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脂质体转染步骤与注意事项.doc.doc

脂质体转染步骤与注意事项.doc

漂漂康
2013-07-02 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《脂质体转染步骤与注意事项.docdoc》,可适用于领域

Lipofectamine转染试剂转染步骤(孔板孔板):一:瞬时转染(贴壁细胞)转染前一天胰酶消化细胞并计数细胞铺板在μlml含血清不含抗生素的正常生长的培养基中(每孔××胞)。使其在转染日能达到%的融合。对于每孔细胞使用ulul无血清培养基(如OPTIMEMI培养基)稀释ugDNAugDNA轻轻混匀。使用前将Lipofectamine转染试剂轻轻混匀每孔细胞用ulul无血清培养基(如OPTIMEMI培养基)稀释ululLipofectamine转染试剂轻轻混匀,室温孵育分钟。NOTE:Lipofectamine稀释后在分钟后同稀释的DNA混合(<分钟)。长时间孵育会降低活性若使用DMEM培养基稀释则需在分钟内同稀释的DNA混合。混合稀释的DNA(第二步)和稀释的Lipofectamine(第三步),此时总体积是ulul。轻轻混匀,室温放置分钟以使DNALipofectamine复合物形成。溶液可能会比较浑浊,但这不影响转染效率DNALipofectamine复合物室温放置小时都比较稳定(optional)将孔板中的旧营养液吸出用无血清培养基清洗两次。加入mlml无血清配养基。逐滴加入ulul脂质体DNA混合物到每孔中(从培养孔一边到另一边)边加边前后来回摇动培养板轻轻混匀。在℃%CO中孵育小时。无需去掉复合物或更换培养基。或者在小时后更换培养生长基也不会降低转染活性。在细胞中加入复合物小时后荧光镜下观察转染效率,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色检测各项指标。这依赖于细胞类型和启动子活性。二:稳定转染(贴壁细胞):同瞬时转染:转染h后施加筛选压力改用含G的培养基培养。在G筛选浓度下持续培养天后挑出单克隆扩大培养期间每天换液一次Invitrogen公司推荐的贴壁细胞的稳定转染:转染后小时将细胞以≥:的比例传代至新鲜培养基中次日加入选择性培养基。:检测各项指标转染注意事项::优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染所用溶液滤过灭菌以及随后的使用应在无菌条件下这是细胞惯常的做法。但是脂质体以及脂质体DNA混合物无需滤过除菌。:预备脂质体DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体DNA与被转染细胞共孵育的过程中血清又是培养基的一部分。:在转染之前更换培养基可提高转染效率但所用培养基必须℃预温。:脂质体DNA混合物应当逐滴加入尽可能保持一致从培养皿一边到另一边边加入边轻摇培养皿以确保均匀分布和避免局部高浓度。

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