组织固定

1目的 组织固定的目的是保存细胞和组织的成分如同其活着的时候一样并使它们在经历接下来的过程中不发生任何变化，这样为随后的操作步骤及最后的组织观察奠定基础（6）。为达到这个目的，最主要的目的就是抑制组织内部酶对组织的分解作用，如不抑制则组织会因内源酶引起组织的自溶（1 2）；其次就是要沉淀或凝固组织内部的各种成分，如蛋白质、脂肪、糖类、色素等，从而在制片过程中不会被其它试剂破坏（2）；另外就是使组织质地发生改变，例如由于细胞浆本身物理性质为胶体，而固定后则变为凝胶，从而实现组织硬化便于操作（1 2）。 2成分及条件 2.1成分 10%福尔马林（甲醛100ml，蒸馏水900ml（或者分析纯福尔马林稀释10倍），NaH2 PO4 4g，Na2HPO4 6.5g）。在甲醛生产过程中，由于甲醛会面对空气而有可能被氧化生成甲酸和甲醇，所以商业用途的甲醛中总会包含未知量的甲酸和甲醇。对于组织的渗透速率从40%到8%都是基本稳定的（3）。在 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 状况下，正常组织的培养液渗透压约为250~300mOsm/kg。固定液的渗透压对于组织的收缩情况有着重要的影响。固定液高渗透压会导致组织强收缩，在固定液中添加电解质（缓冲用）也会使渗透压上升，而低渗透压会导致细胞膨胀，固定的效果受影响。根据电子显微镜观察的结果，最佳的固定效果是当渗透压浓度约为340mOsm的时候，这样一个偏高渗的水平（6）。事实上，要准确估算组织的收缩情况是很难的，并且当福尔马林浓度控制得当，对于组织收缩性的影响也是非常小的，Jonmarker等06年做过研究（7），用10%福尔马林固定前列腺组织后组织重量比固定前只少8.6%，而组织横泾缩小约4.5%，另根据试验记载（3），当甲醛浓度处在2~20%之间时，每个视野中细胞核（和细胞）数量不会发生几乎没有变化。添加缓冲成分的一个作用就是使固定液的PH值维持在6~8之间从而与组织中液体的PH相一致，并保证不会与固定成分发生反应。 2.2条件 由于甲醛本身对于组织的渗透速率就不高，温度较高时，甲醛渗透的速率能有一定的提高，与蛋白质等生物大分子发生反应的速率也会提高，虽然温度提高会带来组织自溶的风险（6）。实验证明，当固定温度为37℃时，每个单元区域内的细胞核的数量要明显多于4℃时，4℃时细胞间的空间更大（3）。事实上，固定剂渗透组织的情况是可以通过 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 来估计的（6），d = K 根号 t，d是渗透的深度，t是时间，k是每个固定剂的固定效率，代 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 了1小时固定剂弥散的距离（毫米）。福尔马林的固定效率为1mm/h。 3原理 甲醛能迅速渗透组织并且使蛋白质变性，从而抑制组织内部酶的降解作用。它也可以使蛋白质发生交联，从而使组织变硬。但甲醛不会令蛋白质发生沉降（7）,这与其虽然会使蛋白质变性但蛋白质基本构像不会改变有关，例如，戊二醛会引起蛋白质二级结构30%α螺旋发生丢失并使得蛋白质发生不可逆的变性，而甲醛的这种能使蛋白质发生可逆变性的性质也为后面的抗原修复（AR）提供了依据（7）。当甲醛溶于水，会迅速的与水反应形成甲二醇（3），而甲二醇也有可能进一步聚合形成寡聚甲二醇（4）。甲醛的亲电子性使得它能与多种生物学大分子的官能团发生交联反应（5）。例如蛋白质、糖蛋白、核酸、多糖。反应活性最强的点是首要氨基酸，例如赖氨酸、半胱氨酸。以赖氨酸为例（甲醛与蛋白质赖氨酸残基发生反应占所有蛋白质赖氨酸残基比例的40%~60%(7)），蛋白质上的赖氨酸残基的侧链上的氨基会与单体甲醛发生亲核加成反应从而构成构成一个亚氨基与一个羟基，形成甲醛的复合物使蛋白质变性，如果是酶，则因结构或构型发生改变而失去活性或活性减弱，而羟基又可以与另一个蛋白质的氨基酸残基上的的氢离子发生脱水反应形成由-C-N-相连的两个蛋白的交联体，从而实现蛋白质间的交联。或者上述形成的复合物会与水及蛋白质赖氨酸残基上的侧链上的氨基发生反应生成甲二醇（4）,见下图。 而蛋白的其它基团，如亚氨基、氨基、肽键、胍基、羟基、羧基、二级结构SH、苯环等也可能参与其中。 而产生的蛋白交联会将糖原困于其中，或者会与蛋白质形成共价键从而不溶于水从而被保留下来（6）。进而，由于蛋白质的交联或蛋白单体变性导致的酶失活，细胞浆流动性的失去，从而能实现最大程度的保持组织形态与其活着的时候相一致，组织成分及相互关系也没有发生改变。 而对于组织中的其他成分，如脂肪，则会在固定过后的步骤中大量丢失（6），而对于复杂的脂质则固定效果较好（7），从而保证了做IHC检测膜抗原的准确性。怀疑其无法与甲醛或甲醇发生反应或无法被困在原先的位置上。另外对于粘液物质的固定，甲醛效果也一般，据报道，当利用甲醛蒸汽固定后在冷环境中干燥，组织中的粘液物质的固定效果相对最佳。甲醛也会使核酸的物理状态发生改变，但对于核酸，甲醛的固定效果并不是很好，如果在固定液中添加水银或者Na盐则效果会提升。 另外，甲醛穿过细胞膜以及核膜，使膜蛋白发生变性从而便于抗体这种生物大分子不需经膜蛋白转移变进入胞浆和细胞核，改变了抗体进入的方式，变为自由扩散，从而保证抗体更迅速更有可能与抗原结合。 4与抗原修复（AR）的关系 虽然蛋白质变性不会影响正常的组织病理观察，但对于通过免疫酶或免疫荧光等免疫化学技术检测抗原会产生重大影响。为了检测抗原，组织内大分子必须能够被抗体识别（6）。固定后抗原决定簇被隐藏，而甲醛与蛋白质构成的共价键或蛋白交联体间的共价键键能较高，所以进行抗原修复时需要较高能量从而破坏共价键，进而使抗原决定簇重新暴露出来。需要根据福尔马林固定组织的时间来确定合适的抗原修复的时间，抗原修复相对于固定而言时间不足时会导致组织的假阴性。当固定时间长于9个小时的时候，抗原修复的最长时间也不能超过1个小时，最少则不能低于35min（8）。 5与其他组织固定液的比较 有其他组织固定液相比，甲醛最大的优势就在于对于蛋白质的固定，而例如 络酸，对于脂质的固定会比较好。另一种常见的是酒精固定液，利用酒精的脱水作用，使糖原上连接的水分子脱离从而使糖原变性，因而酒精适合于固定糖原。根据这性质上的差异，这两种固定方法接后续的IHC过程得到的效果也是不同的，为了尽可能保存蛋白抗原，所以采用甲醛较好。 事实上，为了各种明确的目的（类似于固定磷脂，固定生物胺）而进行的组织固定，其固定液的成分也颇为复杂。通用的10%福尔马林固定液只能达到如上所述的效果（6）。 参考文献： 1http://wiki.answers.com/Q/What_is_the_principle_behind_tissue_fixation#ixzz22jBmZrJV 2http://ask.bbioo.com/ask/show-12765.html 3 Formaldehyde Fixation CECIL H. FOX, FRANK B. JOHNSON, JOHN WHITING, and PETER P. ROLLER 4 Chapter 16 | Fixation and Tissue Processing Jamie M. Nowacek, BS, HT (ASCP)CM QIHC, PMP Revised and updated by John A. Kiernan, MB, ChB, PhD, DSc 5 Feldman MY: Reactions of nucleic acids and nucleoproteins with formaldehyde. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 13:1, 1973. 6 Fixation and fixatives Anthony S-Y Leong 7 Tissue shrinkage after fixation with formalin injection of prostatectomy specimens. Jonmarker S, Valdman A, Lindberg A, Hellström M, Egevad L. Virchows Arch. 2006 Sep;449(3):297-301. Epub 2006 Aug 15 8 Troubleshooting Automated IHC,Neal Goldstein,William Beaumont Hospital Royal Oak，ML.USA