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常见重组蛋白纯化.pdf

常见重组蛋白纯化

doggystone
2013-07-17 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《常见重组蛋白纯化pdf》,可适用于工程科技领域

常见重组蛋白的纯化韦新桂(Chromatography)北京韦氏博慧色谱科技有限公司wwwwsaccn,weixinguinet前言:近年来随着生物技术的进步特别是基因工程的迅猛发展表达蛋白已经变得很容易相对而言纯化却是一个非常繁杂的工作所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和纯化用的标签融合表达这样纯化相对得比较容易即使如此由于蛋白的多样性纯化依然是比较复杂而专业的工作尤其对于不熟悉纯化的研究者而言它成为一个项目的瓶颈本手册就是把一些相关的材料汇集希望对纯化重组蛋白有所帮助。.常见纯化的标签理想的标签需要有以下的几个特点最好能一步纯化得到纯品对目标蛋白的结构和活性没有影响方便切除标签应用范围广可适用各种表达系统或目标蛋白。但是没有哪个标签是完美的只能根据实际需要去自己筛选下表是部分的标签以及纯化的方案:标签纯化用的填料或配基洗脱方法多聚组氨酸(XHis)螯合镍、铜、钴离子的填料咪唑或降低pH谷胱甘肽硫转酶(GST)键合谷胱甘肽的亲和填料mM还原谷胱甘肽麦芽糖结合蛋白(MBP)淀粉琼脂糖凝胶麦芽糖金黄色葡萄球菌蛋白AIgG琼脂糖凝胶低pHFlagpeptide抗Flag抗体,M,M低pH或EDTA多聚精氨酸(PolyArg)SP琼脂糖凝胶高盐多聚半胱氨酸(PolyCys)活化巯基琼脂糖凝胶DTT多聚苯丙氨酸(PolyPhe)苯基琼脂糖凝胶乙二醇钙调蛋白结合肽钙调蛋白EGTA纤维素结合域纤维素盐酸胍或脲几丁质结合域几丁质巯基乙醇半胱氨酸由于篇幅有限手册只只写多聚组氨酸标签、GST融合蛋白。.组氨酸标签蛋白的纯化HisTag融合蛋白是目前最常见的表达方式而且很成熟它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去(IMAC)纯化。.IMAC(ImmobilizedMetalionaffinitychromatography)是Porathetal年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白年Smithetal发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDAsephadexG作用力更强此前在年他和他的合作者用NiIDAsephadexG亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年年Hochulietal发现带有相连组氨酸的多肽和NiNTA填料作用力更强于普通的肽年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍相对而言不带标签的蛋白纯化就非常困难所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。年Porathetal还发现FeIDAsephadexG可以用于磷酸化蛋白的纯化而后发现GaIDA也有同样的效果这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽应用非常广泛。市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种:螯合金属离子的配基螯合金属离子的价位和标签结合位点IDANTACMAspTED可选择的纯化填料:填料名称配基配基密度载量镍琼脂糖凝胶FFIDA约umolml平均mgml最大mgml镍NTA琼脂糖凝胶FFNTAumolml平均mgml影响IMAC纯化结果的因素:填料的种类:不同填料厂家的填料有差别所以使用过程最好能得到厂家的技术支持因为不同的厂家填料不同此外蛋白纯化个性很强没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化载量高和特异性好本身就是矛盾。填料的配基种类、密度、金属离子种类填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子哪家产品的颜色越深就意味着和蛋白的作用力越强适用范围越广载量也越高纯化的好坏关键看纯化的条件仅有填料的特异性是不够的同样配基密度下IDA填料的亲和力要比NTA的强所以NTA上不能吸附的样品可以选择IDA为配基的填料。螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强而锌和钴离子的弱。因此如果一个蛋白作用力强想得到好的特异性可以选择螯合钴离子它还有一个优点是不怕还原剂特别时候有高浓度的还原剂。相同金属离子IDA的强于NTA。螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。同时镍离子是最常用的如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果因为不同的金属离子有不同的选择性。因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶如果是希望特异性好而且稳定就选择镍NTA琼脂糖凝胶蛋白本身的结构和样品来源IMAC原理已经说明只要是带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白都可以被吸附所以要想得到好的纯化效果必须选择好纯化的条件通常带组氨酸蛋白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍NTA琼脂糖凝胶吸附但是如果标签折叠在蛋白内部不容易暴露这样就难纯化如果镍琼脂糖凝胶都不能吸附可以在样品和平衡缓冲液中加M脲这样蛋白结构相对松散也许能吸附而蛋白不会变性对于本身就是变性的蛋白如果M脲不能吸附改用M盐酸胍溶解样品就可以被吸附因为盐酸胍可以打开脲打不开的结构使得标签能暴露。当然如果有二硫键最好加mMDTT也可以更好解决吸附的问题。此外也可以把标签换到另外一端。缓冲体系pH及盐浓度对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系如TrisHCl等适当提高缓冲液pH可以增加吸附效果同样原理可以降低pH洗脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰平衡缓冲液中需要加M氯化钠而在平衡缓冲液添加吐温或者triton可以降低由于疏水相互作用导致的非特异吸附。表面活性剂及其他添加剂添加一些表面活性剂可以增加蛋白的溶解度降低疏水相互作用这样使纯化的结果更好在实验表明在平衡缓冲液中加的吐温可以使电泳的背景更清晰杂带减少。对一些难溶解的样品也可以加乙醇或者甘油。在变性条件下有时会在样品中添加还原剂如巯基乙醇或者二巯基苏木糖醇它们如果浓度过高或者上样量过大会导致镍离子还原甚至脱落使填料失效如果要在这样的环境下那最好选择螯合价位高的填料如镍NTA琼脂糖凝胶或降低还原剂的浓度通常mM是没问题的。如果一定要选择高浓度的还原剂也可以把镍离子还成钴离子它不怕还原把普通的镍琼脂糖凝胶还成钴离子即可。以下是破碎及提取、纯化操作和常见问题解决方法:破碎方法样品的处理对纯化是很重要的重要的原则是破碎要温和不能使蛋白断裂或者降解否则一些片段同样也带有标签这样增加了纯化的难度。需要注意的问题是超声破碎温度强度时间大肠杆菌的破碎方法:)收集培养发酵液度g离心分钟收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放度冷冻但是最好能保存成小块或者薄片这样好用。))取克菌体加ml破碎缓冲液(pH的mM磷酸缓冲液含MNaClmgml溶菌酶mMPMSFmMMgClunitsmlBenzonase,其中的菌酶mMPMSFunitsmlBenzonase现加)在冰上混合分钟如果pH不在需要用MNaOH一边搅拌一边滴加如果溶菌酶mgml混合时间可以缩短到分钟)把混合菌体在冰水中用超声探头破碎秒种,总共四次,中间间隔要保持分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在,还是用MNaOH一边搅拌一边滴加去调如果菌体的为克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为升,破碎三次,压力为bar)破碎的液度g离心分钟如果要让溶液更澄清可以度g离心分钟这时候可以把上清和沉淀分别留样跑电泳如果只沉淀中有目标蛋白那就用变性条件下去提取。)破碎离心的上清加M咪唑溶液ml使终浓度为mM样品的总体积为ml。过柱子的样品最好过μm的滤膜避免堵柱。.可溶性蛋白的纯化)平衡缓冲液:pH的mM磷酸缓冲液含MNaCl含mM咪唑。)洗脱缓冲液:pH的mM磷酸缓冲液含MNaCl含mM咪唑。)取ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱用ml平衡缓冲液平衡然后取破碎上清ml样品以mlmin上样然后ml管分管收集。)用ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品流速mlminml管收集。)用ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品流速mlminml管收集。)再用ml平衡缓冲液平衡柱子灌满乙醇封闭以备下次使用。)此方法是通用的方法但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果所以优化的办法是洗脱可以用mMmMmMmM分阶段洗脱各洗脱个柱体积这样配合电泳检测得到适合自己的蛋白的条件。)收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度再取有蛋白的部分电泳检测纯度。.常见问题及解决方法)蛋白不溶解或沉淀在柱子上:要留意缓冲液体的pH此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度避免沉淀。)蛋白不吸附:这是最常见的通常的原因有是标签不暴露被折叠在蛋白的结构内可以在变性的条件下去纯化可以选择作用力更强配基密度更高的填料通常镍琼脂糖凝胶作用力最强如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料如镍NTA琼脂糖凝胶填料的好坏可以看填料的颜色颜色越深那配基密度越高作用力也相应要强。样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附所以样品和缓冲液的pH要尽量一致避免沉淀通常再偏碱性条件下吸附更好。)难洗脱:如果穿透中目标蛋白明显减少而洗脱又没有取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白可以用更强的洗脱条件如mM咪唑如果还不能洗脱可以直接用mM咪唑加到M盐酸胍去洗脱。)电泳杂带多:因为这种亲和毕竟特异性要差点原因在蛋白中带组氨酸色氨酸半胱氨酸等很常见特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近这样也会使它们和镍柱的作用力增加因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱此外在咪唑洗脱前增加一步MpH的醋酸缓冲液洗脱在平衡缓冲液中添加吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附这样可以电泳的杂带明显减少但是如果用这样的方法还是杂带多那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签或者因为样品长时间保存导致水解等总之纯化的好坏决定于每一个步骤不仅仅是纯化的问题。还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加mM巯基乙醇避免如果这样的情况下最好是选择镍NTA琼脂糖凝胶因为它在还原剂下更稳定。包涵体蛋白的纯化及复性包涵体破碎、大肠杆菌的破碎方法:1)收集培养发酵液度g离心分钟收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放度冷冻但是最好能保存成小块或者薄片这样好用。2)取克菌体加ml破碎缓冲液(pHmMTrisHClmMEDTAmMNaClTritonXmgml溶菌酶。)在冰上混合分钟。3)把混合菌体在冰水中用超声探头破碎秒种,总共四次,中间间隔要保持分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在,还是用MTris溶液一边搅拌一边滴加去调如果菌体的为克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为升,破碎三次,压力为bar4)破碎的液度g离心分钟如果要让溶液更澄清可以度g离心分钟这时候可以把上清和沉淀分别留样跑电泳如果只沉淀中有目标蛋白那就用变性条件下去提取。5)破碎离心的沉淀用M清洗包涵体再离心得沉淀加(pH的mM磷酸缓冲液含MNaClM脲mM咪唑)。过柱子的样品最好过μm的滤膜避免堵柱。.包涵体蛋白的纯化)平衡缓冲液:pH的mM磷酸缓冲液含MNaClM脲mM咪唑。)洗脱缓冲液:pH的mM磷酸缓冲液含MNaClM脲含mM咪唑。)取ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱用ml平衡缓冲液平衡然后取破碎上清ml样品以mlmin上样然后ml管分管收集。)用ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品流速mlminml管收集。)用ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品流速mlminml管收集。)再用ml平衡缓冲液平衡柱子灌满乙醇封闭以备下次使用。)此方法是通用的方法但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果所以优化的办法是洗脱可以用mMmMmMmM分阶段洗脱各洗脱个柱体积这样配合电泳检测得到适合自己的蛋白的条件。)收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度再取有蛋白的部分电泳检测纯度。)其问题和解决方法可以参考可溶性蛋白的纯化的相关内容。复性十分复杂所以建议参考文献和一些专门的论述。常见问题及解决方法)不溶解或沉淀在柱子上:要留意缓冲液体的pH此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度对于带半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集沉淀所以需要加mM巯基乙醇避免沉淀。)白不吸附:这是最常见的通常的原因有是标签不暴露被折叠在蛋白的结构内可以在变性的条件下去纯化如果用脲变性吸附不好可以改用盐酸胍个人经验是这样通常可以使吸附不上的蛋白得到改善顺利纯化。可以选择作用力更强配基密度更高的填料通常镍琼脂糖凝胶作用力最强如果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料如镍NTA琼脂糖凝胶填料的好坏可以看填料的颜色颜色越深那配基密度越高作用力也相应要强。样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附所以样品和缓冲液的pH要尽量一致避免沉淀通常再偏碱性条件下吸附更好。)难洗脱:如果穿透中目标蛋白明显减少而洗脱又没有取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白可以用更强的洗脱条件如mM咪唑如果还不能洗脱可以直接用mM咪唑加到M盐酸胍去洗脱。)电泳杂带多:因为这种亲和毕竟特异性要差点原因在蛋白中带组氨酸色氨酸半胱氨酸等很常见特别是蛋白折叠会导致几个这样的氨基酸残基临近这样也会使它们和镍柱的作用力增加因此可以用不同浓度的咪唑阶段洗脱此外在咪唑洗脱前增加一步MpH的醋酸缓冲液洗脱在平衡缓冲液中添加吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附这样可以电泳的杂带明显减少但是如果用这样的方法还是杂带多那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签或者因为样品长时间保存导致水解等总之纯化的好坏决定于每一个步骤不仅仅是纯化的问题。还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加mM巯基乙醇避免如果这样的情况下最好是选择镍NTA琼脂糖凝胶因为它在还原剂下更稳定。GST融合蛋白的纯化:大肠杆菌的破碎方法:)收集培养发酵液度g离心分钟收集沉淀的菌体(如果不是马上破碎可以放度冷冻但是最好能保存成小块或者薄片这样好用。)取克菌体加ml破碎缓冲液(pH的mM磷酸缓冲液含MNaClmgml溶菌酶mMPMSFmMMgClunitsmlBenzonase,其中的菌酶mMPMSFunitsmlBenzonase现加)在冰上混合分钟如果pH不在需要用MNaOH一边搅拌一边滴加如果溶菌酶mgml混合时间可以缩短到分钟)把混合菌体在冰水中用超声探头破碎秒种,总共四次,中间间隔要保持分钟冷却破碎液,检测pH,如果不在,还是用MNaOH一边搅拌一边滴加去调如果菌体的为克,可以高压破碎的方法,缓冲液同上,体积为升,破碎三次,压力为bar)破碎的液度g离心分钟如果要让溶液更澄清可以度g离心分钟这时候可以把上清和沉淀分别留样跑电泳如果只沉淀中有目标蛋白那就用变性条件下去提取。)破碎离心的上清加加毫升平衡缓冲液。过柱子的样品最好过μm的滤膜避免堵柱。6)可溶性蛋白的纯化)平衡缓冲液:mMTrisHCl缓冲液pH配制:MTris溶液ml加M盐酸mlgNaCl加水至ml。)洗脱缓冲液:mMTrisHCl缓冲液pH配制:MTris溶液mlg还原型谷胱甘肽然后用M盐酸调pH到加水至ml。(还原型谷胱甘肽容易氧化所以这个缓冲液最好现配现用别一次配太多免得浪费)。)取mlGST琼脂糖凝胶FF预装柱用ml平衡缓冲液平衡然后取破碎上清ml样品以mlmin上样然后ml管分管收集。)用ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品流速mlminml管收集。)用ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品流速mlminml管收集。)再用ml平衡缓冲液平衡柱子灌满乙醇封闭以备下次使用。)收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度再取有蛋白的部分电泳检测纯度。常见问题及注意事项)蛋白不溶解或沉淀在柱子上:要留意缓冲液体的pH此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度避免沉淀。)蛋白不吸附:这是最常见的通常的原因有是GST标签没活性因为GST融合蛋白亲和纯化完全依赖于GST部分的活性所以可以在变性的条件下没办法去纯化破碎条件控制不好或者保存不得当都会导致GST部分的活性失活可以在样品和缓冲液中加mMDTT(二巯基苏木糖醇)延长填料和样品的重用时间如果都不行那就重新破碎再纯化试试。可以换配基密度更高的填料通常GST琼脂糖凝胶偶联选择的是个碳原子的手臂所以通常不会因为填料原因不吸附但是有的公司填料的如果手臂过短就会导致一些蛋白挂不上。那可以换一家填料试试。)样品的pH过低或者沉淀导致不能吸附所以样品和缓冲液的pH要尽量一致避免沉淀通常再偏碱性条件下吸附更好。)如果穿透中目标蛋白明显减少而洗脱又没有取点填料加电泳缓冲液煮后离心跑电泳还是有目标蛋白那一定要留意洗脱缓冲液的pH如果偏酸就洗不下蛋白。实在没办法就得选择M盐酸胍或MNaOH洗个柱体积。)杂带多:GST融合蛋白的表达系统很容易表达到GST部分就终止所以KD左右的杂带是很常见的那可以选择用不同浓度的还原谷胱甘肽去做阶段洗脱如果还是分不开那也许就得选择离子交换或者凝胶过滤等别的分离手段。提高平衡缓冲液中的盐浓度可以降低因为离子作用带来的非特异吸附。在平衡缓冲液中添加吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附这些措施都可以电泳的杂带明显减少但是如果用这样的方法还是杂带多那就地回头去看看破碎的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片段带标签或者因为样品长时间保存导致水解等总之纯化的好坏决定于每一个步骤不仅仅是纯化的问题。还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加而由于疏水相互作用或者因为离子作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善对于因为形成聚合体的可以在缓冲液和样品中加mM巯基乙醇避免。如有错误欢迎指正。

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