几种提取黄瓜果实中超氧化物歧化酶方法的比较

第20卷 2008年 第 4期 8月 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 Journal of Heilongjiang August First Land Reclamation Universi — t — y 20(4)：61～63 Aug．2008 文章编号 ：1002—2090(2008)04—0061-03 几种提取黄瓜果实中超氧化物歧化酶方法的比较 王桂华 。唐彦君 ，李辉 (1．黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 1633 19；2．黑龙江八一农垦大学食品学院) 摘 要：为了探索简便的黄瓜果实中超氧化物歧化酶(SOD)的提取方法 ，本研究采用机械法、化学法和微波加热法对黄瓜果实 中 SOD进行提取，并对黄瓜 SOD酶的活性和含量进行测定。试验结果表明：微波加热法与化学法 、机械提取法相比，处理时间 短、步骤简单、酶的比活性高。 关键词：黄瓜；超氧化物歧化酶；微波加热法；提取 中图分类号：0658 文献标识码：A Comparison of Extracting SOD from Cucumber Wang Guihua ，Tang Yanjun2,Li Hui (1．College of Life Science and technology，Heilongjiang August First Land Reclamation University Daqing 1633 19； 2．College of Foodstuff,Heilongjiang August First Land Reclamation University1 ． Abstract：In order to take research on the simple extraction of SOD，mechanical，chemical extraction and microwave heating method were carried out．The activity and content of SDS were detected．The result showed that microwave heating method was a time—short， simple processing and high enzyme activity contrast to chemical method and mechanical method． Key words：Cucumber；superoxide dismutase；microwave heating method；extraction 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，简称 SOD)是一类广泛存在于动物 、植物、微生物中的金属 酶，是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的生物 酶，能催化超氧化物 自由基的歧化反应 ，具有清除超 氧化物阴离子(02-)的能力_1l。因此，SOD能治疗由自 由基引发的疾病，能延缓衰老和提高免疫能力。当黄 瓜果实处于受冷害的临界低温时，SOD活性会受低 温影响而降低 ，而适宜的低温(13℃)可诱导 SOD活 性明显升高，抗冷能力增强【2J。因此，根据黄瓜果实中 SOD的理化性质 ，试验采用几种不同的方法提取黄 瓜果实中超氧化物歧化酶 ，以选择出一种快速、高 效、经济、简单的提取方法。 1 材料与方法 1．1材料与试剂 新鲜黄瓜 ；磷酸缓冲溶液 、异丙醇、乙醇、氯仿 、 丙酮、邻苯三酚。 1．2 试验方法 机械法：用组织捣碎机将黄瓜打碎 ，以 1：1．5按 质量／体积(黄瓜细胞／缓冲溶液)tUJH人磷酸缓冲溶 液(pH7．8)提取 5 h，用 4层纱布过滤 ，收集上清液，得 SOD提取液。 异丙醇法：根据文献[3]方法 ，用组织捣碎机将 黄瓜打碎 ，按每克黄瓜细胞加入 9 mL异丙醇，浸泡 120 min离心除去溶剂，加入 3倍体积 50 mmol·L 磷酸钾缓冲液(pH7．0)，搅拌 120 min，离心 ，收集上 清液，得 SOD提取液。 微波加热法：根据文献[4]方法 ，用组织捣碎机 将黄瓜打碎，取一定质量的黄瓜细胞液分别微波加 热 5、l0、l5、20、25 S后 ，加入等体积去离子水，混匀。 再缓慢的加入 0．25倍体积的 95％乙醇(4℃)和 0．15 收稿 日期 ：2008—07—08 作者简介：一 桂华(1975一)，女 ，讲师，东北农业大学硕士研究生毕业，现主要从事基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 (制药)的教学与科研工作。 维普资讯 http://www.cqvip.com 62 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第 20卷 倍体积氯仿(4℃)搅拌均匀，静置 20 min，收集上清 液，得 SOD提取液。 1．3 SoD的纯化及制取 根据文献[5]方法 ，取机械法和异丙醇法提取的 SOD，加热 60 cI=，10 min，离心去沉渣，收集上清液；用 磷酸调整溶液 pH至 5．0，加人丙酮的量为 1．0％，13 cIC、12 000 r·min 离心，去除大部分杂蛋白，用磷酸调 溶液pH至4．0，在所得上清液中加入 1．2％～1．4％体 积分数的丙酮，使 SOD全部沉淀下来；将沉淀溶解在 少量的缓冲液中，在 13℃环境中透析 10 h。 1．4 相关参数的测定 SOD活性的测定 ：SOD酶活用邻苯三酚 自氧法 测定。SOD酶活性单位定义为：以 1 mL反应液中，每 分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 50％时的酶量为一 个活性单位。用 SPSS 12．0软件对数据进行统计分 析，并用 LSD法进行多重比较。 SOD含量测定 ：采用紫外分光光度法测定蛋白 质浓度。用 SPSS 12．0软件对数据进行统计 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，并 用 LSD法进行多重比较。 2 结果与分析 2．1不同方法提取的SoD活性 龚国强H认为在非冷害低温下(13℃1，黄瓜果实 中SOD活性随着时间的延长逐渐升高，在第4 d后 SOD活性升高最为显著。因此按其方法采用改进的 邻苯三酚自氧化法对所提取的酶液进行活性测定， 结果见表 1。 表 1 不同处理提取 SOD活性值的多重比较 Table 1 Multiple Comparisons on diffrent treatment of SOD activity value 由试验结果得出，微波加热法提取 SOD比其他 两种方法提取SOD的活性要高，尤其是微波加热法 处理 5 S极显著地优于其它方法。微波加热法处理的 时问对 SOD活性有一定的影响，增加微波加热法处 理的时间会增大细胞破碎的程度，随着细胞破碎的 程度可加大对细胞内含物的释放。可是随着处理时 间的增长，会导致部分酶由于温度的升高而失活。 2．2 不同方法提取的 SOD含量 为了进一步考察提取 SOD的最优方法，将不同 方法提取的SOD含量进行测定。结果见表 2。 表2 不同处理提取 SOD含量的多重比较 Table 2 Multiple Comparisons on diffrent treatment of SOD content 结果表明：机械法和微波加热法(25 S)提取的 SOD含量显著的高于异丙醇法和微波加热法(10 s,5 s)。 由于机械法破碎细胞完全，细胞内含物释放的完全， 因此提取的SOD含量最高。 3 讨论与结论 在提取过程中，机械法与异丙醇法使用的试剂 多而且操作过程比较复杂，提取时间长。微波具有穿 透力强、选择性高、加热效率高等特点，因此，微波加 热可导致细胞胞内的极性物质，尤其是水分子吸收 微波能 ，产生大量的热能 ，使胞内的温度迅速上升， 液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形 成孔洞，从而释放胞内产物[61。增加微波加热法处理 的时间会增大细胞破碎的程度，随着细胞破碎的程 度可加大对细胞内含物的释放，然而随着处理时间 的增长，会导致部分酶由于温度的升高而失活。 本文通过机械法、化学法和微波加热法对黄瓜 果实中SOD进行提取，并对黄瓜 SOD酶的活性和含 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期 王桂华等：几种提取黄瓜果实中超氧化物歧化酶方法的比较 63 量进行测定。研究表明：微波加热法与化学法 、机械 法提取相比，处理时间短、步骤简单、酶的比活性高， 是一种快速、高效、经济、简单的提取 SOD的方法。 参考文献： [1]Fridovich I．Superoxide radical aft endogenous toxicant．Ann． Rev[J]．Pharmacol Toxicol 1983，23：239—257． [2]龚国强，于梁．低温对黄瓜果实超氧化物歧化酶 fSOD)的 影n~3 EJ]．园艺学报，1996，23(1)：97—98． [3]吴思方，方尚玲，童振球．啤酒废酵母提取 SOD研究[J]． 食品科学，2004，21(3)：22—24． [4]修志龙 ，王威，陆美卿．微波加热破膜提取猪血超氧化物 歧化酶的研究[J]_中国生化药物杂志，200l，22(3)：139-141． [5]金绍黑．植物超氧化物歧化酶的提取 、修饰制备工艺及其 应用研究[JJ．成都航空职业技术学 院学报 ，2005，(1)： 44-47． [6]刘国诠．生物工程下游技术[M]．北京：化学工业出版社， 2O03． 维普资讯 http://www.cqvip.com