 哺乳类动物细胞培养基应符合表2所示的技术要求。 表 2 技术要求 指 标 项 目 DMEM 粉末细胞培养基 199 粉末细胞培养基 MEM 粉末细胞培养基 RPMI 1640 粉末细胞培养基 澄清度 澄清 pH值a （每升标示量/L） 3.20～6.40 3.90～6.30 3.90～6.90 6.40～8.30 干燥减量的质量分数/（%） ≤ 5.0 渗透压b/（mOsm/kgH2O） 238～291 238～299 228～301 223～273 细菌内毒素/（EU/mL） ≤ 10 细菌数/（CFU/g） ≤ 200 微生物限度 霉菌数/（CFU/g） ≤ 50 细胞形态 正常 细胞生长试验 细胞生长试验 合格 a每种亚型允许的 pH 偏差范围为±0.30。 b每种亚型允许的渗透压偏差范围为±5％。 7 试验方法 除非另有说明，在 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和 国药典2005年版中规定的纯化水。 7.1 澄清度的测定 称取每升标示量的实验室样品，置于 1 000mL 烧杯中，加水 1 000mL， 搅拌至溶解。 按中华人民共和国药典 2005 年版二部附录Ⅸ B 进行。 7.2 pH 值的测定 8 称取每升标示量的实验室样品，置于 1 000mL 烧杯中，加水 1 000mL， 搅拌至溶解。按中华人民共和国药典 2005 年版附录Ⅵ H 进行。 7.3 干燥减量的测定 按中华人民共和国药典 2005 年版二部附录Ⅷ L 干燥失重测定法进 行。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的 绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的 10%。 7.4 渗透压的测定 称取每升标示量的实验室样品，置于 1 000mL 烧杯中，加水 1 000mL， 搅拌至溶解。按中华人民共和国药典 2005 年版二部附录Ⅸ G 渗透压摩尔 浓度测定法进行。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的 绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的 5%。 7.5 细菌内毒素的测定 按中华人民共和国药典 2005 年版附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法中的凝 胶法进行。 称取 1/100 每升标示量的实验室样品，精确至 0.0001g，加入细菌内 毒素检查用水（市售）10mL 溶解，吸取该溶液 0.1mL 加细菌内毒素检查用 水（市售）3.9mL，混匀即得试验溶液。 7.6 微生物限度的测定 按中华人民共和国药典2005年版附录Ⅺ J 微生物限度检查法进行，检 查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。 称取实验室样品1g，精确至0.01g，加入无菌纯化水10mL溶解，混匀即 9 得试验溶液。 7.7 细胞生长试验 7.7.1 方法提要 7.7.1.1 本试验所用容器具及溶液均为无菌，试验操作过程均为无菌 操作。 7.7.1.2 细胞在 37℃恒温条件下，在含体积分数为 10％小牛血清的 细胞培养液中生长（48～72）h，观察细胞形态并进行细胞计数；细胞生长 （48～72）h 后，更换不含小牛血清的细胞培养液，继续培养 48h，观察细 胞形态并进行细胞计数。 7.7.2 试剂和材料 7.7.2.1 小牛血清：中华人民共和国药典 2005 年版三部附录ⅩⅢ D。 7.7.2.2 平衡盐溶液：称取氯化钾 0.2g，精确至 0.01g；无水磷酸二 氢钾 0.2g，精确至 0.01g；氯化钠 8.0g，精确至 0.01g；无水磷酸氢二钠 1.15g，精确至 0.001g；加纯化水 1 000mL，混匀、过滤除菌即得； 7.7.2.3 Vero 细胞：代次不超过 150 代； 7.7.2.4 细胞培养液：按产品使用说明书要求配制； 7.7.2.5 胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶（活力 1:250）2.5g，精确至 0.01g，加 1 000mL 平衡盐溶液，混匀、过滤除菌即得。 7.7.3 仪器 7.7.3.1 医用净化工作台：洁净级别为百级； 7.7.3.2 二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳 体积分数为（5±0.1）％，能在（37±1）℃恒温； 7.7.3.3 细胞培养瓶：T25 型、无菌； 10 7.7.3.4 显微镜：倒置、相差； 7.7.3.5 血球计数板； 7.7.3.6 盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。 7.7.4 试验步骤 7.7.4.1 制备细胞悬液 7.7.4.1.1 将细胞培养液从细胞培养瓶内吸出，用平衡盐溶液洗细 胞一次。 7.7.4.1.2 向细胞培养瓶内加入胰蛋白酶溶液 1mL，于（37±1）℃ 消化（3～5）min。在显微镜下观察,当细胞变圆接近脱壁时，将胰蛋白酶 溶液倒掉。 7.7.4.1.3 根据细胞密度加入一定量细胞培养液，用吸管吹打，使 细胞脱壁制成细胞悬液 A。 7.7.4.2 细胞培养 7.7.4.2.1 吸取一定量的细胞悬液 A，加到细胞培养瓶内。 7.7.4.2.2 向细胞培养瓶内加至 10mL 含体积分数为 10％小牛血清 的细胞培养液，使细胞接种密度为 5×104细胞/mL。 7.7.4.2.3 将细胞培养瓶送入培养箱，在（37±1）℃温度条件及 （5±0.1）％二氧化碳体积分数条件下进行培养。 7.7.4.2.4 培养（48～72）h，观察细胞形态，并按7.7.4.3计数。 7.7.4.2.5 当细胞密度达到1×105细胞/mL时更换不含小牛血清的 细胞培养液10mL，继续培养48h，观察细胞形态并计数。 7.7.4.3 细胞计数 7.7.4.3.1 将需要计数的细胞按7.7.4.1方法制备细胞悬液B。 11 7.7.4.3.2 吸取细胞悬液B100μl转移至离心管中，视细胞量确定是 否稀释及稀释倍数。 7.7.4.3.3 将盖玻片盖于计数板中心的计数室上方。调整计数板中 的细胞数量在（100～300）个。沿盖玻片边缘点加细胞悬液使其通过毛细 作用自然渗入，不要留有气泡，不要外溢，显微镜下计数。 7.7.4.3.4 观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，一 般遵循“计左不计右，计上不计下”的原则。将计数板观察细胞数代入下 列公式： 计数板观察细胞数×104 ×稀释倍数/4＝细胞数/mL 7.7.5 分析结果的表述 培养（48～72）h的细胞形态为成纤维样，贴壁生长，正常细胞形态参 见附录A。72h内细胞数量应达到1×105细胞/mL。 继续培养48h的细胞形态为成纤维样，贴壁生长，正常99细胞形态参见 附录A。细胞计数应不小于1×105细胞/mL。 8 检验规则 8.1 表 2 技术要求中的所有项目均为出厂检验项目。 8.2 使用同一台混合设备一次混合量所生产的均质产品为一批，每批须检 验。 8.3 按GB/T6679的规定采样。将所采样品均匀分成两份，分别装于两个清 洁干燥的无菌、密闭、避光容器内，粘贴标签，注明生产企业名称、产品 名称、批号、生产日期，采样日期和采样者姓名。一份供检验用，另一份 作为留样保存备查。 12 8.4 产品应由生产企业的质量检验部门进行检验。生产企业应保证出厂的 产品均符合本标准要求，每批出厂的产品都应附有一定格式的质量证明书， 其内容包括：生产企业名称和地址、产品名称、批号、生产日期和本标准 编号等。 8.5 检验结果的判定按GB/T 1250修约值比较法进行，检验结果如果有一 项指标不符合本标准要求时，应重新自两倍量的包装单元中采样进行复验, 复验结果即使只有一项指标不符合本标准要求,则整批产品为不合格。 9 标签、使用说明书 9.1 标签 应有产品名称、亚型代号、批号、包装规格、生产日期、有效期至、生 产企业名称、配制方法、本标准编号、每升标示量。 9.2 使用说明书 应有产品名称、亚型代号、包装规格、有效期、生产企业名称、配制 方法、使用方法、每升标示量。 10 标志、包装、运输、贮存 10.1 标志 包装箱上应有产品名称、亚型代号、批号、生产日期、有效期至、包 装规格、数量、本标准编号等和GB/T 191-2000规定的“向上”和“堆码层 数极限”标志等图形标志。 10.2 包装 10.2.1 内包装 13 材料应符合国家药品包装材料标准，无析出物，不与哺乳类动物细胞 培养基发生反应，可达到密封、避光效果并应采用辐照灭菌方法等。 10.2.2 外包装 具有避光效果，离地面一米自由落体，包装应不破损。 10.3 运输 采用封闭式运输工具。运输工具应清洁、卫生、干燥，不得与有毒或 不洁物混合装运。 运输途中需防止日晒、雨淋、受潮和污染。 10.4 贮存 产品需在2℃～8℃库房贮存。仓库环境应清洁。产品可按照包装标志 堆放，但应定期维护，如翻垛、外观检查、抽检等。在以上贮存条件下， 自生产日期起产品有效期为二年。 附录 A（资料性附录） Vero 细胞正常细胞形态图 A.1 Vero 细胞正常细胞形态图见图 A.1。 ATCC Number：CCL-81 形态特征：成纤维样，贴壁生长。 资源网址: www.atcc.org 图 A（右图）.1 Vero 细胞正常细胞形态图 14 22、、哺哺乳乳类类动动物物细细胞胞培培养养基基检检测测项项目目指指标标说说明明及及检检测测注注意意事事项项 2.1 性状 目视法检测。 2.2 澄清度 水是培养基的溶剂，培养基中的营养成分只有完全溶解于水才能被细 胞吸收摄取，细胞才能生长增殖，因此培养基是否溶解以及培养液是否透 明澄清直接影响培养基使用。该项目是通过对水溶解后的培养基的澄清度 检查，判断培养基的溶解性。 2.2.1 澄清度检测操作方法 按说明书配制细胞培养基：称取每升标示量的试验细胞培养基，置于 1000 mL烧杯中，加纯化水（水温20℃～30℃）1000 mL，搅拌至溶解。如 发生浑浊与0.5号浊度标准液比较，不得更深。 2.2.2 注意事项 根据细胞培养基自身的特点，有些品种可浓缩配制，有些不可以，因 为培养基在浓缩配制过程中有些营养物质已处于饱和状态，使其溶解必须 添加溶剂。澄清度检测为原倍配制检测。 2.3 pH 值 2.3.1 pH 值介绍 pH值测定法是测定药品水溶液氢离子活度的一种方法，是药品检查项 下采用较多和重要的指标之一。pH值就是水溶液中氢离子浓度(以每升中摩 尔数计算)的负对数。 15 各种细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适当和稳定的酸碱 度下进行的。培养基的pH值是细胞生长的重要参数，pH值过低会发生酸中 毒，pH值过高会发生碱中毒，pH值偏低或偏高都会影响细胞生长，所以要 控制pH值的范围。细胞培养基由几十种化学物质按比例混合组成，化学物 质配比不同， pH值也不同。大多数有机体细胞所耐受的pH范围为6.5～7.8， 一般原代培养细胞对pH的变动耐受性差，永生性细胞系和恶性细胞对pH的 变动耐力强。当pH从7.0降至6.5时大多数细胞就停止生长；当pH在6.5和6.0 之间时细胞开始失去活性。总的来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受， 偏酸的环境比偏碱的环境对细胞生长有利。在培养环境中主要有两种缓冲 体系，分别为碳酸盐缓冲对（NaHCO3/H2CO3）、磷酸盐缓冲对（NaHPO4/H2PO4）, 其中碳酸盐缓冲体系数量最多、作用最大。 2.3.2 pH 计操作方法 pH 计(型号 410A＋) 准备: 烧杯，玻璃棒，称量瓶，天平，pH 计，计校正液(4.01,6.86,9.18). ①pH 计校正 活化过的 pH 计电极和温度补偿电极与主机连接选择与样品 pH 相接近 的两点缓冲液将两点设置。 选择校正模式： 用蒸馏水冲洗电极，用吸水纸吸干水分，将电极插入第一缓冲液，屏 幕右侧出现“ready”时按“YES”键确认此值，屏幕出现 P2 表示进行第二 点校正。 当屏幕右侧出现“ready”时按“YES”，第二点校正完成，然后自动回 到 pH 测量模式,用蒸馏水冲洗，检测待测样品。 1 16 ②配液 按说明书配制 1L 培养液。 ③测 pH 值 将 pH 计电极用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸将剩余水分吸干后，将电极 插入 1L 被测溶液中，快速搅拌晃动以排除电极内的气泡，静置屏幕右侧出 现“ready”时，所显示数据为该样品的 pH 值。 2.3.3 pH 计使用常见问题 2.3.3.1 酸度计无法校准及测量不稳定 先检查电极是否完好，玻璃电极是否完好无损；再检测线路是否连接 良好。 2.3.3.2 测量时不稳定，时间过长 ①电极选择型号不合适：若测量缓冲液响应时间很短，但测量样品不 稳定，说明电极不适合测量该被测样品，更换合适的电极。 ②电极老化：测试电极的缓冲液的响应时间，若大于1分钟，需要对电 极时行活化处理（0.1mol/L 盐酸中浸泡过夜）或更换电极。 2.3.3.3 同一样品两次测量的数值不一样 有两方面可能：一方面可能温度变化，导致测量数值差异，温度对pH 电极测量的影响为0.003pH/℃，具体参考见下表温度与pH的关系曲线如下： 17 图1 pH4.01缓冲溶液与温度的关系 图2 pH6.86缓冲溶液与温度的关系 图3 pH9.18缓冲溶液与温度的关系 另一方面为样品本身发生了化学变化，导致测量数值差异。 2.3.3.4 电极的检查 ① 电极电缆的检查：测量缓冲液4.01和7.00的毫伏值，应该分别在 180mV±30mV和0mV±30mV。 ② 电极的响应时间检查：将电极浸入另一pH值的缓冲溶液后，电极的 电位在30秒内变化量不应超出2mV。 ③ 缓冲液的保存：中华人民共和国药典规定缓冲液保质期在2～3月内 没有浑浊变质便可以使用，在实际使用中缓冲溶液配制后，应装在玻璃瓶 或聚乙烯瓶中，碱性的pH缓冲液应装在聚乙烯瓶中，在冰箱中低温5～10 18 ℃保存，一般可使用二个月左右，如发现有混浊、发霉或沉淀等现象，不 能继续使用。使用时，将配制的的缓冲溶液取部分置于小瓶中，环境温度 下放置1～2小时，等温度平衡后再使用，使用后不得回收入原瓶中，以免 污染。小瓶中的缓冲溶液在＞10℃的环境条件下可以使用2～3天，一般 pH7.00、pH6.86及pH4.00三种溶液使用时间可以长一些，pH9.18和pH10.01 溶液由于吸收空气中的CO2，其pH值比较容易变化。 ④ 电极的使用：pH复合电极插入被测溶液后，要搅拌晃动几下再静止 放置，以加快电极的响应。尤其使用塑壳pH复合电极时，搅拌晃动程度较 大，因球泡和塑壳之间有一个小空腔，电极浸入溶液后可能出现空腔中的 气体来不及排除导致气泡产生，使球泡体接界与溶液接触不良，因此必须 用力搅拌晃动以排除气泡。 2.3.4.5 pH值检测常见问题及原因分析 由于动物细胞培养基大部分是使用碳酸缓冲系统，一般加入碳酸氢钠 来维持其溶液的 pH 值，碳酸氢钠在溶液里存在形式为 NaHCO3 +H2O=Na+ + H2CO3 +OH- 而 H2CO3会生产 CO2气体溢出和 H2O，其反应越充分，溶液 pH 值 越碱。若检测 pH 时所检测溶液用量过少，在搅拌过程中 H2CO3离子很快分 解，随着 CO2气体不断溢出，其溶液 pH 值会持续上升，导致检测结果超出 限度范围。 标准的操作：取完全溶解的检测溶液 1000mL 于烧杯中，将电极插入溶 液里，快速剧烈搅拌数下后，静置，待酸度计上的数值稳定后，读取数值。 另外，因为产品特性，使用碳酸盐缓冲体系，根据碳酸氢钠的溶解特 性，必须当时配制当时测定，因为暴露在空气中越长，pH 值测定偏差越大。 19 2.4 干燥减量 干燥减量系指药品在规定条件下干燥后所减失重量的百分率。减失的 重量主要是水分、结晶水及其他挥发性物质。建议尽量选择与所用量相匹 配的包装一次性使用，因为包装一经打开，组分可能会变质或因受潮而结 团，同时控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持细胞培养 基的养分。 称取供试品 取供试品（待测细胞培养基），混合均匀（如有较大的结晶，应先迅速 捣碎使成 2mm 以下的小粒）。取约 1g 或该药品项下所规定的重量，置于供 试品同样条件下干燥至恒重的扁形称量瓶中（供试品平铺厚度不可超过 5 ㎜，如为疏松物质，厚度不可超过 10 ㎜），精密称定。干燥失重在 1.0﹪ 以下的品种可只做一份，1.0﹪以上的品种应做平行试验两份。 干燥 除另有规定外，在 105℃条件干燥至恒重， 干燥时应将瓶盖取下置称 量瓶旁及取出时应将称量瓶盖好。 称重 取出置于干燥器中冷却至室温，精密称定重量。并记录。 记录与计算 记录干燥时间、温度、干燥和放冷至室温的时间、称量及恒重数据、 计算和结果（如做平行试验两份者，取其平均值）。计算： 干燥失重﹪＝(W1+W2-W3)/W1×100% 式中 W1 为供试品的重量（g）。 20 W2 为称量瓶恒重的重量（g）。 W3 为称量瓶加供试品恒重的重量（g）。 结果与判定 结果按有效数字修约规定进行修约，有效数位应与标准中的规定相一 致。 2.5 渗透压 2.5.1 渗透压介绍 溶液渗透压是指溶液中溶质微粒对水的吸引力，主要来溶液中不能自 由透过细胞膜的颗粒。例如溶于血浆中的晶体物质Na+、K+、CL-、HCO3-等构 成血浆晶体渗透压，而血浆中的蛋白质则构成血浆胶体渗透压。正常血浆 渗透压范围为280～310mOsm/kg，主要由晶体渗透压组成，而胶体渗透压甚 小，不超过1.50mOsm/kg。当细胞膜一边的渗透压改变时，由于Na+和K+等离 子不能自由通过细胞膜扩散，故主要靠水的转移来维持细胞内、外渗透压 的相对平衡。 细胞生长中，维持正常渗透压是很重要的，渗透压不仅能够维持细胞 张力，而且能够调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度来改变 其它营养物质的输送（如氨基酸、糖等）进而直接影响细胞合成系统。同 时，当细胞内、外环境的分子浓度不同时就会产生渗透压，水分通过渗透 流入或流出细胞，从而改变细胞的内环境。高渗透压迫使水分从细胞中扩 散出来导致细胞收缩，这种情况会使DNA和蛋白遭到破坏、细胞周期停滞以 及最终使细胞死亡，同样低渗透压迫使水分进入细胞导致细胞变大从而破 裂死亡。因此细胞培养液的渗透压控制是非常重要和必要。我公司采用 21 FM-8P型冰点渗透压仪来检测其细胞培养基的渗透压，冰点渗透压仪所依据 的物理化学溶液理论之——拉乌尔冰点原理：任何溶液，如果其单位体积 所溶解的溶质的颗粒总数相同，则引起溶液冰点下降的数值亦相同． 2.5.2 渗透压仪操作方法 工作原理 FM-8P 型渗透压计的工作原理是以冰点下降值与溶液的摩尔浓度成正 比例关系为基础。采用高灵敏度的感温元件—半导体热敏电阻测量溶液的 结冰点，通过电量转化为渗透压单位（mOsm/kg H2O）而实现。该测定结果 的法定计量单位简称为 mOsm/kg H2O，读作每千克毫渗量。 设备及器材 FM-8P 型冰点渗透压仪、专用试管（0.5mL）、吸管、50mL 烧杯、洗瓶、 吸水纸、校正液（300mOsm/kg H2O、800mOsm/kg H2O）。 仪器的使用 ①准备 仪器应放置在平稳的桌面上使用，可以通过调整仪器右前侧底脚调整 螺钉调整其平稳。接通电源打开电源开关后，风机立即旋转，液晶屏显示 开机菜单，在冷槽内缓慢加入约 60mL 的不冻液，观察仪器左侧底部的溢流 瓶，直到有不冻液流出为止，不冻液不可多加或少加，过多溢出浪费，过 少则会延长样品测量时间，甚至会引起不冻。 在开机初以一定的时间二屏交替变换，这时如按“→”键，液晶显示 切换到主菜单；如不按“→”键，则数分钟预热后，仪器自动切换到主菜 单。 ②定标 22 光标在定标行闪烁时按“确认”键，选中定标功能。 用“→”或“←”键可移动光标所在的位置，用“↑”或“↓”键可对光 标所在位置的数据进行增减修改，用“功能”键确认所修改的数据后，就 可按“↓” 键进行定标。所确定的定标值一定要与所放入仪器的标准液相 一致，绝对不能搞错。 本仪器可提供 5点定标，它们的范围是在 0～199、200～399、400～899、 900～1299 和大于 1300。本仪器至少应确定 2 个定标，如仪器内部不足两 个定标记录，仪器将不能正常工作。在日常使用中可按需要选择 1～5 点重 新定标，重新定标后的值将自动取代原保存在仪器内部的定标值。 取干净且干燥的试管，用各自的玻璃注射器分别从标准液瓶内各抽取 0.5mL 的所对应定标位置的标准液注入试管，对仪器进行正常的定标（早 冻或不冻的结果不能作为正常定标）。测试所抽取标准液的注射器和使用的 试管必须保证不得污染标准液。瓶内的标准液在少于整瓶的 1/3 时，不可 再用于定标。 当定标温度达到强振温度（-6℃）时，仪器自动产生强振，使过冷液 体结冰，这时仍显示样品温度，直到仪器自动找到被测样品所对应的冰点 温度时，液晶屏显示“***定标完成” ，表示本次定标完毕。在按“↑” 键后，测量探头上升到位，接着可根据需要重新选择第二个定标点，将光 标移动到需要定标的位置上，修正屏幕上的数据、再定标。当完成最后一 个定标后，在液晶屏显示“***定标完成”时，按“确认”键保存并退出定 标。如内存只有 300mOsm/kg H2O 和 800mOsm/kg H2O 点定标，则液晶显示为 “-CC--”。“C”符号所在的位置就是仪器所对应的 5 段定标区域内已经有 的定标记录，“-”符号提示在仪器规定的 5 阶段定标区域内该位置定标空 23 白，未曾定标。这时按“↑”就可以返回主菜单了。 删除错误的定标 假如将一个 300mOsm/kg 的标准液误设置为 1300mOsm/kg H2O，并完成 定标的话，仪器就不能正常工作。因为没有 1300mOsm/kg H2O 的标准液进 行重新定标修正，必须删除这个错误的定标值。具体操作是：这个错误的 定标所处的位置是整个定标规定范围的第5阶段上，即1300～2000mOsm/kg H2O 的位置，可以进入定标菜单，将光标放在最高位上，将原来的“0300” 修改为“5300”，也就是最高位上的 0 改为 5（代表需要删除的位置），然 后先按“功能”键，同时按一下“确认”键，就可以将这个错误的定标点 删除了。要删除不同定标段的定标值，只要将第一位（最高位）的 0 修改 为你所要删除的对应定标位置（1～5）即可。 打印定标值 光标在“打印定标值”行上闪烁时，按“确认”键，打印定标值；按 “←”键打印机走纸。 ③测量 开机进入测量菜单后，当仪器设置的预冷温度后就可进行测量。 在试管内加入 0.5mL 的被测样品，将试管口套在测量探头上，根据屏 幕提示按：“↓”键，测量探头下降，当测量探头达到下位时，计时器开始 计时，测量开始。在样品温度接近 0℃时显示样品温度，当样品温度达到 强振温度（-6℃）时开始强振，强振后液晶显示的样品温度迅速从-6℃回 升到样品的冰点温度。在报出测量结果时，测量探头自动上升，如果打印 测量结果，按“功能”键即可。如不打印，则仪器等待进行下一个样品的 测量。 24 注意事项 ①定标液应保存在 4～30℃的温度环境条件下，避免强烈光照，使用 时不要直接打开瓶盖，每瓶标准液单独用各自的注射器适量抽取，并注意 注射器绝对不要互相混用。标准液瓶内的容积在少于整瓶的 1/3 时，不可 用于定标。 ②仪器在使用中应做适当的保养，及时适量添加不冻液，并保持放置 仪器的桌面清洁。桌面上的灰尘、擦拭探头的纸屑如被仪器的散热风机吸 入，将直接影响仪器的散热，导致仪器的损坏。 ③该仪器不用每次使用前校正，如担心仪器的准确度可每次使用前对 标准液进行测定，如超出误差范围外则重新校正。 ④在测量和校正时，试管口要完全套在测量探头上。 2.6 细菌内毒素 2.6.1 细菌内毒素介绍 细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌细胞壁层上的特有结构，内 毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热 原质，作用于体温调节中枢引起发热。 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细 菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物 活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆 菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克 次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性 25 链、核心多糖、类脂A三部分组成。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。 当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式 进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏吸收，不造成 机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。因此， 生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、 透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须 经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰性阴性菌产生的 细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 其检查包括 2 种方法：凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质 法。供试品检测时,可使用其中任何一种方法进行试验。当测的结果有争议 时,以凝胶法结果为准。 对动物细胞培养基的内毒素检测采用凝胶法，此法系通过鲎试剂与内 毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。 2.6.2 细菌内毒素检查中凝胶法所使用的试剂及操作方法 2.6.2.1 试剂介绍 鲎试剂：是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细 胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。目 前国际上销售的鲎试剂有两种，一种称美洲鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate），缩写为 LAL，由美国生产；另一种称东方鲎试剂（Tachypleus Amebocyte Lysate），缩写为 TAL。TAL 与 LAL 有相同的功效。 凝胶法细菌内毒素检查用水（BET 水）：指内毒素含量小于 0.015EU/mL 的灭菌注射用水。 26 细菌内毒素国家标准品：自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复 核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒素国家标准品为基础标定其效价， 用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 2.6.2.2 细菌内毒素检测操作方法 鲎试剂的灵敏度：即鲎试剂在本试验法规定的条件下能检测出的细菌 内毒素标准液或供试品溶液中的最低内毒素浓度（用 Eu/mL 表示），而灵 敏度的测定即为鲎试剂在制备过程中受到各种因素影响，各批鲎试剂与内 毒素形成凝胶反应的活力不一样，必须规定一种标准的内毒素按规定的方 法测定。鲎试剂灵敏度复核的意义在于：(1)考查操作技能；(2)考查实验 条件；(3)验证鲎试剂灵敏度是否准确，鲎试剂在生产、销售、运输、储存 过程中易受诸如温度、光线、时间等外界因素的影响，使促凝活力降低； (4)验证细菌内毒素标准品的效价是否准确。因此为了保证细菌内毒素检查 法的准确可靠性，检验者应对每批新购入的鲎试剂进行灵敏度的复核。 干扰试验：目的是确定出供试品在什么样的有效浓度内进行细菌内毒素 检查时即可以克服干扰因素，又能客观反映其所含内毒素是否符合根值。 所以当初次接触到一个样品时，必须对其做干扰试验，制定其检测方法， 确定其方法的可靠性和适用性。 检查法中的供试品阳性对照：在进行常规细菌内毒素检查时，规定了 阳性对照（PC）、阴性对照（NC）及样品阳性对照（ PPC ）等必备项目， 阳性对照的目的是证明在实验条件下所用鲎试剂灵敏度符合规定，阴性对 照的目的是证明所用的超纯水或 BET 水中不存在可被检验到的内毒素，供 试品阳性对照的目的是证明在试验条件下被检验的供试品溶液不存在抑制 27 因素。 操作如下： 参考内毒素标准品制备 参考内毒素标准：每瓶内毒素单位（EU），每瓶参考内毒素标准加 1mL 鲎试剂用水，用旋转搅拌器间歇搅拌 30min 使其溶解，制成原液，用这一 原液制作合适的系列稀释。原液应保存于冰箱中，用于以后的稀释，但保 存时间不得超过 14 天。用前，用旋转搅拌器强力搅拌至少 3min，每一步 稀释，至少搅拌 30s，然后才能用它稀释下一步。经稀释的参考内毒素不 得贮存待以后使用，因为吸附作用会使其失去活性。 鲎试剂的灵敏度应经过确证 试验中使用的所有容器和用具，都必须进行灭菌，用足够的时间进行 加热处理、破坏这些用具表面上可能存在的外源性内毒素。 内毒素试验的结果是否可靠，还必须从试验使用的各种用具、溶液、 洗涤用品中取样或提取样品，并用适当的方法证明它们对反应没有抑制或 拉强或其它干扰作用。可按下述方法进行抑制试验或增强试验。试验中应 设置阴性对照。如果鲎试剂的原材料、生产方法或处方发生改变时都要重 新进行试验。 鲎试剂灵敏度的确认试验 为了确认鲎试剂标签上的灵敏度。参考内毒素标准作 2 倍系列稀释， 稀释成 2.0λ,1.0λ,0.5λ和 0.25λ。其中λ是鲎试剂标签上的灵敏度 EU/mL。 28 上述 4个稀释度和阴性对照都要重复做 4管。所得结果的几何平均值 的对数应大于或等于 0.5λ，小于或等于 2.0λ。每一批新的鲎试剂，使用 前都必须作标签灵敏度的确认试验。 干扰实验 主要目的是确证检测内毒素的方法是否受样品的干扰。验证试验的特点 是样品浓度保持不变，添加内毒素的浓度逐渐降低。在建立细菌内毒素检 查方法中，验证试验前，要去除样品可能含有的内毒素，以确保建立方法 的准确可靠。 溶液的制备（使用供试品的溶液为未检查出内毒素且不超过 MVD 的溶 液，按鲎试剂灵敏度复核试验进行）： 编号 内毒素浓度/配置内毒素的浓度 稀释用液 稀释倍数 所含内毒素的浓度 平行管数 A 无/供试品溶液 --- --- --- 2 1 2λ 4 2 1λ 4 4 0.5λ 4 B 2λ/供试品溶液 供试品 溶液 8 0.25λ 4 1 2λ 4 2 1λ 4 4 0.5λ 4 C 2λ/检查用水 检查 用水 8 0.25λ 4 D 无/检查用水 --- --- --- 2 注：A 为供试品溶液 B 为干扰试验系列 C 鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D 为阴性对照。 试验有效条件：A、D管均为阴性。C管结果均在鲎试剂灵敏度复核范围 内。 C、B 的反应终点浓度的几何平均值（ES 和 Et）： ES=lg-1（ΣXS/4）、Et=lg-1（ΣXt/4） XS、Xt 为反应终点浓度的对数值（lg）。 29 当ES在 0.5λ～2λ（包括0.5λ、2λ）及Et在 0.5ES～2ES（包括0.5ES、 2ES）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。 若供试品溶液进行不超过 MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试 品溶液进行不超过 MVD 的进一步稀释，再重复干扰试验。 最大有效稀释度（MVD） 确定最大有效稀释倍数（MVD）：最大有效稀释倍数是指在试验中供试 品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素 限值的检测。 公式：MVD=cL/λ L 为供试品的细菌内毒素限值。 c 为供试品溶液的浓度。当 L 以 EU/mL 表示时则 c=1.0mL/mL，当 L 以 EU/mg 表示时则 c=1.0mg/mL，当 L 以 EU/U 表示时则 c=1.0mL/U。（若供试 品为注射用无菌粉末或原料药则 MVD 取 1，可计算供试品的最小的有效稀 释浓度 c=λ/L。） λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度 EU/mL。 实验操作 在准备和进行试验的过程中，必须十分注意，避免使样品受到的细菌污 染。为了定量检测样品中的内毒素含量，常用系列稀释法稀释样品。用几 何稀释法，使每上一步稀释较下一步稀释成为正比关系。试验中应设阴性、 阳性对照和阳性产品对照。 供试品的每一个样品的每一步系列稀释，至少要做重复性 2 管。标准内 毒素的系列稀释应包括至少两个重复管。每一个框架的试管中都必须有一 30 组标准内毒素的系列稀释管。只要每一个框架的环境条件是均一的，一个 框架中可以由几个试管架组成。 ①准备：溶解和稀释必须按标签的说明进行。样品和鲎试剂混合物的 pH，除另有规定外，必须位于 6.0—8.0 之间。样品的 pH 在试验前，可添 加灭菌的无内毒素污染的氢氧化钠、盐酸或适宜的缓冲液调整。 ②操作：取若干 10mm×75mm 试管或单个的试验管。每管加适量的阴性 对照、标准内毒素、样品和阳性产品对照。阳性产品对照由鲎试剂、洗液 或提取液添加 2.0λ浓度的标准内毒素置中，准确记录试管的放置时间、